专利名称：新型磷脂酶,及其生产和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新型磷脂酶，其编码DNA序列及其生产和应用。
背景技术：
磷脂，如卵磷脂或磷脂酰胆碱，由在第一位(Sn-1)和第二位(Sn-2)被两分子脂肪酸酯化并在第三位被磷酸酯化的丙三醇组成；该磷酸相应地可被氨基酯醇化。磷脂酶是参与磷脂水解的酶类。磷脂酶活性可分为几种类型，包括磷脂酶A1和磷脂酶A2，它们可水解一个脂肪酰基(分别在Sn-1位和Sn-2位)，形成溶血磷脂；而溶血磷脂酶(或磷脂酶B)则水解溶血磷脂中剩下的脂酰基。本发明涉及一种能够水解磷脂中所有脂酰基的磷脂酶。具有这种活性的酶类有时也被称为磷脂酶B。
已报导的具磷脂酶B活性的酶类来自于多种真菌，包括特异青霉[也称为产黄青霉；N.Kawasaki.《生化杂志》(J.Biochem.),77,1233-44,1975；N.Masuda等，《欧洲生化杂志》(Eur.J.Biochem.),202,783-787,1991]，酿酒酵母[M.Ichimasa等，《农业生物化学》(Agric.Biol.Chem.),49(4),1083-89,1985；F.Paultauf等，《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)，269,19725-30,1994]，戴尔有孢圆酵母[旧称罗斯酵母，Y.Kuwabara,《农业生物化学》，52(10),2451-58,1988；《FEMS，微生物学通讯》(FEMS,Microbiol.Letters),124,29-34]；粟酒裂殖酵母[H.Oishi等，《生物科学、生物技术和生物化学》(Biosci.Biotech.Biochem.),60(7),1087-92,1996]，黑曲霉[《技术简报》(Technical Bulletin),G-zymeTMG999，酶学生物系统有限公司(Enzyme Bio-SystemsLtd.)和刺孔伏革菌[S.Uehara等，《农业生物化学》，43(3),517-525,1979]。
已知磷脂酶可用于例如油脂的酶促脱胶(US5,264,367,Metallgesellschaft公司，Rohm)，淀粉水解产物(特别是小麦淀粉的水解产物)的后处理以提高过滤通透能力(EP219,269,CPC International)，还可用作面包生面的添加剂以提高面包弹性(US4,567,046,Kyowa Hakko)。
本发明目的在于提供可用于上述方法的一种改良磷脂酶。
本发明陈述本发明者已发现可从Hyphozyma属株系中获得一种酸性磷脂酶。它能够水解催化完整磷脂中的两个脂酰基团。其优异之处在于，它在非常低的pH条件下有活性，并且无脂酶活性；这些特性使得它非常适用于油脂脱胶，因为油脂的酶促和碱性水解(皂化)此时都受到了抑制。该酶为非膜结合型，使其适于商业化生产和纯化。
WO93/24619(Novo Nordisk)公开了一种来自Hyphozymasp.LF-132(CBS648.91)的脂酶，但一直没有关于由该属产生磷脂酶的报道。我们已经发现本发明磷脂酶可从与已知脂酶来源相同的株系中获得，并且可以将这两种酶分离。
相应地，本发明的首要方面在于提供一种已分离的磷脂酶，它来自于Hyphozyma株系，能够水解磷脂中的所有脂酰基团，并在实施例3所述条件下测得在大约50℃和pH3的条件下具有最佳磷脂酶活性。
