重组木瓜花叶病毒外壳蛋白及其在流感疫苗中的应用的制作方法
【专利摘要】含有一种或多种抗原肽的重组木瓜花叶病毒(PapMV)外壳蛋白，其制备病毒样颗粒(VLPs)的用途及VLP在流感疫苗中的用途，所述抗原肽源自流感病毒抗原，如M2e抗原，其在外壳蛋白N-末端13个氨基酸的推测随机卷曲内的位置融合。
【专利说明】重组木瓜花叶病毒外壳蛋白及其在流感疫苗中的应用 发明领域
[0001] 本发明涉及免疫原性制剂的领域，并且特别地涉及含有重组木瓜花叶病毒外壳蛋 白的制剂，用于诱导针对流感病毒的免疫反应。
[0002] 发明背景
[0003] W下专利和专利申请描述了木瓜花叶病毒（PapMV)病毒样颗粒（VL巧作为免疫增 强剂和佐剂的能力。
[0004] 美国专利No. 7, 641，896、加拿大专利申请No. 2, 434, 000和国际专利申请No. PCT/ CA03/00985(W02004/004761)描述了 PapMV或来源于PapMV外壳蛋白的VLP用于在动物中 加强免疫反应的用途。还描述了 PapMV与免疫原的融合。
[0005] 国际专利申请 No. PCT/CA2007/002069 (W02008/058396)描述 了基于 PapMV 和 PapMV VLP的流感疫苗。所述疫苗包含与一种或更多种流感抗原联合或融合的PapMV或 化pMV化P。
[0006] 国际专利申请 No. PCT/CA2007/001904 (W02008/058369)描述了基于 PapMV 的免疫 原性亲和-缀合抗原系统。该申请描述了 PapMV外壳蛋白与能够结合目标抗原的多种亲和 肤的融合体，其中，所述亲和肤通过化学方法或基因融合方法与外壳蛋白连接。
[0007] 国际专利申请 No. PCT/CA2008/000154(W02008/089569)描述 了基于 PapMV 的对抗 伤寒沙口氏菌化ty地i)和其他肠道菌病原体的疫苗。描述了 PapMV外壳蛋白与一种或多 种肠杆菌抗原的融合体。
[0008] 国际专利申请 No. PCT/CA2009/00636(W02010/012069)描述了基于 PapMV 的多价 疫苗，包括PapMV或VLP与市售流感疫苗的组合。
[0009] 其它出版物已描述了 PapMV VLP引起体液和细胞免疫反应的能力值enis 等，2007, Virology, 363:59 - 68 ;Denis 等，2008, Vaccine, 26:3395-3403 ;Leclerc 等，2007, J Virol.，81:1319-26, W及 Lacasse 等，2008, J. Virol.，2008 ;82:785-94)。
[0010] 已描述了 PapMV外壳蛋白的N-端突变体及其在PapMV-宿主互作中的作 用(Ikegami, "Papaya Mosaic Potexvirus as an Expression Vector for Foreign P巧tides, "M. Sc. Thesis, 1995,加拿大国家图书馆，渥太华）。突变包括野生型序列的3 位的赖氨酸替换为精氨酸保守替换，3位下游的18位氨基酸的缺失，W及作为N-端增加 和野生型N-端序列替换的11位氨基酸的框内（in-化ame)插入。所有H个突变可W在 C. globosa上产生局部病变，并能影响系统性宿主木瓜（C. papaya)，表明所述突变可组装 并可系统性地移动。
[0011] 已经研究了 HA11肤与PapMV外壳蛋白的几个推测的表面暴露位点的融合巧ioux 等，2012,化oS 0肥，7 (2)，631925)。该肤在外壳蛋白的12和187位的融合导致融合蛋白能 够自我组装成VLP。含有所述肤与外壳蛋白的12位的融合的VLP是稳定的，且能诱导针对 HA11肤的免疫反应。
[0012] 提供该背景信息的目的是，为了告知本 申请人:认为的可与本发明相关的信息。既 未必旨在承认也不应解释为，任何W上信息构成针对本发明的现有技术。
[001引发明概述
[0014] 本发明的目的在于提供重组木瓜花叶病毒外壳蛋白及其在诱导对象针对流 感病毒的免疫反应中的应用。根据本发明的一个方面，提供一种含有肤抗原的融合蛋 白，所述肤抗原源自流感M2e肤，其融合至木瓜花叶病毒（PapMV)外壳蛋白的SEQ ID NO: 1的6-12位中任一氨基酸所对应的氨基酸之后，其中，所述融合蛋白可自我组装成 病毒样颗粒（VLP)，并且，其中肤抗原长度为20个或更少的氨基酸，且含有一般序列： V-X1-T-X2-X3-X4-X5[SEQ ID N0:96]，其中 XI 为 E 或 D ;X2 为 P 或 L ;X3 为 T 或 I ;X4 为 R 或K，且X5为N、S或K。
[0015] 根据本发明的另一方面，提供含有所述融合蛋白的病毒样颗粒（VLP)。
[0016] 根据本发明的另一方面，提供含有所述VLP W及药学可接受载体的药物组合物。
[0017] 根据本发明的另一方面，提供一种诱导对象针对流感病毒的免疫反应的方法，其 包括向对象给予有效量的VLP。
[0018] 根据本发明的另一方面，提供一种降低对象发生流感的风险的方法，其包括向对 象给予有效量的VLP。
[0019] 根据本发明的另一方面，提供一种给对象免疫W对抗流感病毒感染的方法，其包 括向对象给予有效量的VLP。
[0020] 根据本发明的另一方面，提供一种含有上述融合蛋白的病毒样颗粒（VLP)，用于在 有需要的对象中诱导针对流感病毒的免疫反应。
[0021] 根据本发明的另一方面，提供一种含有所述融合蛋白的病毒样颗粒（VL巧在有需 要的对象中诱导针对流感病毒的免疫反应的用途。
