专利名称：细胞培养箱的制作方法
本申请为此前于1995年8月8日申请的序列号第08/512,546号申请的继续申请。
本发明涉及用于实验室规模的灌流(perfusion)细胞培养方法操作且不要进行特别灭菌或对工作环境不会造成任何生物危害特征的培养仪器。此外，本发明提供混合灌流和非灌流细胞培养方法的装置。进一步，提供了对灌流、混合及静止培养实现受控二氧化碳气氛和所要求温度(例如控制在37℃)的方法。此外，本发明涉及采用在相当高速下混合时增加粘滞细胞在微载体上的粘结的多阴离子培养基添加剂并通过在灌流培养系统中促进近体内条件达到其它益处。
细胞培养中的标准方法是采用CO2培养箱提供静止培养方法所要求的气体氛围及温度控制。这些方法包括采用多孔板、培养盘、釜及类似物。相当大尺寸的标准CO2培养箱(内部工作体积约为19英寸宽×26英寸高×19英寸深)已用于提供采用灌流和混合设备如泵和旋转磨(roller mills)的小规模方法。除极其不便外，采用CO2培养箱需要相当大的投资费用及使用空间。
就过程效率观点而言，其中采用直接方法向培养细胞提供含O2/CO2气体的灌流细胞培养方法是精选方法。已开发多种昂贵、不便且复杂的仪器系统进行灌流及混合/搅拌培养系统的操作。尽管这类系统可实现改进操作，它们无一例外是专用的且极不灵活的仪器。此外，这些单台仪器的故障率往往相当高。故障的主要原因是通常用于加热培养基储槽的热板的错误作用。来自用户的有关加热器超过设定点及在长期实验中无力精确控制温度的报告并不罕见。最重要的是，这些仪器对用户极不“友好”，往往要求数年经验以在无需技术专家干预下操作系列完整过程。
在细胞培养系统中创造近体内条件是长期存在的挑战。由于细胞暴露在共作用力及其它与运动有关但在近体内条件下并不常经历的作用下，灌流和混合/搅拌系统特别成问题。尽管在近20年中已持续采用辅助因素及额外多孔基体组分，但主要由于经济原因，它们仍然引起研究兴趣。要求具有广泛用途的廉价细胞培养基添加剂。此类分子应满足以下三方面要求(ⅰ)以非选择方式增加细胞粘滞性以便能在大规模培养系统中有效进行混合/搅拌；(ⅱ)细胞培养(如基因转变)操作必须不受阻碍地进行；及(ⅲ)必须促进接近于组织中的多细胞环境的培养条件。
定义CO2-与细胞培养营养基中的碳酸氢盐缓冲剂一起维持PH值的二氧化碳气体。
培养箱-设计用于提供细胞培养环境的仪器。
O2-生物细胞呼吸所需的氧气。
HPBr-高效(中空纤维)生物反应器；具有例如提供营养基的中央双向中空纤维束及提供细胞培养所需氧的外纤维束的灌流细胞培养装置。
cpm-每分钟转数，为在一分钟时间内装置完成双向部分旋转(例如)120度的次数。
脂质转染法-将外来DNA引入由形成正电荷微脂粒的阳离子类脂化合物进行调节的宿主细胞。
转染-将不够归并入宿主细胞基因组的外来DNA引入宿主细胞的方法。
细胞培养箱具有分隔为培养段和控制段的培养室。培养段适于容纳细胞培养容器。细胞培养容器搅拌器位于培养箱的控制段，细胞培养容器搅拌器与培养室培养段之间的联动装置对细胞培养容器加以搅拌。设在培养室控制段中的加热器将来自外部环境的空气加热并将热空气输送到培养室的培养段。分隔壁将培养室分隔为培养段和控制段。加热器可为强制空气加热器，在培养室的培养段形成正压以减少培养段中的污染。营养物及气体循环系统与培养室的培养段中的细胞培养容器相连。营养物及气体循环系统包括培养室的培养段外部的气源。管道连接提供气源、培养室培养段中的细胞培养容器及营养培养基之间的联系。位于培养室的培养段开口中的过滤器与管道相连以在排出细胞培养容器的气体排放到外部环境之前从气体中脱除污染物。