本发明也提供一种已分离的磷脂酶，它能够水解磷脂中的所有脂酰基团，是一种在其氨基末端包含作为SEQ ID NO:11中所述第1-497位序列的部分氨基酸序列的多肽，或与该序列至少有50％的同一性。
另一方面，本发明提供了一种已分离的磷脂酶，它能够水解磷脂中的所有脂酰基团，是一种含有与SEQ ID NO:1-8所示氨基酸序列有至少50％同一性(不考虑Xaa)的氨基酸序列的多肽。
本发明进一步提供一种分离的编码所述磷脂酶的DNA序列。
本发明另一方面还提供了生产磷脂酶的方法，包括在适当的营养培养基中培养Hyphozyma可产生磷脂酶的一个株系，随后回收磷脂酶。
本发明更进一步提供了生产磷脂酶的方法，包括从可产生磷脂酶的Hyphozyma株系中分离编码磷脂酶的DNA序列，并在合适的载体上将该DNA片段连上适宜的表达信号，用所构建的载体转化适当的异源宿主生物体，在适于磷脂酶表达的条件下培养所转化的宿主生物体，以及从培养液中回收磷脂酶。
本发明还提供了所述磷脂酶在一种方法中的用途，该方法包括用该磷脂酶处理磷脂或溶血磷脂以水解脂酰基团。
最后，本发明提供了一种降低植物油中磷脂含量的方法，包括在pH1.5-3的条件下利用酸性磷脂酶的水分散体处理油脂以水解磷脂的大部分，并将水解后的磷脂从油脂中分离出来。
附图简述
图1,2和3分别显示了来自Hyphozyma sp.CBS 648.91的磷脂酶的温度走势图、pH走势图和热稳定性走势图。进一步细节见实施例3。
图4a-d给出了SEQ ID NO:11与现有技术中的3个序列的比较。
发明详述磷脂酶本发明磷脂酶能够水解磷脂分子(如磷脂酰胆碱或卵磷脂)中的两个酰基而无中间产物溶血磷脂的积累，也能够水解溶血磷脂(如溶血磷脂酰胆碱或溶血卵磷脂)中的脂酰基团。优异之处在于，本发明磷脂酶为非膜结合型。
优选的酶类来自于Hyphozyma sp.CBS 648.91株系。其分子量大小经SDS电泳检测为大约94Kda，经凝胶过滤检测为大约87Kda，经质谱检测为92Kda。人们确信它受到了糖基化修饰，其等电点大约为5.6。它无脂酶活性，即不能水解三酰甘油。
图1和2显示了温度和pH变化对这种磷脂酶活性的影响。如这些图所示，该酶在大约pH3和50℃有最佳活性。
图3显示了该酶的热稳定性，用在pH7条件下于不同温度温育10分钟后的残余活性表示。该图表明，温度一直上升到50℃时该酶还保持超过90％的活性，至60℃时还保持超过75％的活性，而至70℃时仍保持超过50％的活性。磷脂酶活性分析在本说明书中使用了两种不同的单位1单位(磷脂酶活性单位)是指在40℃和pH4的条件下，每分钟水解DPPC(二棕榈酰磷脂酰胆碱)并释放1微摩尔脂肪酸所需的磷脂酶的量。所释放的脂肪酸的量可通过WAKO公司的NEFA-C测试法来测定。
1国际单位(IU)是指在pH-stat中，于40℃和pH8且存在钙离子和脱氧胆酸盐的条件下，每分钟水解卵黄而释放1微当量游离脂肪酸所需的磷脂酶的量。所释放的脂肪酸用0.1N氢氧化钠滴定，作为时间的函数检测所耗碱体积。磷脂酶作用模式分析通过以下实验来确证所用酶是否能够水解磷脂的两个脂酰基团而无溶血磷脂的累积。
底物溶液制备为含有2％的二棕榈酰L-α-磷脂酰胆碱(WAKO精细化学工业有限公司产品)和2％的Triton X-100。缓冲溶液含有0.4M柠檬酸盐缓冲液(pH5)。酶溶液含有待分析样品的各种量。
将0.5ml底物溶液，0.25ml缓冲溶液和0.05ml 0.1N CaCl2相混合，于40℃下温育。向混合溶液中加入0.1ml酶溶液并温育1小时。最后加入1N盐酸0.1ml从而终止反应。