[0022] 根据本发明的另一方面，提供一种含有所述融合蛋白的病毒样颗粒（VL巧在制备 诱导对象针对流感病毒免疫反应的药物中的用途。
[0023] 根据本发明的另一方面，提供一种含有所述融合蛋白的病毒样颗粒（VLP)，用于降 低对象发生流感的风险。
[0024] 根据本发明的另一方面，提供一种含有所述融合蛋白的病毒样颗粒（VL巧在降低 对象发生流感的风险中的用途。
[0025] 根据本发明的另一方面，提供一种含有所述融合蛋白的病毒样颗粒（VL巧在制备 降低对象发生流感风险的药物中的用途。
[0026] 根据本发明的另一方面，提供一种含有所述融合蛋白的病毒样颗粒（VLP)，用于给 对象免疫W对抗流感病毒的感染。
[0027] 根据本发明的另一方面，提供一种含有所述融合蛋白的病毒样颗粒（VL巧在给对 象免疫W对抗流感病毒的感染中的用途。
[0028] 根据本发明的另一方面，提供一种含有所述融合蛋白的病毒样颗粒（VL巧在制备 给对象免疫W对抗流感病毒感染的药物中的用途。
[0029] 根据本发明的另一方面，提供一种含有上述VLP W及使用说明书的药物试剂盒。
[0030] 根据本发明的另一方面，提供一种含有一或多种肤抗原的融合蛋白，所述一或多 种肤抗原融合至木瓜花叶病毒（PapMV)外壳蛋白的在SEQ ID NO: 1中6-12位、185-192位 W及197-214位中任一氨基酸所对应的氨基酸之后，其中所述融合蛋白能够自我组装成病 毒样颗粒（VLP)，且其中肤抗原长度为20个或更少的氨基酸，并且其中VLP在至少25C的 温度下是稳定的。
[0031] 根据本发明的另一方面，提供一种能够加强对象针对肤抗原的免疫反应的融合肤 抗原的病毒样颗粒（VL巧鉴定方法，其包括如下步骤；提供含有与肤抗原融合的木瓜花叶 病毒（PapMV)外壳蛋白的VLP，并确定VLP在至少25C温度下的稳定性，其中，在至少25C 温度下的稳定性是VLP能加强针对肤抗原的免疫反应的指示。
[0032] 附图简述
[0033] 本发明的该些和其它特征将从参照附图的W下详述中变得更明显。
[0034] 图1示出了（A)野生型PapMV外壳蛋白的氨基酸序列（SEQ ID NO ;1);炬）野生型 PapMV外壳蛋白的核巧酸序列（SEQ ID N0;2);似修饰的PapMV外壳蛋白CPAN5的氨基 酸序列（SEQ ID N0;4);和做修饰的PapMV外壳蛋白PapMV CPsm的氨基酸序列（SEQ ID NO ：5) 〇
[00巧]图2示出了实施例部分所描述的重组PapMV外壳蛋白的核酸和氨基酸序列，相应 抗原肤的插入序列用黑体和下划线标出：(A) PapMV NP-8的核酸和氨基酸序列[分别为SEQ ID NO: 72和73];炬)PapMV NP-183的核酸和氨基酸序列[分别为SEQ ID NO: 74和75]; (〇口39]\^^-(：的核酸和氨基酸序列[分别为569 10^:76和77];值)？39]\^1〇〇96-8的 核酸和氨基酸序列[分别为569 10^:78和79];巧)？391￥1〇〇96-183的核酸和氨基酸 序列[分别为SEQ ID N0:80和81] ; (F)PapMV Loop6-C的核酸和氨基酸序列[分别为SEQ ID NO:82和83];似PapMV 3NP-C的核酸和氨基酸序列[分别为SEQ ID NO:84和85];化） PapMV NP-8/183的核酸和氨基酸序列[分别为SEQ ID N0:86和87] ;(I)PapMV NP-8/C的 核酸和氨基酸序列[分别为SEQ ID NO:88和89] ;(J)PapMV NP-183/C的核酸和氨基酸序 列[分别为SEQ ID NO:90和91];化)PapMV 3NP-8的核酸和氨基酸序列[分别为SEQ ID N0:92 和 93]，W及（L)PapMV 3NP-8/183/C(PapMV H个 NP)[分别为 SEQ ID N0:6 和 94]。 [003引图3示出了实施例1所述的PapMV外壳蛋白-M2e肤融合体的氨基酸序列：(A) #1 构建体[SEQ ID NO: 23];炬)#2 构建体[SEQ ID NO: 24];似 #3 构建体[SEQ ID NO: 2引； 值)#4 构建体[SEQ ID NO:26];似#5 构建体[SEQ ID NO:27] W及（巧#6 构建体[SEQ ID N0:2引。插入的M2e肤序列用黑体表示。
[0037] 图4示出了 PapMV外壳蛋白（CP)的二级结构预测（参考Lecours 等，2006，阳口，47:273-80)，化〇11又等（2012，化〇5 0肥，7(2)，631925)表明了齡11肤序列插 入到PapMV CP氨基酸序列（SEQ ID NO:4)中的位置。
[003引图5示出了实施例1中所述的构建体中，与PapMV外壳蛋白融合的M2e肤的位置 和序列（插入序列用黑体和下划线表示）。
[0039] 图6示出了通过将Sypro-化ange结合到疏水性残基，观察到的实施例1中 PapMV-M2e构建体的变性。
[0040] 图7示出了图5中的热稳定性构建体炸1、2、3、4、5、6、9和10)的透射电子显微图。
[0041] 图8示出了实施例1中含有PapMV-M2e构建体的VLP的免疫原性评价结果。BALB/ C小鼠，每组5只，用VLP免疫两次（第1天和第14天）。每次免疫的14天后收获血样，通 过化ISA测定体液免疫反应。A)在第14天和第28天的抗-M2e IgG总滴度，B)在第14天 和第 28 天的抗-M2e IgG2a 总滴度。***p<0. 001，**p<0. 01，*p<0. 1。