本发明提供设计用于实现灌流混合及静止细胞培养方法的小型足迹(footprint)实验桌面培养箱仪器。为实现灌流方法，本发明设有蠕动泵以与不同结构的无菌易处理管道装置一起应用。管道装置提供从储槽循环营养基的方法。含O2/CO2的气体从一预混合气缸供应，而灭菌/生物毒害考虑由一系列关键设置的0.22μm疏水盘式过滤器实现。管道装置设计使得气体能够闭环循环并可选择地将所说的气体混合物辅助进料经设有培养板、釜及类似物的培养室送往处理物流。另一方面，气流管道装置可改造为向滚瓶培养及类似装置提供所说的无菌O2/CO2气体混合物。培养箱工作体积内的温度由恒温控制的循环空气来维持，相对于环境条件，循环空气维持在正压。本发明进一步提供混合灌流或其它间歇培养容器如培养釜或培养瓶的方法。在培养箱的工作体积提供足够的空间以便能在相同条件下培养合理数量的培养盘或釜，这可能是工业开发及放大操作中的关键。由此，可平行控制甚至平行培养培菌液膨胀。
此外，本发明提供利用硫酸软骨素(C型)作为细胞培养基添加剂以增加混合及搅拌时依赖贴壁细胞对微载体的粘附。
参考以下详细描述并结合附图将更易于评价并同时更好地理解本发明上述观点及多方面额外优势，其中
图1为表示本发明的细胞培养箱的部分揭示的透视图；图2为本发明的细胞培养箱培养室的第一标准组件投影图；图3为本发明的细胞培养箱培养室的第二标准组件投影图；图4为本发明的细胞培养箱培养室的第三标准组件投影图；图5为本发明的细胞培养箱培养室的第四标准组件投影图；图6为图2至图5的形成本发明的细胞培养箱培养室的四个组件间联系的分解透视图；图7为本发明的细胞培养箱的前视的说明图8为本发明的细胞培养箱的端视说明图；图9为本发明的细胞培养箱的示意图；图10为本发明的细胞培养箱搅拌器系统的详细侧视图；图10A为本发明的细胞培养箱搅拌器系统的曲柄、凸轮及连杆详细视图；图11为本发明的细胞培养箱的营养物及气体循环系统连续-间歇方法的示意图；图12为本发明的细胞培养箱的营养物及气体循环系统连续方法的示意图；图13为本发明的细胞培养箱的营养物及气体循环系统辅助气源的示意图；图14为本发明的细胞培养箱中的细胞搅拌对IgG1单克隆抗体由3C11杂交瘤细胞的累积产物的影响；及图15为本发明的细胞培养箱中的细胞搅拌对3C11杂交瘤细胞生存期及倍增值的影响。
如图1所示，本发明的细胞培养箱包括由壁8分隔为培养段4和控制段6的培养室2。如图2至图6所示，培养室2包括四个标准组件10,12、14及16。标准组件10、12、14及16优选由合成聚合物如丙烯酸或类似的合成聚合物制成并优选由配合密封垫片连成一体以便标准组件10、12、14及16的支承重量连成一体。如图6所示，标准组件10、12、14及16之间的连接以经济及方便的方式形成本发明细胞培养箱的培养室2。
参考图1、7、8及9，本发明的细胞培养箱的培养室2包括四个最佳促进细胞培养的基本系统温度调节系统，培养基循环系统、气流系统及培养搅拌系统。