向反应混合物中加入2ml三氯甲烷-甲醇(1∶1)混合溶液并剧烈混匀。取出1微升的三氯甲烷-甲醇混合液，加至TLC棒上(一式三份或一式四份)。待TLC棒晾干后，用三氯甲烷∶甲醇∶氨(25％的溶液)=65∶25∶5混合溶液展开45分钟。展开后，经TLC-FID(Iatroscan)对TLC棒进行扫描分析，对所得层析数据进行积分。
棕榈酰脂、底物、溶血磷脂酰胆碱(LPC)和甘油磷脂酰胆碱(GPC)的量分别由按照所述顺序出现的峰的面积计算得到。
如果产生GPC，同时不形成任何LPC，即可认为实验所得为阳性结果。氨基酸序列来自Hyphozyma sp.CBS648.91株系的磷脂酶经酶促水解后，进行序列分析即得到部分序列SEQ ID NO:1-8。在这些序列中，Xaa代表尚未确知的氨基酸。SEQ ID NO:1是N末端序列，其余为内部序列。SEQ ID NO:1中的Xaa被认为是脯氨酸残基，SEQ ID NO:3,7和8中的Xaa以及SEQ ID NO:5中的两个Xaa被认为是糖基化的Asn残基。
确定了编码来自Hyphozyma sp.CBS648.91株系磷脂酶的基因的近乎完整的DNA序列(SEQ ID NO:9)。该序列是从基因组位点确认的，它含有一个编码552个氨基酸的开放阅读框和推测的翻译起始密码子上游213个碱基对的核苷酸序列。序列分离及验证所用方法在本领域众所周知。细节详述于实施例中。
将该序列中确认的长连续开放阅读框翻译后与部分肽序列SEQID NO:1-8进行比较。翻译出来的序列与其中的七个部分肽序列SEQID NO:1-7在全部位置均相同，并与部分肽序列SEQ ID NO:8在最远端重叠了10个氨基酸。结合部分肽序列SEQ ID NO:8和翻译结果，确定了一条含573个氨基酸残基的序列(见SEQ ID NO:11)。与SEQ ID NO:1相比较得到了成熟肽的氨基末端序列。已测序的开放阅读框序列向上游延伸了115个氨基酸。该区只有一个甲硫氨酸密码子，距离成熟肽起点76个氨基酸(-76位)。紧随甲硫氨酸残基之后的14个氨基酸似乎构成一个分泌信号序列(G.von Heijne，《核酸研究》，14,4683-4690,1986)，这表明该甲硫氨酸即为翻译起始密码子，并且所编码的蛋白质是分泌型的。其间的61个氨基酸肯定组成一个前肽。
如图4a-d所示，将来自Hyphozyma的肽序列与来自其它三种真菌特异青霉(Genbank X60348)，酿酒酵母(Genbank L23089)和戴尔有孢圆酵母(Genbank D32134)的磷脂酶B序列进行了对比。其中，短线(-)表示插入的间隔，序列对比上方的圆圈(○)代表在所有蛋白质中均为相同氨基酸的位置，序列对比上方的垂直线(丨)代表在所有蛋白质中均类似的氨基酸。我们已确认的Hyphozyma磷脂酶序列部分与特异青霉磷脂酶具38％的同一性，与酿酒酵母磷脂酶具37％的同一性，而与戴尔有孢圆酵母磷脂酶具38％的同一性。特异青霉、酿酒酵母、戴尔有孢圆酵母的磷脂酶序列全长比来自Hyphozyma的部分序列要多112-145个残基，这表明翻译后的Hyphozyma磷脂酶全长大约为700个氨基酸残基。
因此，本发明磷脂酶可能包含SEQ ID NO:11第1-497位所示的氨基末端序列，或者由之通过替代、删除或插入一或多个氨基酸所衍生出的序列。衍生得到的氨基酸序列与上述部分序列可以有至少50％的同一性，例如至少60％，优选至少70％，特别优选至少80％或至少90％的同一性。本发明磷脂酶的羧基末端可能还含有150-250个(例如180-220个)氨基酸残基。微生物本发明磷脂酶可以来自真菌Hyphozyma属的一个株系，该属是de Hoog,G.S.&Smith,M.Th.在Antonie van Leeuwenhoek，第47期，339-352页(1981)中所述的类似酵母的丝孢菌亚纲的一个属。