[004引图9示出了（A)融合伤寒沙口氏菌化*7地^环6肤位点处的PapMV CP氨基 酸序列；炬）重组PapMV CP融合蛋白的SDS-PAGE分析；蛋白PapMV-loop-6-8诱导之前 (泳道1)和表达之后（泳道2)的细菌裂解产物；泳道3 ;纯化的PapMV-loop-6-8 ;蛋白 PapMV-loop-6-183诱导之前（泳道4)和表达之后（泳道5)的细菌裂解产物；泳道6: 纯化的PapMV-loop-6-183 ;蛋白PapMV-loop-6-C诱导之前（泳道7)和表达之后（泳 道8)的细菌裂解产物；W及泳道9 ;纯化的PapMV-loop-6-C ; (C)含有PapMV loop-6-8、 PapMV-loop-6-183 和 PapMV-loop-6-C 的 VLP 的电子显微图，W 及值）含有 PapMV loop-6-8、PapMV-loop-6-183 和 PapMV-loop-6-C 的 VLP 的动态光散射值LS)图。
[004引 图10示出了通过ELISA测定的，用于说明针对PapMV SM(或WT)、PapMV loop-6-8 (loop6_8)、PapMV-loop-6-183(loop6-183)和 PapMV-loop-6-C(loop6-C)的体液 免疫反应的数据；总的IgG(A);指向PapMV平台的IgG2a炬）；总的IgG(C)和指向环6肤的 IgG2a值）。
[0044] 图11示出了（A)融合NP肤位点的PapMV CP氨基酸序列；炬)SDS-PAGE显示了融 合至NP CTL表位的PapMV蛋白和VLP的表达；（C)含有PapMV NP-8、PapMV NP-183和PapMV NP-C 的 VLP 的电子显微图，W及值)PapMV NP-8、PapMV NP-183 和 PapMV NP-C VLP W及盘 (disc)的动态光散射值LS)。
[004引图12示出了 ELISPOT分析结果，展示了用含有融合至流感NPw_i日日肤的PapMV CP 的PapMV VLP和盘免疫小鼠后的IFN-y的分泌，（A)含有PapMV NP-12、PapMV NP-187、 PapMV NP-C 或 PapMV CP 的 VLP (与所有组比较，***p《0. 001);炬）含有 PapMV NP-12 或 PapMV CP的VLP和盘（与所有组比较，***p《0. 001)，W及（C)含有与戊二酵佑lut)交 联或不交联的 PapMV NP-12、PapMV NP-C 或 PapMV CP 的 VLP(*p《0. 05 and**p《0. 01)。 [004引 图13示出了（A) NPw_i日日肤融合位置处的PapMV CP氨基酸序列；炬)SDS-PAGE显 示了携带多拷贝的NPw_i55肤的PapMV蛋白和VLP的表达，W及似PapMV VLPs 3NP-C、 NP-8/183、NP-8/C、NP-8/C 和H个 NP 的动态光散射值LS)。
[0047] 图14描述了 PapMV CP与用PapMV VLP免疫过的小鼠血清杂交产生的27个重叠 肤的微阵列分析结果：在肤1的相对英光强度的位置标出临界值，因为其是已知被表面暴 露的。
[0048] 图15示出了经化学修饰的PapMV VLP的电子显微图和动态光散射分析结果，表明 用DEPC或邸C处理VLP不会保持破坏它们的四级结构，如电子显微（A)和动态光散射所示 炬)。
[0049] 图16示出了野生型PapMV外壳蛋白的氨基酸序列[SEQ ID N0:1]，其中C-末端和 N-末端涉及预测的随机卷曲的氨基酸残基用黑体和下划线标出。
[0050] 图17示出了含有与多拷贝流感NPi47_i55肤融合的PapMV CP的PapMV VLP和盘的 ELI SPOT分析结果。
[005。 图18示出了描述通过动态光散射测定的含有与流感NPw_i55肤融合的PapMV CP 的VLP结构改变图：(A)含有重组PapMV CP NPw_i55融合体的VLP与没有融合体的PapMV VLP相比，在低于小鼠体温的温度下表现出PapMV NP-187和NP-C VLP的聚集，做交联的 PapMV NP-C VLP显示了高温稳定性；W及（C)含有经戊二酵交联或不交联的重组PapMV CP NPw_iw肤的VLP进行膜蛋白酶裂解的结果。
[005引图19示出了消化了的含有经邸C化学修饰的肤的MS/MS谱图；含有修饰物的区域 为V16至K30 (A)，M122至K137炬），W及G199至R221似。下划线的产物离子含有EDC修 饰物。
[005引图20示出了消化了的含有经DEPC化学修饰的肤的MS/MS谱图；含有修饰物的区 域为M122至K137 (A)，W及G199至R221炬）。B中的DEPC修饰物不能精确定位，因此，在两 个苏氨酸中的任一个位置。下划线的产物离子含有DEPC修饰物。
[0054] 发明详述
[0055] 本发明涉及含有在外壳蛋白（CP)"表面卷曲"区域内融合的一或多个抗原肤的重 组PapMV外壳蛋白，具体地，在含有野生型CP的N-末端13个氨基酸的预测随机卷曲内（SEQ ID N0:1 ;见图16)。含有融合的抗原肤的重组PapMV CP能自我组装成病毒样颗粒（VLP)。
[0056] 在某些实施方案中，一或多个抗原源自流感病毒，优选源自M2e肤，并且在SEQ ID NO: 1的6-12位氨基酸中任一氨基酸之后，或其对应的位置，如SEQ ID NO:4的1-8位氨基 酸中任一氨基酸之后，插入到PapMV CP中。该些重组外壳蛋白制备的病毒样颗粒（VLPs) 可用于诱导针对流感病毒的保护性免疫反应。因此，一些实施方案涉及该些VLP在诱导哺 乳动物，如人类针对流感病毒的保护性免疫反应中的应用。在某些实施方案中，其包括VLP 可用作流感疫苗。