温度调节系统包括允许来自外部环境的空气进入培养室2的控制段的空气进口18。若期望提高无菌条件，最优可将例如0.22μm孔隙率的过滤器19设在空气进口附近以确保进入培养室2的控制段6的环境空气不含污染物。一旦空气经空气进口18进入培养室2的控制段6，空气将通过热箱进口22进入热箱20。在热箱20中设有一强制空气加热器21将热箱20中的空气的热能提高。优选装设在壁8中的加热器21强制热空气流经壁8。之后空气进入内设细胞培养容器28(如HPBr中空纤维装置)的培养段4。为维持平衡，来自控制段6先受热并被强制进入培养段4的现已被冷却的部分空气经连接热箱20的返回孔24与壁8中的培养段空气出口26的导管23循环回控制段6中的热箱20。培养段4中的不经培养段空气出口26返回控制段6的热空气经标准组件10、12、14及16之间的孔隙排放到外部环境。由此，实现基本开放的最小压力增大的层流系统。以此方式，实现相对设定点的精确、稳定温度控制的快速温度响应。优选培养室2的培养箱4中相对于环境压力的低正压降低了来自进入培养箱2的培养段4的环境空气的污染物的可能性。为确保上述的精确和稳定的温度控制，可采用温度控制器29如由OmegaEngineering Incorporated of stamford,Connecticut制造的带报警的单脉冲输出微处理器的No.CN 76120型装置。此外，在培养箱2的培养段4内优选设有热电耦30，例如由Omega Engineering Incorporated ofstamford,connecticat制造的No,5TC-TT-7-24-36型。热电耦向上述温度控制器29提供反馈并优选由例如“特氟纶”或类似物绝缘。
总而言之，以上温度调节系统使得能够对培养段6提供所期望的热能并同时在控制段4中维持较低温环境以便其中的电气和机械元件不发生热力学疲劳和损坏。
如图1、7、9、10及10A所示，本发明的培养搅拌系统包括装设在电机支架36上的电机34，它有横过电机支架36的驱动连杆38。驱动连杆38与曲柄40固定连接，曲柄40与凸轮42由系杆44相连，如图10A所示。注意到系杆44与曲柄40及凸轮42在枢轴点41和43处均以枢轴相连，枢轴点41和43分别偏离曲柄40和凸轮42的旋转轴，以便驱动连杆38和曲柄40旋转360度时使凸轮42双向部分旋转例如约120度。凸轮42与轴杆46固定连接，轴杆46由轴杆支架48支撑。重要的是应注意到以上所有元件全部设在培养室2的相当低温的控制段6，轴杆46是个例外，它横跨培养室2的控制段6和培养室2的培养段4，另外，部分轴杆支架48位于培养室2的培养段4内。位于培养室2的培养段4内的还有连接托架52与轴杆46的托架支撑50。细胞培养容器28设在托架52中。操作时，驱动连杆38和曲柄40的360度旋转被由系杆44连接的凸轮42与曲柄40之间的连接转换为凸轮42和轴杆46的近似120度双向部分旋转，这导致托架52和细胞培养容器28的近似120度双向部分旋转以在细胞培养容器28内实现适宜的细胞培养搅拌。电机34优选具有四个位置静止、低(12±3cpm)、中(30±3cpm)、高(60±3cpm)。
虽然以上实施方案采用将360度旋转转换为120度双向部分旋转，但也可采用其它角度部分旋转、全角度360度旋转、轴向往复、垂直往复或以上方式的组合。
在细胞培养搅动过程中，往往期望在细胞培养中采用预活化培养基组分。在培养依赖贴壁(anchorage dependent cell)细胞时，优选采用硫酸软骨素(C类)作为培养基组分以增加搅拌过程中在载体表面(例如微载体)的附着。硫酸软骨素(C类)的优选浓度范围与分子量有关。但对约4,000道尔顿的平均分子量，优选浓度范围在约0.005mM至0.5mM之间。
培养基循环系统和气流系统为本发明的两个独立和不同的系统，但为清楚起见将顺序讨论，其间区别基于所采用的方法的类型或存在辅助功能，如图11、12及13所示。例如，图11表示均以连续-间歇方法应用的培养基循环系统和气流系统，图12表示采用连续方法的培养基循环系统和气流系统，图13表示采用辅助气源的培养基循环系统和气流系统。