优选地，该株系属于WO93/24619所述Hyphozyma sp.LF132,CBS648.91所限定的种类。本株系属于Hyphozyma属，但它与以前所述的Hyphozyma任何一种都不完全一样，所以它被认为是一个新种。特别优选使用该株系或其具有产生磷脂酶能力的突变体或变种。
根据布鲁佩斯条约所规定的专利申请程序，该优选的Hyphozyma sp.株系(被发明人命名为LF132)已于1991年11月12日保藏于真菌菌种保藏中心(CBS),Oosterstraatl,3740AG Baran，荷兰，保藏号为CBS648.91。培养Hyphozyma以生产磷脂酶本发明磷脂酶可以通过在合适的含碳源、氮源和无机盐的营养培养液中培养上述微生物，并回收该酶而制得。营养培养液可根据本领域已知原则进行配制。
可按照诸如本说明书的实施例所述从培养液中回收磷脂酶，并通过纯化除去脂酶活性。培养转化体以生产磷脂酶生产本发明磷酯酶的另一种方法包括用编码磷脂酶的DNA序列转化合适的宿主细胞，随后在适于磷脂酶产生的条件下培养已转化的生物体，并从培养物中回收该酶。
宿主生物体优选是真核细胞，特别是真菌细胞，如酵母细胞或丝状真菌细胞，优选曲霉属、镰孢属、木霉属或酵母属的一个菌株，最优选黑曲霉、米曲霉、禾本科镰孢，接骨木镰孢、淀粉镰孢(F.cerevisiae)或酿酒酵母的菌株。在这些宿主生物体中生产磷脂酶可根据EP238023(Novo Nordisk),WO96/00787(Novo Nordisk)，或EP244234(Alko公司)中所述的常规方法进行。
可根据本领域已知方法，如美国纽约冷泉港实验室出版社出版的《分子克隆实验手册》中所述方法，从产生磷脂酶的Hyphozyma株系中通过提取DNA而分离出该DNA序列。
本发明DNA序列也可通过涉及下述的任何一种常规方法得到-将可产生磷脂酶的Hyphozyma株系的cDNA文库克隆至合适的载体中，-用所述载体转化合适的酵母宿主细胞，-在合适条件下培养宿主细胞以表达由cDNA文库中一个克隆所编码的任一种目的酶类，-通过测定由这种克隆所产生的酶的磷脂酶活性，筛选出阳性克隆，-从这种克隆中分离出编码该酶的DNA。
在WO93/11249或WO94/14953中公开了一种常规分离方法，它们的内容引入本文作为参考。
或者，也可以利用依据这里公开的肽序列所合成的寡核苷酸探针，按照众所周知的方法，从产生磷脂酶的Hyphozyma株系中方便地分离出编码本发明磷脂酶的DNA。磷脂酶的用途在需要水解磷脂或溶血磷脂(如卵磷脂或溶血卵磷酯)的脂酰基团的任何应用中，本发明磷脂酶均可使用。该磷脂酶优选在pH1.5-5(例如pH3-5，特别是pH3.5-4.5)和温度为30-70℃(特别是40-60℃)的条件下使用。如果需要，该磷脂酶可在反应后经热处理(例如在pH7条件下，于80℃处理1小时或90℃处理10分钟)失活。
作为实例，本发明磷脂酶可用于生面团、面包和蛋糕的制备中，例如可提高面包或蛋糕的弹性。因此，该磷脂酶可用于面包的制备方法中，包括加入该磷脂酶作为生面配料、揉面并烘焙生面以制备面包。这可以类似于US4567046(Kyowa Hakko公司)、JP-A60-78529(QP公司)、JP-A62-111629(QP公司)、JP-A63-258528(QP公司)或EP426211(Unilever公司)中所述进行。