[0057] 本发明的某些实施方案涉及含有抗原肤融合体的重组PapMV CP蛋白，所述抗 原肤源自流感病毒，如M2e肤，其融合至如SEQ ID N0:1所示的PapMV CP序列的6、7或 10位中任一氨基酸的对应位置之后，例如，如SEQ ID N0:4所示的PapMV CP序列的2、 3或6位氨基酸之后。在一些实施方案中，所述抗原肤为M2e衍生肤，其含有一般序列： V-X1-T-X2-X3-X4-X5[SEQ ID ^:96]，其中《1为￡或0;《2为？或1^;《3为1'或1;《4为1? 或K，且X5为N、S或K。如本申请所示，含有在如SEQ ID NO: 1所示的PapMV CP序列的6、 7或10位中任一氨基酸的对应位置之后融合M2e衍生肤（含有如SEQ ID NO:96所示的一 般序列）的PapMV CP的VLP，能够通过单次免疫提供针对流感病毒的保护性免疫反应。
[0058] 某些实施方案包括，重组PapMV CP还可进一步包含在CP的二级表面卷曲区域和 /或C-末端的融合的一个或多个抗原肤。
[0059] 如本申请所述，在一些实施方案中，可基于VLP的热稳定性预计含有重组CP的VLP 引发针对融合肤的有效免疫反应的能力。因此，在某些实施方案中，所选择的含有重组CP 的VLP，在至少3(TC的温度下是稳定的。
[0060] 定义
[0061] 除非另有说明，否则本文中使用的所有技术术语和科学术语具有本发明所属领域 普通技术人员所通常理解的含义。
[0062] 本申请使用的术语"约"是指给定值的约+/-10%变化。应理解，该样的变化常常 包括在本文所提供的任何给定值中，不论有没有特别指出。
[0063] 本申请使用的术语"免疫原性"是指物质在动物中诱发可检测的免疫反应的能力。
[0064] 本申请使用的术语"免疫反应"是指动物免疫系统响应物质（如化合物、分子、材 料等）给予时反应性的改变，并可能涉及抗体产生、诱发细胞介导的免疫、补体激活、免疫 耐受性的发展或其组合。
[0065] 本申请使用的术语"疫苗接种"是指为产生有益免疫反应，向对象给予疫苗。疫 苗接种可具有预防效果、治疗效果或其组合。依据待处理的对象，使用各种方法完成疫苗 接种，包括但不限于肠胃外给药，如腹腔内注射（i.p.)、静脉内注射（i.v.)或肌肉内注射 (i. m.); 口服给药；鼻腔给药；皮内给药；经皮给药和浸泡。
[0066] 本申请使用的术语"疫苗"是指在能够产生有益免疫反应的组合物。
[0067] 本申请使用的"天然产生的"（如用于指对象）是指对象可在自然中发现的事实。 例如，可分离自天然来源并且未在实验室中被人有意地改造的生物体（包括病毒）或存在 于生物体中的多肤或多核巧酸序列是天然的。
[0068] 本申请使用的术语"多肤"或"肤"意指一种分子，其至少有两个通过肤键连接的 氨基酸，例如至少4个氨基酸。
[0069] 本申请使用的术语"病毒样颗粒"是指自我组装颗粒，其具有病毒粒子相近 的物理性质。VLP可含有或不含有核酸。VLP通常是可W复制的。
[0070] 本申请使用的术语"盘"（disc)是指PapMV外壳蛋白的多聚体形式，其 含有约18至约22个亚单位，并且分子量为约400kDa至约SOOkDa) (Tremblay 等，2006,阳BS，273:14-25)。与不具有明确结构的非特定聚合物（aggregate)相比，盘大体 上表现为球形结构，通过DLS测量的直径约为40皿或更小。
[0071] 本申请使用的术语"抗原"是指一个分子、多个分子、分子的一个部分或多个部分， 或分子的组合，直至包括整个细胞和组织，其能单独诱导或与佐剂共同诱导对象产生免疫 反应。免疫原/抗原可含有一个表位或可含有多个表位。因此，该术语包括肤、碳水化合 物、蛋白质、核酸和各种微生物（整体或部分），包括病毒、细菌和寄生虫。半抗原也可被认 为是包含在本申请使用的术语"抗原"内。
[0072] 本申请使用的术语"对象"或"患者"是指有接种疫苗或治疗需要的动物。
[0073] 本文中使用的术语"动物"是既指人也指非人动物，包括但不限于哺乳动物、鸟和 鱼，并且包括家畜、农场动物、动物园动物、实验室动物和野生动物，例如牛、猪、马、山羊、绵 羊或其他有蹄动物、狗、猫、鸡、鸭、非人灵长类、豚鼠、兔、雪貂、大鼠、仓鼠和小鼠。
[0074] 本申请中关于核酸或氨基酸序列使用的术语"基本相同"是指，当最佳比对（例 女口，使用下述方法）时，核酸或氨基酸序列与限定的第二核酸或氨基酸序列（或"参考序 列"）共有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至 少97%、至少98%或至少99%的序列同一性。"基本的同一性"可用于指序列（例如全长 序列、功能性结构域、编码和/或调控序列、启动子和基因组序列）的多种类型和长度。两 条氨基酸或核酸序列之间的百分比同一性可W按本领域技术人员技术中的多种方式来确 定，例如，使用可公开获得的计算机软件，例如Smith Waterman Alignment (Smith, T.F.和 M.S.Waterman(1981)J Mol Bioll47 ;195-7) ;"BestFit" (Smith 和 Waterman, Advances in Applied Mathematics，482-489(1981))，合并到 GeneMatcher Plus?, Schwarz 和 Dayhof(1979)Atlas of Protein Sequence 和 Structure, Dayhof，M.O.