首先，参考表示本发明的采用连续-间歇方法的培养基循环系统和气流系统的图11，气流系统包括气源54，例如具有压力阀56并提供例如约5磅/平方英寸压力气体的含约10％CO2的空气。其次，在气流系统中，压力气体流经流量计58。流量计可以是例如由Cole Parmer Instrament Company,Vernon Hills,Illinois制造的Model No.H-32013-01型的50毫升每分钟铝不锈钢流量计。可选择止回阀和节流阀(如图12所示)，使细胞培养容器28中的气体回压与流量计58相关联。应用时，止回阀被选择用以防止压力超过如约0.5-1.0psi的最大压力。气体流入细胞培养容器28之前流经压力计60测量细胞培养容器28中的回压，之后气体流经疏水过滤器62。疏水过滤器优选具有约0.22μm的孔隙率。在进入入口64并充注细胞培养容器28后，气体流出出口66并流经回压阀68和冷凝器70。冷凝器70最好为优选形成气流系统和培养基循环系统的管线的塑料管道的盘管段。最优选地，冷凝器70设有玻璃或塑料珠或颗粒以使细胞培养容器28中的气体所夹带的水蒸汽最大限度冷凝。其后，气体流经另一优选具有约0.22μm孔隙率的疏水过滤器72，之后气体进入培养基储槽74的顶部空间，以此方式优选含CO2的气体维持培养基所要求的PH值。此后气体经其中的气体排放口排出培养室2的培养段4并在流经疏水过滤器75后进入外部环境。过滤器75优选具有约0.22μm的孔隙率。
在连续-间歇方法的培养基循环系统中，来自培养基储槽74的培养基流经泵76。泵76优选为由Barnat Company,Gilmont Instrument,Barrington,Illinois制造的带有200转每分电机的Model No.15PB蠕动泵。流经泵76后，培养基进入营养物加入其中的细胞培养容器28的入口78。废培养基随后流经细胞培养容器28的出口80由此返回培养基储槽74。培养基储槽74在长时期细胞培养过程中的周期变化确定本方法为连续-间歇方法。
参考表示本发明采用连续方法的培养基循环系统及气流系统的图12。气流系统包括与流量计84(例如由Cole parmer Company,vernonHills,Illinois制造的Model No.H-32013-01型50毫升每分铝不锈钢流量计)相连的气源82(例如含约10％CO2、压力约为5磅/平方英寸的空气)。优选具有约0.22μm孔隙率的疏水过滤器86接收来自流量计84的气体。随后，气体流经与流量计84相连的止回阀88，气体节流阀94(后文叙述)使细胞培养容器28中的气体回压设定在预定水平。止回阀88选择用于防止压力超过如约0.5-1.0psi的最大压力。在进入入口90并充注细胞培养容器28后，气体流出出口92，流经节流阀94并进入冷凝器96。冷凝器96最好为优选由与塑料管道相同的材料制成并优选形成气流系统和培养基循环系统的管线的塑料管道的盘管段。最优选地，冷凝器96设有玻璃或塑料珠或颗粒以使细胞培养容器28中的气体所夹带的水蒸汽最大限度冷凝。其后，气体流入培养基储槽98的顶部空间，以此方式优选含CO2的气体维持培养基所要求的PH值。此后气体经其中的气体排放口排出培养室2的培养段4并在流经疏水过滤器100后进入外部环境。过滤器100优选具有约0.22μm的孔隙率。