可以用本发明磷脂酶处理糖的水溶液或悬浮液来提高其滤过性。这可特别应用于含有淀粉水解物的水溶液或悬浮液，尤其是小麦淀粉水解物的水溶液或悬浮液，因为它难于过滤，且得到的是混浊的滤过液。这种处理可类似于EP219269(CPC International)中所述进行。处理植物油类本发明磷脂酶可用于减少食用油中所含磷脂的方法中，包括用磷脂酶处理油脂以水解大部分磷脂，以及从油脂中分离出含有已水解的磷脂的水相。该方法可应用于纯化任何含磷脂的食用油类，例如豆油、菜籽油和向日葵油等植物油。
在用酶处理之前，优选地，植物油要诸如通过湿式精制法预处理以除去粘液(粘质)。通常，开始用磷脂酶处理时，油脂中含有磷脂形式的磷50-250ppm，而本发明方法可使该值降低至低于5-10ppm。
最好将磷脂酶水溶液以平均直径10μm以下的液滴逐滴分散从而进行酶促处理。水的用量最好是油重量的0.5-5％。也可选择性地加入乳化剂。可进行机械搅拌以维持乳浊液状态。
酶处理可以在pH1.5-5下进行。为了使酶性能最强，该方法的pH可以是pH3.5-5的范围内，或者可以使用pH1.5-3(例如pH2-3)的条件以抑制甘油三脂的碱性水解(皂化)。可通过加入柠檬酸、柠檬酸盐缓冲液或盐酸来调节pH。
适宜温度一般为30-70℃(特别是30-45℃，例如35-40℃)。反应时间通常为1-12小时(例如2-6小时)，适宜酶剂量通常为每升油脂100-5000IU(例如200-2000 IU/L)或0.1-10mg/L(例如，0.5-5mg/L)。
该酶促处理可以在诸如具有搅拌的罐内批量进行，可以在诸如一系列搅拌的罐反应器内连续进行。
酶促处理后，随之进行水相和油相的分离。这可采用诸如离心等常规方法进行。水相中会含有磷脂酶，它可以回收再利用以提高经济效益。
另一方面，本方法可根据本领域已知原理进行操作，例如与US5264367(Metallgesellschaft公司，Rohm)；K.Dahlke＆H.Buchold,INFORM,1995年第6卷，第12期，1284-91页；H.Buchold,《脂肪科学技术》(Fat.Sci.Technol.),1993年第95卷，第8期，300-304页；JP-A 2-153997(Showa Sangyo)；或EP654,527(Metallgesellschaft公司，Rohm)类似地进行。
实施例实施例1培养Hyphozyma以生产磷脂酶在含下列组分的营养培养基中培养Hyphozyma sp.CBS 648.91株系葡萄糖 20克/升蛋白胨 10克/升MgSO4·7H2O 1克/升酵母提取物 10克/升K2HPO45克/升用NaOH将pH调至6.5。
将菌株在27-30℃条件下培养3-4天。通过离心对培养液进行液体/固体分离。离心后，获得1活性单位/克培养液(如前所定义)的磷脂酶。上清液经脱盐、冻干，即可得到粗制粉末制剂。实施例2磷脂酶的纯化将实施例1中冻干所得磷脂酶粉剂上样到已将盐溶度调节为3.5M醋酸铵的Butyl Toyopearl 650M柱上。用水洗脱下结合的磷脂酶活性，并使之与也存在于粗制粉末制剂中的脂酶活性相分离。
收集、浓缩并透析含有磷脂酶活性的部分。已浓缩的制剂用DEAEToyopearl 650M经阴离子交换柱层析进行处理。吸附条件是pH7.5(50mM Tris-HCl)，用0-0.5M的NaCl线性梯度洗脱。