编，第 353-358 页 中；BLAST 程序（基本局部比对检索工具（Altschul，S. F.，W. Gish, et al. (1990)J Mol Biol215 ;403-10)及其变体，包括 BLAST-2、BLAST-P、BLAST-N、BLAST-X、WU-BLAST-2、 ALIGN、ALIGN-2、化USTAL和Megali即值NASTAR)软件。此外，本领域技术人员可确定用于 测量比对的合适参数，包括在待比较序列长度上实现最大比对所需的算法。一般来说，对于 氨基酸序列，比较序列的长度为至少10个氨基酸。本领域技术人员应理解，实际长度取决 于待比较序列的总长度，并且可W是至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60 个、至少至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少110个、至少120个、至少130 个、至少140个、至少150个或至少200个氨基酸，或者其可W是全长的氨基酸序列。对于 核酸，比较序列的长度一般是至少25个核巧酸，但可W是至少50个、至少100个、至少125 个、至少150个、至少200个、至少250个、至少300个、至少350个、至少400个、至少450 个、至少500个、至少550个或至少600个核巧酸，或者其可W是全长的核酸序列。
[007引本申请使用的术语"多数"是指多于一个，例如，两个或更多，立个或更多，四个或 更多等。
[0076] 当在本申请中术语"包含"与"一"或"一个"一起使用时可W表示"一"，但其也符 合"一或更多"、"至少一"W及"一或多于一"的含义。
[0077] 本申请使用的术语"包含"、"具有"、"包括"或"含有"及其语法变体是包括性的或 开放性的，并且不排除另外的、未引用的元件或方法步骤。当本申请术语"基本由……组成" 与组合物、用途或方法一起使用时，表示还存在其它元件和/或方法步骤，但其对所述的组 合物、方法或用途没有实质性作用。当本申请术语"由……组成"与组合物、用途或方法一 起使用时，排除了存在其他元件和/或步骤。本申请中W包含某些元件和/或步骤描述的 组合物、用途或方法，在某些实施方案中，也可基本由那些元件和/或步骤组成，且在其它 实施方案中，由那些元件和/或步骤组成，不论该些实施方案有没有特别指出。
[0078] 包括了本文所讨论的可针对本发明的任何方法、用途或组合物实施的任何实施方 案，并且反之亦然。此外，本发明的组合物和试剂盒可用于实现本发明的方法和用途。
[0079] 重组PapMV外壳蛋白
[0080] 根据本发明，重组PapMV外壳蛋白（CP)包含一个或多个源自抗原的抗原肤，所述 抗原肤在CP的N-末端表面卷曲区域内的某个位点与PapMV CP融合。
[0081] 在一些实施方案中，重组CP还可包含多个抗原肤（即两个或更多），并且多个肤可 在N-末端表面卷曲区域内融合，或者它们各自在不同的表面卷曲区域内和/或在C-末端 融合。
[0082] PapMV外壳蛋白
[0083] 根据本发明，用于制备重组PapMV CP的PapMV外壳蛋白可W是完整的PapMV外 壳蛋白或其一部分，或者其可W是野生型PaPMV外壳蛋白的经遗传修饰形式，例如，包含一 个或更多个氨基酸缺失、插入、替换等，前提是所述外壳蛋白保留自组装成VLP的能力。野 生型PapMV外壳（或衣壳）蛋白的氨基酸序列在本领域中是已知的（参见Sit等，1989， J. Gen. Virol.，70 ;2325-2331，和 GenBank 登录号 NP_0443：M. 1)，并且在本文中提供为 SEQ ID NO ;1(参见图1A)。PapMV CP的核巧酸序列在本领域中也是已知的（参见，Sit等， ibid.，和GenBank登录号NC_001748巧889-6536位核巧酸））并且在本文中提供为SEQ ID N0;2(参见图IB)。
[0084] 如上所述，用于制备重组PapMV CP的PapMV CP氨基酸序列不需要精确对应于亲 本（野生型）序列，即，其可W是"突变序列"。例如，PapMV CP可通过一个或更多个氨基酸 残基的替换、插入或缺失来突变，使得该位点的残基不对应于亲本（参考）序列。但是，本 领域技术人员应理解，该样的突变将不是广泛的，并且不会大大影响重组PapMV CP自我组 装成VLP的能力。按照标准技术如本申请实施例中公开的例示性方法，可通过电子显微镜 评估突变版本的PapMV CP自我组装成VLP的能力。
[0085] PapMV CP 的天然突变体也是已知的。例如，据 Noa-Carrazana&Silva-Rosales (20 01，Plant Science，85;558)报道，鉴定了具有外壳蛋白的PapMV的两个墨西哥（Mexican) 分离物，其具有与66址3证登录号齡.013957(即569 10^:1)88%的序列相似性，彼此序 列相似性为94%。在本发明的某些实施方案中，也包括该些天然突变体。
[0086] 因此，在一些实施方案中，还包括通过野生型CP的片段制备的重组PapMV CP，所 述片段保留自我组装成VLP的能力（即，"功能性"片段）。例如，片段可W包含从蛋白质的 N-末端、C-末端或内部或其组合中的一个或多个氨基酸的缺失。一般来说，功能性片段的 长度为至少100个氨基酸，在本发明的一些实施方案中，功能性片段被定义为长度为至少 150个氨基酸、至少160个氨基酸、至少170个氨基酸、至少180个氨基酸或至少190个氨基 酸。