在连续方法的培养基循环系统中，新鲜培养基由泵102加入培养基储槽98，而来自培养基储槽98的废培养基经管线104排放到外部环境中。流经管线104的废培养基的量直接正比于由泵102泵入培养基储槽98的封闭系统的新鲜培养基的量。泵102优选为由Barnet Company,Gilmont Instrument,Barrington,Illinois制造的带有200转每分电机的Model No.15PB蠕动泵。类似的泵106从培养基储槽98抽出培养基以使培养基随后进入细胞培养容器28的入口108，营养物被加入培养容器28中。废培养基随后流经细胞培养容器28的出口110由此返回培养基储槽98，之后流经管线104排放到外部环境。
参考表示本发明采用辅助气源的培养基循环系统及气流系统的图13，图13中所采用的与图12中所用相同的标号表示与图12所示相同的部件。图13的采用辅助气源的实施方案与图12的连续方法实施方案的不同之处在于提供新鲜培养基的泵102及在图12的连续方法实施方案中将废介质排放到外部环境并与培养基储槽98相连的管线在图13的辅助气源实施方案中未采用。而是在图13的辅助气源实施方案中，支路112将来自冷凝器96进入培养基储槽98的气流分出一部分并将这部分气流加入流经培养室114的物流中。培养室114被设计用于放置静止培养容器如培养板。气体在充注流经培养室114的物流中的培养物后经分支管线116排出培养室114。分支管线116与来自培养基储槽98的气流管线相接在首先流经疏水过滤器100后最终排放到外部环境。
包括气流系统管线和培养基循环系统管线的无菌管道装置采用生物罩中的标准消毒过程与营养培养基储槽74、98一体化装配。在所有将与环境条件下实验室相应仪器部件连接的所有部件上均设置乙醇刷(alcohol swab)。整个系统被移入本发明的细胞培养箱中。采用乙醇刷在迅速从管道装置部件移走乙醇刷并在按逻辑顺序完成连接之前对仪器部件进行消毒。
选择仪器的设定条件(即培养基循环速率及气体流量)并在一定时间(例如8-24小时)内进行管道装置泄漏测试。为降低费用，在此阶段推荐采用磷酸缓冲盐溶液(PBS)代替培养基。然而，这一决策表明必须将仪器断开并且必须在重复以上步骤和操作之前改变培养基容器瓶的内容物。由于操作步骤对用户相当友好，费用节省将往往超过仅仅证明其效果，不存在显著污染的危险。气源54、82可在任何时候改变。对大多数细胞培养过程的推荐浓度范围在5-10％CO2/空气。若采用HPBr装置时，在关闭气流时应断开培养基循环以防止细胞培养容器28中氧合剂纤维的液泛。本发明将维持长期培养，仅需操作人员定期干预(例如取样或换废培养基)。
细胞及微载体(用于依赖贴壁细胞)均由皮下针式注射器加入细胞培养容器28。相似地，通过用来自另一注射器的新鲜培养基置换到空注射器定期从细胞培养容器28移除细胞和上层清液(即用过的培养基)样品。在开启培养室2的培养箱4的门采样时，温度控制器29关闭。
为定期改变废培养基，管道装置断开并将乙醇刷置于已断开的所有装置上。在生物罩下，培养基进行交换而不延迟地继续长期细胞培养方法。
实施例Ⅰ本发明采用HPBr装置作为细胞培养容器28并根据图11的结构装配。向细胞培养容器28加入3.5×108活体3C11杂交瘤细胞并在下述细胞培养基中培养12-15日含4mM L-谷氨酰胺、1mM谷氨酸、2.5mM苯甲酸盐缓冲剂(含等摩尔比安息香酸和苯甲酸钠)及20％胎牛血清的DMEM。两升培养基使用1-7日；第7日上由新鲜培养基置换。整个实验过程中维持约7.0-7.4之间的PH值，培养基以100mL/分循环。采用流量为63mL(Stp)/分的10％CO2/空气气体混合物并在实验过程中维持＜1.0psi的回压。