最后用HiLoad26/60 Superdex200pg进行凝胶过滤柱层析。其条件为含0.5M NaCl的50mM Tris-HCl(pH7.5)缓冲液。所纯化的磷脂酶用于以下的实施例中。实施例3磷脂酶性质鉴定该磷脂酶分子量(MW)大小经PAGE检测为94Kda，经凝胶过滤柱层析检测为87Kda。我们确信该多肽发生了糖基化修饰。等电聚焦PAGE分析其pI大约为5.6。
在pH3.0和pH4.0条件下，在40-70℃的温度范围内测定其温度走势图。将磷脂酶在所选条件下温育10分钟后，用前述方法检测其活性。图1给出了以相对活性(取最大活性为100％)所表示的温度走势图。从该图可以看出，在pH3和pH4时，磷脂酶在40-60℃的温度范围内均具有高活性(超过最大活性的50％)，最佳温度为大约50℃。
在40℃条件下，用pH2,2.5和3的甘氨酸-盐酸缓冲液以及pH3,4,5和6的柠檬酸盐缓冲液测定其pH走势图。图2给出了以相对活性(取最大活性为100％)所表示的结果。由于缓冲液体系的变化(甘氨酸-盐酸，柠檬酸盐)，该图由两条曲线组成，一条代表pH2.0-3.0间相对活性的变化，另一条代表pH3.0-6.0间相对活性的变化。从图中可以看出磷脂酶在pH2-5之间有活性，其最佳pH为pH3左右。
通过将磷脂酶在0.1M磷酸盐缓冲液(pH7)中于40-80℃温育10分钟并测定温育后的残留活性来测定其热稳定性。其结果为40℃时100％,50℃时95％,60℃时82％,70℃时55％,80℃时9％。这些结果也示于图3中。实施例4磷脂的水解在水中溶解2％的黄豆卵磷脂(磷脂酰胆碱)粗品作为底物溶液。将实施例2中所纯化的磷脂酶稀释50倍得到酶溶液。将0.5ml底物溶液，0.25ml 0.4M柠檬酸盐缓冲液(pH4)和0.05ml 0.1N CaCl2溶液相混合并温育于60℃。加入0.1ml酶溶液，在60℃共温育1小时。加入0.1ml 1N HCl以终止反应。反应后所得混合物通过上述测定中述及的TLC-latroscan分析其反应模式。
结果表明形成了脂肪酸，且在反应后不再剩有卵磷酯。在反应管道的底部可观察到固体沉淀物。人们确认这是磷脂和脂肪酸的混合物。实施例5溶血磷脂的水解溶血磷脂酰胆碱(LPC)在40℃用磷脂酶处理10分钟，其它条件与实施例4所述相同。层析图显示大约有三分之二的LPC已被水解，形成脂肪酸和少量的磷脂酰胆碱。实施例6食用油的酶促脱胶如下所述，食用油可用来自Hyphozyma的磷脂酶处理来进行脱胶。改变酶浓度、反应pH和温度，测定所得磷脂浓度。
该装备包括一个装有钢盖的1升具套钢反应器、一个推进器(600rpm)、一个阻隔板、一个温度传感器、顶部一个入口管道和一个回流冷凝器(4℃)以及底部一出口管道。其中反应套与恒温浴相连。而出口管道通过硅氧烷管与一装有高速剪切筛(8500rpm，流速大约每分钟1.1升)的联机混合器设备相连。该混合器设备装备有冷却卷管(5-10℃)和一导出管，后者通过硅氧烷管连着反应器的入口管道。在硅氧烷管内紧接混合器装置后插入一温度传感器。反应器/混合器装置系统与外界的唯一联系是通过回流冷凝器。
在任一实验中，使反应器的恒温器和实验室混合器工作，向反应器中加入0.6升(约合560克)、P含量为186-252ppm的脱水菜籽油，时间为零时，向反应器中加入于27克水中的0.6克(2.86mmol)单水合柠檬酸进行预处理30分钟(所加水与油脂的重量比等于4.8％:水相中柠檬酸的浓度为106mM，水/油乳浊液中柠檬酸的浓度为4.6mM)。预处理后，加入NaOH溶液调节pH，再加入酶溶液。混合物随后温育6小时，在实验期间每间隔一定时间取样以用于P分析和pH值的测量。
通过加热和离心分离出乳浊液后，油脂中的磷含量按照《油、脂及其衍生物分析的标准方法》(第7版，1987)中的程序2.421测定。