[0087] 在本发明的某些实施方案中，当重组CP包含变体序列时，该变体序列与亲本（参 考）序列具有至少约70%的同一性，例如与参考序列有至少约75%的同一性。在一些实施 方案中，该变体序列与参考序列具有至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、 至少约97%或至少约98%的同一性，或它们之间的任何量。在一个实施方案中，参考氨基 酸序列是SEQ ID NO ;1(图1A)。
[008引在本发明的某些实施方案中，用于制备重组PapMV CP的PapMV CP是PapMV外壳 蛋白CP的经遗传修饰（即变体）形式。在一些实施方案中，对PapMV CP进行了遗传修饰 W从所述蛋白质的N-末端或C-末端缺失氨基酸和/或包含一个或更多个氨基酸替换。在 一些实施方案中，对PapMV CP进行了遗传修饰W从所述蛋白质的N-末端或C-末端缺失约 1至约10个氨基酸，例如约1至约5个氨基酸。
[0089] 在某些实施方案中，对PapMV CP进行了遗传修饰W移除接近野生型蛋白质N-末 端存在的两个蛋氨酸密码子（即，在SEQ ID N0;1的第1位和6位）中的一个，并且可W起 始翻译。翻译起始密码子中一个的移除使得产生同源蛋白质群体。可例如通过替换构成该 密码子的一个或更多个核巧酸使得该密码子编码除蛋氨酸W外的氨基酸或者变为无义密 码子来移除所选蛋氨酸密码子。可选地，可缺失密码子的全部或一部分，或包含所选密码子 的编码所述蛋白质的核酸的5'区。在本发明的一些实施方案中，对PapMV CP进行了遗传 修饰W在1位缺失蛋氨酸，例如从蛋白质的N-末端缺失1至5个氨基酸。在一些实施方案 中，经遗传修饰的PapMV CP具有与SEQ ID NO ;4(图1C)基本相同的氨基酸序列，并且可任 选地包含多至6个组氨酸残基的组氨酸标签。在一些实施方案中，对PapMV CP进行了遗传 修饰W在C-末端包括额外的氨基酸（例如，约1至约8个氨基酸）。引入所述的氨基酸， 例如，可在编码核巧酸序列中产生一个或更多个特异性限制酶位点。在一些实施方案中， PapMV CP具有与SEQ ID NO ;5(图1D)基本相同的氨基酸序列，有或没有组氨酸标签。
[0090] 当使用包含一个或更多个氨基酸替换的变体PapMV CP序列制备重组PapMV CP 时，该些替换可W是"保守"替换或"非保守"替换。保守替换涉及用具有相似侧链性质的 另一个残基替换一个氨基酸残基。如本领域中已知的，可W根据其侧链的物理化学性质将 20种天然氨基酸分组。合适的组包括丙氨酸、额氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、苯 丙氨酸和色氨酸（疏水侧链）；甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半脫氨酸、酪氨酸、天冬醜胺和谷氨 醜胺（极性，不带电侧链）；天冬氨酸和谷氨酸（酸性侧链）W及赖氨酸、精氨酸和组氨酸 (碱性侧链）。另一组氨基酸是苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸（芳族侧链）。保守替换涉及用 来自同组的另一氨基酸替换一个氨基酸。非保守替换涉及用具有不同侧链性质的另一个残 基替换一个氨基酸残基，例如用中性或碱性残基替换酸性残基，用酸性或碱性残基替换中 性残基，用亲水性残基替换疏水性残基等等。
[0091] 在本发明的某些实施方案中，重组CP包含具有一个或多个非保守替换的变体序 列。将一个氨基酸替换为具有不同性质的另一个氨基酸可W改进CP的性质。例如，如之前 所述，CP的第128位残基的突变促进了所述蛋白质组装成VLPCTremblay等，2006，FEBSJ.， 273 ; 14-25)。因此，在一些实施方案中，所述CP包含第128位残基处的突变，其中该位的谷 氨酸残基被中性残基替换。在一个实施方案中，第128位处的谷氨酸残基被丙氨酸残基替 换。
[0092] 已表明，用另一个疏水性残基替换野生型PapMV CP的F13位处的苯丙氨酸残基， 导致与使用野生型蛋白质序列相比，表达重组蛋白质时形成更高比例的VLP。在本发明的上 下文中，认为下述氨基酸残基是适合于在F13位替换的疏水性残基；Ile、Trp、Leu、Val、Met 和Tyr。在本发明的一些实施方案中，所述重组CP包含在13位用lie、T巧、Leu、Val、Met 或Tyr替换化e。在一些实施方案中，所述重组CP包含在13位用Leu或Tyr替换化e。
[0093] 在某些实施方案中，所述CP的F13位的突变可W与E128位的突变、N-末端的缺 失或其组合相组合。
[0094] 同样地，用于制备重组PapMV CP的编码PapMV CP的核酸序列不需要精确对应于 亲本参考序列，而是可通过遗传密码的简并性而不同，和/或使得其编码如上所述的变体 氨基酸序列。因此，在本发明的某些实施方案中，编码变体CP的核酸序列与参考序列具有 约70%的同一性。在一些实施方案中，编码重组CP的核酸序列与亲本（参考）序列具有至 少约75%的同一性，例如，与参考序列具有至少约80%、至少约85%或至少约90%的同一 性，或它们之间的任何量。在一个实施方案中，参考核酸序列是SEQ ID NO ;2(图1B)。
[009引抗原肤
[0096] 根据本发明的重组PapMV CP包含在预测的CP N-末端表面卷曲内与CP融合的一 个或多个抗原肤。优选地，抗原肤来源于流感抗原。抗原肤选自那些不干扰重组CP表达或 自组装成CLP能力的抗原肤，二者均可通过如上所述的标准技术进行检测。