四个细胞培养容器28装配方式如下各细胞培养容器在12-15日期间内采用以下恒定转速1)静止；2)12±3cpm；3)30±3cpm；4)60±3cpm。将细胞放置1小时(每周日)后，从细胞在其中于灌流条件下培养的17mL体积内收集10mL上层清液。上层清液样品在-20℃下储存直至按要求由ELISA方法确定IgG1单克隆抗体浓度。完成12-15日培养期后通过采用无菌空气将细胞/上层清液混合物逐出而从细胞培养容器28回收所有细胞(＞95％)。最后，采用新鲜培养基对细胞培养容器28洗涤两次。对回收的细胞计数并确定细胞活性。
图14和15表示旋转速度对抗体生产和细胞寿命的影响。显然，60cpm下获得生产量显著增加(即增加约100％)，在实验过程中活体细胞无净增长。对生物分子的生产优选采用60cpm。当细胞培养方法目的在于消耗和收获活体细胞时，优选较低cpm值(即30cpm,12cpm或静止)。
实施例Ⅱ在采用HPBr装置作为细胞培养容器的本发明的细胞培养箱中进行一系列四脂质转染法基因转染实验。控制实验与其自身的控制平行进行，在培养箱内的多孔板中进行。采用下述实验步骤。
平板实验SW480 P3(ATTC#CCL228)克隆癌细胞沉积在6-孔板(即每孔为1×106活体细胞)。以此方式布置十三个孔。各孔内有3mL贮液。贮液由26.4mL RPMI培养基、4mML-谷氨酰胺、3.0mL胎牛血清及10μg/mL庆大霉素制成，总体积为30mL。转染前细菌在含10％CO2的CO2培养箱中于37℃下培养24小时。这一阶段细胞能够粘附在板上。
将前述1ml OPTI-MEM培养基的培养基置换并加入均由Vical Inc.,San Diego,CA生产的阳离子类脂(DMRIE/DOPE)质粒DNA(VR1412)的混合物进行转染过程。稀释在2.0mL OPTI-MEM中摩尔比为0.99(即40μL类脂10μg DNA)的混合物加入孔中。这些板培养4小时。
4小时后，向各孔加入热失活胎牛血清外加12.0μL庆大霉素。在随后13日中，来自一孔的所有细胞进行胰蛋白酶消化、计数，2×104个细胞留作β-半乳糖苷酶报告基因确定的分解样本。每隔一日向其它孔加入1mL上述RPMI培养基(自转染24小时后开始)而不除去含OPTI-MEM的DNA。
在13日期限的最后，经氯酚红基过程分析裂解溶液样品的β-半乳糖苷酶，采用UV-可见光分光光度计定量。
HPBr装置实验在四个具有与前述6-孔板相当的HPBr-型装置的细胞培养容器28中进行四个β-半乳糖苷酶报告基因转染实验。存在下述不同。本过程所有特征均以“每细胞”基础进行调节。然而，由于HPBr装置特征的细胞培养灌流方式(即连续进料)，不需要人工定期加料。
在磷酸缓冲盐溶液中经预膨胀后向细胞培养容器28的侧边开口加入足够的Cytodexl微载体(由Sigma,St.Louis,MO提供)以在每一微载体球上携带10个细胞。注射加入1×107SW480活体细胞。
表Ⅰ列出在接种和后转染之后最初24小时的不同培养基条件，亦给出了本研究所采用的转动参数。实验2,3和4的OPTI-MEM培养基中包括0.1mM硫酸软骨素(C型)。尽管OPTI-MEM培养基的循环由转染所代替，但在含细胞小室中的培养基并不代换。
每日从各细胞培养容器28中取出(约1.5mL)细胞/上层清液样品并补充加入相等数量的新鲜培养基。测定细胞数及活性并将2×107个活体细胞裂解留作β-半乳糖苷酶测定之用。
表Ⅰ实验号 类型 条件 培养基组成1 板CO2培养箱[控制] 1 L RPMI(见上述组成)2 HPBr 30cpm 839mL RPMI；10％胎牛血清；4mM L-谷氨酰胺；10g/mL庆大霉素；2.5mM苯甲酸盐缓冲剂；0.1mM
硫酸软骨素(亦存在于OPTL-MEM转染培养基中)3HPBr 静止 同实验24HPBr 最初48小时为30cpm之后同实验2静止5HPBr 静止[控制] 1L RPMI(见上述组成)表Ⅱ包括对四个灌流装置实验与板式控制的比较数据。显然，在本发明的细胞培养箱中操作的HPBr型细胞培养容器28可用来扩大基因转染和细胞收获规模，这可能具有药物用途。该系统亦可用作任意人工器官以便长期外来基因表达可被容易和实际地研究，这与从人体内无损器官活组织检查方式相当。在此特定条件下，本装置用作纯粹肿瘤模型。
表Ⅱ
尽管本发明的优选实施方案得以描述和说明，但应理解在不背离本发明实质和范围下可进行多种变更。
权利要求
1．细胞培养箱具有热源并包括分隔为培养段和控制段的培养室，所述的培养段适于容纳细胞培养容器；位于所述培养箱控制段的细胞培养容器搅拌器；及位于所述细胞培养容器搅拌器和所述培养室的所述培养段之间对所述培养室的所述培养段中的细胞培养容器进行搅拌的联动装置。
2．按权利要求1的培养箱进一步包括设于所述培养室控制段中将来自外部环境的空气加热并将热空气输往所述培养室的所说的培养段。
3．按权利要求2的培养箱进一步包括将所述培养室分隔为所说培养段和所说控制段的分隔壁，所说的分隔壁中具有开孔；在所说控制段中放置所述加热器并将所述加热器与所述控制段其它部分隔开的壳体；连接所述壳体与所述分隔壁中所述开孔以从所述培养室的所说培养段将空气循环回所述培养室控制段中的所述壳体的管道。
4．按权利要求2的培养箱，其中所说的加热器为强制空气加热器，它向所述培养室的培养段提供正压以降低所述培养段中的污染。
5．按权利要求1的培养箱进一步包括一个位于所述培养室控制段与外部环境之间的过滤器，所说的过滤器从进入所述培养室控制段的空气中脱除污染物以在所说的培养段提供无菌环境。
6．按权利要求1的培养箱进一步包括与所述培养室培养段中的细胞培养容器相连的营养物及气体循环系统。
7．按权利要求6的培养箱，其中所说的营养物及气体循环系统还包括位于所述培养室培养段外部的气源；及将所述气源与所述培养室培养段中的细胞培养容器以及营养培养基相连的管道。
8．按权利要求7的培养箱进一步包括；一个设在所述培养室培养段开孔中的过滤器，所述的过滤器与所述管道相连以使排出细胞培养容器的气体在排放到外部环境之前脱除其中的污染物。
9．细胞培养箱包括分隔为培养段和控制段的培养室，所说的控制段设有加热器将来自外部环境的空气加热并将热空气输送到所述培养室的培养段，所说的培养段适于容纳细胞培养容器。
10．按权利要求9的培养箱进一步包括设在所述培养室控制段和外部环境之间的过滤器，所说的过滤器从加入所述培养室控制段的空气中脱除污染物以在所说的培养段中提供无菌环境。
11．按权利要求9的培养箱进一步包括将所述培养室分隔为所说培养段和所说控制段的分隔壁，所说的分隔壁中具有开孔；在所说控制段中放置所述加热器并将所述加热器与所述控制段其它部分隔开的壳体；连接所述壳体与所述分隔壁中所述开孔以从所述培养室培养段将空气循环向所述培养室控制段中的所述壳体的管道。