[0097] 与CP融合的抗原肤大小可不同，但是一般来说长度为约3个氨基酸至约50个氨 基酸，例如长度为约3个至约40个氨基酸，约3个至约30个氨基酸，约3个至约25个氨基 酸，约3个至约20个氨基酸，约3个至约15个氨基酸，约3个至约12个氨基酸，或它们之 间的任何量。在一些实施方案中，抗原肤的长度是至少5个，例如至少6个或至少7个氨基 酸W及多至约10、11、12、15或20个氨基酸，或它们之间的任何量。在本发明某些实施方案 中，抗原肤至少长度为25个或更少的氨基酸，例如20个或更少的氨基酸，15个或更少的氨 基酸，14个或更少的氨基酸，13个或更少的氨基酸，12个或更少的氨基酸，范围的下限为例 如3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在某些实施方案中，抗原肤长度为约5、6、7、8、9、10、11、 12或13个氨基酸。
[0098] 产生抗原肤的抗原可含有被T细胞、B细胞、NK细胞巨瞻细胞上的表面结构，I类 或II类APC(抗原递呈细胞）有关的细胞表面结构或其组合识别的表位。在某些实施方案 中，抗原肤含有T细胞或CTL表位。如本领域已知的，T细胞表位和CTL表位被T细胞受体 识别和结合，并且可位于抗原内部未暴露部位，在抗原蛋白酶解后成为T细胞受体可接近 的。CTL表位还可在抗原表面被发现。各种与流感病毒有关的T细胞表位和CTL表位是本 领域已知的。在一些实施方案中，所选的用于融合PapMV CP的抗原肤含有B细胞表位。如 本领域已知的，B细胞表位被B细胞受体识别和结合。该种表位通常位于抗原表面上。各 种与流感病毒有关的B细胞表位是本领域已知的。
[0099] 在某些实施方案中，例如，当重组CP含有多于一个抗原肤时，所述抗原肤可含有T 细胞表位或CTL表位与B细胞表位的组合。
[0100] 已知的流感病毒抗原包括，例如那些来源于血细胞凝集素（HA)、神经 醇胺酶（NA)、核蛋白（NP)、Ml和M2蛋白的抗原。该些蛋白质的序列是本领域 已知的，可便利地从美国国家生物信息中也（NCBI)维护的GenBank数据库处获 得。适合的HA、NP和基质蛋白的抗原肤包括但不限于，含有一个或多个血细胞 凝集素表位的片段；HA 91-108、HA 307-319 和 HA 306-324(Rothbard, Cell, 198 8, 52:515-523)、HA 458-467 G. Immunol. 1997, 159 (10) :4753-61)、HA 213-227、 HA 241-255、HA 529-543 和 HA 533-547 (Gao, al.，J. Virol.，2006, 80:1959-1964); 核蛋白表位；NP 206-229(化 ett，1991，J. Immunol.l47:984-991)、NP335-350 和 NP38〇-393 (Dyer 和 Middleton, 1993, In:Histocompatibility testing,a practical approach (Ed. : Rickwood, D. and Hames, B. D. ) IRL Press, Oxford, p. 292 ； Gulukota 和 DeLisi,1996,Genetic Analysis:Biomolecular Engineering, 13:81)、 NP 305-313(Di化ino，1993，PNAS 90:1508-12) ;NP 384-394化vist,1991，化ture 348:446-448) ；NP 89-101 (Cerundolo, 1991,Proc.R.Soc.Lon. 244:169-7) ；NP 91-99(Silver 等，1993,化ture 360:367-369) ;NP 380-388(Suhrbier,1993,J. Immunology 79:171-173) ;NP 44-52 和 NP 265-273 化iBrino, 1993, ibid.);和 NP 365-380(Townsend, 1986, Cell 44:959-968);基质蛋白（Ml)表位；Ml 2-22、Ml 2-12、Ml 3-11、Ml 3-12、Ml 41-51、Ml 50-59、Ml 51-59、Ml 134-142、Ml 145-155、 Ml 164-172、Ml 164-173(所有描述见 Nijman, 1993,化r.J. Immunol. 23:1215-1219); Ml 17-31、Ml 55-73、Ml 57-68 (Carreno, 1992, Mol Immunol 29:1131-1140); Ml 27-35、Ml 232-240(DiBrino，1993，ibid.)、Ml 59-68 和 Ml 60-68(Eur. J. Immunol. 1994, 24 (3):777-80);和 Ml 128-135 巧ur. J. Immunol. 1996, 26(2):335-39)。
[0101] 其它流感病毒蛋白的抗原区域和表位是已知的，例如，流感离子通道蛋白（M2)的 片段，包括M2e肤（M2的胞外域）。该肤的序列在不同的流感毒株间是高度保守的。本发明 的某些实施例中，抗原肤源自M2e肤。M2e肤序列的实例示于表1的SEQ ID NO ;8。该序列 的变体已被鉴定，该变体的一些实例也示于表1。
[0102] 表l:M2e肤及其突变体
[0103]
【权利要求】