12．按权利要求9的培养箱，其中所说的加热器为强制空气加热器，它向所述培养室的培养段提供正压以降低所述培养段中的污染。
13．按权利要求9的培养箱进一步包括与所述培养室培养段中的细胞培养容器相连的营养物循环系统。
14．按权利要求13的培养箱，其中所说的营养物及气体循环系统包括位于所述培养箱培养段外部的气源；及将所述气源与所述培养室培养段中的细胞培养容器以及营养培养基相连的管道。
15．按权利要求14的培养箱进一步包括设在所述培养室培养段开孔中的过滤器，所说的过滤器与所述管道相连以使排出细胞培养容器的气体在排放到外部环境之前脱除其中的污染物。
16．按权利要求9的培养箱进一步包括位于所述培养箱控制段中的细胞培养容器搅拌器；及位于所述培养容器搅拌器和所述培养室的所述培养段之间对所述培养室的所说培养段中的细胞培养容器进行搅拌的联动装置。
17．细胞培养箱具有热源并包括；分隔为培养段和控制段的培养室，所说的培养段适于容纳细胞培养容器；及与所述培养室培养段中的细胞培养容器相连的营养物及气体循环系统。
18．按权利要求17的培养箱，其中所说的营养物及气体循环系统包括位于所述培养室培养段外部的气源；及将所述气源与所述培养室培养段中的细胞培养容器以及营养培养基相连的管道。
19．按权利要求18的培养箱进一步包括设在所述培养室培养段开孔中的过滤器，所说的过滤器与所述管道相连以使排出细胞培养容器的气体在排放到外部环境之前脱除其中的污染物。
20．按权利要求17的培养箱进一步包括设于所述培养室控制段中将来自外部环境的空气加热并将热空气输往所述培养室的所说的培养段。
21．按权利要求20的培养箱进一步包括将所述培养室分隔为所说培养段和所说控制段的分隔壁，所说的分隔壁中具有开孔；在所说控制段中放置所述加热器并将所述加热器与所述控制段其它部分隔开的壳体；连接所述壳体与所述分隔壁中所述开孔以从所述培养室培养段将空气循环回所述培养室控制段中的所述壳体的管道。
22．按权利要求20的培养箱，其中所说的加热器为强制空气加热器，它向所述培养室的培养段提供正压以降低所述培养段中的污染。
23．按权利要求17的培养箱进一步包括一个设在所述培养室控制段和外部环境之间的过滤器，所说的过滤器从加入所述培养室控制段的空气中脱除污染物以在所说的培养段中提供无菌环境。
24．按权利要求17的培养箱进一步包括位于所述培养箱控制段中的细胞培养容器搅拌器；及位于所述培养容器搅拌器和所述培养室的所述培养段之间对所述培养室的所说培养段中的细胞培养容器进行搅拌的联动装置。
全文摘要
细胞培养箱具有分隔为培养段和控制段的培养室。培养段适于容纳细胞培养容器。细胞培养容器搅拌器位于培养箱的控制段,细胞培养容器搅拌器与培养室培养段之间的联动装置对细胞培养容器加以搅拌。设在培养室控制段中的加热器将来自外部环境的空气加热并将热空气输送到培养室的培养段。分隔壁将培养室分隔为培养段和控制段。加热器可为强制空气加热器,在培养室的培养段形成正压以减少培养段中的污染。营养物及气体循环系统与培养室的培养段中的细胞培养容器相连。营养物及气体循环系统包括培养室的培养段外部的气源。管道连接提供气源、培养室培养段中的细胞培养容器及营养培养基之间的联系。位于培养室的培养段开口中的过滤器与管道相连以在排出细胞培养容器的气体排放到外部环境之前从气体中脱除污染物。
文档编号C12M3/06GK1235634SQ9719936
公开日1999年11月17日 申请日期1997年10月29日 优先权日1996年11月1日
发明者兰德尔·A·戈夫 申请人:基因观测公司