1. 一种含有肽抗原的融合蛋白，所述肽抗原源自流感M2e肽，其融合至木瓜花叶病毒 (PapMV)外壳蛋白的SEQ ID N0:1的6、7、8、9、10、11或12位氨基酸所对应的氨基酸之后， 其中所述融合蛋白能够自我组装成病毒样颗粒（VLP)，且其中所述肽抗原长度为20个或更 少的氨基酸，且包含一般序列：V-X1-T-X2-X3-X4-X5[SEQ ID NO:96]，其中XI为E或D ;X2 为P或L ;X3为T或I ;X4为R或K，且X5为N、S或K。
2. 如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述肽抗原融合在SEQ ID NO: 1的6、7或10 位氨基酸所对应的氨基酸之后。
3. 如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述肽抗原融合在SEQ ID N0:1的6位氨基酸 所对应的氨基酸之后。
4. 如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述PapMV外壳蛋白含有如SEQ ID N0:4所 示的氨基酸序列，所述肽抗原融合至PapMV外壳蛋白的SEQ ID N0:4的1、2、3、4、5、6、7或 8位氨基酸之后。
5. 如权利要求4所述的融合蛋白，其中，所述肽抗原融合至PapMV外壳蛋白的SEQ ID N0:4的2、3、或6位氨基酸之后。
6. 如权利要求1-5中任一项所述的融合蛋白，其中，所述肽抗原长度为约7至约12个 氨基酸，或者长度为约7至约10个氨基酸。
7. 如权利要求1-5中任一项所述的融合蛋白，其中，所述肽抗原长度为约7至约9个氨 基酸。
8. 如权利要求1-8中任一项所述的融合蛋白，其中，所述肽抗原含有如SEQ ID NO: 14-22和96-104中任一个所示的序列。
9. 如权利要求1-8中任一项所述的融合蛋白，其中，所述肽抗原含有序列 EVETPIRNE[SEQ ID N0:21]或 VETPIRN[SEQ ID N0:22]。
10. 如权利要求1-8中任一项所述的融合蛋白，其中，所述肽抗原基本上由序列 EVETPIRNE[SEQ ID N0:21]或 VETPIRN[SEQ ID N0:22]组成。
11. 如权利要求4所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白含有如SEQ ID N0:23中的 1-224位氨基酸；SEQ ID NO :24中1-222位氨基酸；SEQ ID NO :25中1-221位氨基酸；SEQ ID NO :26 中 1-219 位氨基酸；SEQ ID NO :27 中 1-224 位氨基酸；或 SEQ ID NO :28 中 1-222 位氨基酸所示的氨基酸序列。
12. 如权利要求4所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白含有如SEQ ID N0:23中1-224 位氨基酸所示的氨基酸序列。
13. 如权利要求1-12中任一项所述的融合蛋白，其中，所述VLP在至少37°C的温度下 是稳定的。
14. 一种病毒样颗粒（VLP)，其含有权利要求1-13中任一项所述的融合蛋白。
15. -种药物组合物，其含有权利要求14所述的VLP和药学可接受的载体。
16. 如权利要求15所述的药物组合物，其配制为疫苗。
17. -种诱导对象针对流感病毒的免疫反应的方法，其包括向对象给予有效量的权利 要求14所述的VLP。
18. -种降低对象发生流感的风险的方法，其包括向对象给予有效量的权利要求14所 述的VLP。
19. 一种给对象免疫以对抗流感病毒感染的方法，其包括向对象给予有效量的权利要 求14所述的VLP。
20. 如权利要求17-19中任一项所述的方法，其中，所述VLP在对象中诱导体液免疫反 应。
21. 含有权利要求1-13中任一项所述的融合蛋白的病毒样颗粒（VLP)，用于在有需要 的对象中诱导针对流感病毒的免疫反应。
22. 含有权利要求1-13中任一项所述的融合蛋白的病毒样颗粒（VLP)在有需要的对象 中诱导针对流感病毒的免疫反应的用途。
23. 含有权利要求1-12中任一项所述的融合蛋白的病毒样颗粒（VLP)在制备诱导对象 针对流感病毒的免疫反应的药物中的用途。
24. 含有权利要求1-13中任一项所述的融合蛋白的病毒样颗粒（VLP)，用于降低对象 发生流感的风险。
25. 含有权利要求1-13中任一项所述的融合蛋白的病毒样颗粒（VLP)在降低对象发生 流感的风险中的用途。
26. 含有权利要求1-13中任一项所述的融合蛋白的病毒样颗粒（VLP)在制备降低对象 发生流感风险的药物中的用途。
27. 含有权利要求1-13中任一项所述的融合蛋白的病毒样颗粒（VLP)，用于给对象免 疫以对抗流感病毒的感染。
28. 含有权利要求1-13中任一项所述的融合蛋白的病毒样颗粒（VLP)在给对象免疫以 对抗流感病毒的感染中的用途。
29. 含有权利要求1-13中任一项所述的融合蛋白的病毒样颗粒（VLP)在制备给对象免 疫以对抗流感病毒感染的药物中的用途。
30. 如权利要求21、24或27中任一项所述的VLP，或如权利要求22、23、25、26、28或29 中任一项所述的用途，其中，所述VLP诱导对象的体液免疫反应。
31. -种含有权利要求14所述的VLP以及使用说明书的药物试剂盒。
【文档编号】A61K39/295GK104395346SQ201380028970
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2013年2月19日 优先权日:2012年4月2日
【发明者】丹尼斯·勒克莱尔, 娜塔莉·马杰奥 申请人:弗利亚生物技术公司