取最优值为100％，由从油脂中去除磷的初始速率计算出酶的初始性能。不同pH条件下的脱胶效果在40℃下，每千克油脂用1.3毫克酶(纯酶蛋白)处理。不同pH条件下所得结果如下pH值 初始性能6小时后P含量(相对于最优值)3.0 40 74ppm3.7 90 ＜10ppm4.4 100 ＜10ppm4.8 80 ＜10ppm不同温度条件下的脱胶效果在pH4.5条件下，每千克油脂用1.3毫克酶(纯酶蛋白)处理。不同温度条件下所得结果如下温度 初始性能 6小时后P含量(相对于最优值)35℃ 90 ＜10ppm40℃ 100 ＜10ppm不同酶浓度条件下的脱胶效果在pH4.5,40℃的条件下处理油脂。不同酶浓度(纯蛋白)时，所得结果如下酶浓度 初始性能 6小时后P含量(相对于最优值)0.65mg/kg油脂70＜10ppm1.3 100 ＜10ppm2.6 100 ＜10ppm结果表明在pH3.5-5,35-40℃时该酶具有良好的脱胶效果。酶浓度为1.3mg/kg油脂时温育6小时或在酶浓度为2.6mg/kg油脂时温育3小时后可达到良好的脱胶效果，即磷含量低于10ppm。
测量脱胶过程中所产生的游离脂肪酸量，结果表明，游离脂肪酸的浓度处于低水平，与底物油脂中磷脂的量很一致。
为了进行对照，采用现有技术中从猪胰脏中提取的磷脂酶进行类似实验。结果发现，在60℃,pH5.5时可以使脱胶效果达到磷浓度低于10ppm。但在更低pH下，该现有技术酶的脱胶性能急剧下降，且在pH低于5.5时不能获得另人满意的脱胶效果。实施例7部分确定编码该磷脂酶的DNA序列通过两种不同的方法分离得到编码Hyphozyma磷脂酶的DNA序列。通过克隆分离得到该基因的5’末端。对经Sau3A部分酶切消化Hyphozyma DNA构建的基因组文库用特异于磷脂酶基因序列的探针按照标准方法(Sambrook等编，由美国纽约冷泉港实验室出版的《分子克隆实验手册(1989)》)，在高度严谨的条件下进行筛选。所用探针是利用由先前已确认的部分多肽序列SEQ ID NO:1和5设计的简并引物从Hyphozyma总DNA中扩增出来的。选用标准PCR条件(Saiki等，《科学》，239,487-491,1989)进行扩增包括加入0.5mM MgCl2，退火温度45℃，引物分别为PLMStr1(SEQ ID NO:12)和PLMStr6(SEQ ID NO:13)。克隆pMStr16可与该探针杂交上，因此将其分离出来，并对该插入片段进行了测序。
以PLHaW2(SEQ ID NO:14)和PLMStr7(SEQ ID NO:15)为引物，利用PCR方法从Hyphozyma总DNA中扩增出磷脂酶编码基因的其它内部部分。引物PLHaW2是根据从pMStr16所确定的序列设计的，引物PLMStr7是利用部分肽序列SEQ ID NO:8设计的。应用标准条件进行PCR反应，其中使用1.5mM MgCl2，退火温度46℃。分离出扩增片段并进行测序。
序列表(1)一般资料(ⅰ)申请者(A)名称Novo Nordisk公司(Novo Nordisk A/S)(B)街道Novo Alle(C)城市Bagsvaerd(E)国家丹麦(F)邮编DK-2880(G)电话+45-4444-8888(I)传真+45-4449-3256(ⅱ)发明名称新型磷脂酶，及其生产和应用(ⅲ)序列总数15(ⅳ)计算机可读类型(A)媒体类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件Patentin Release#1.0,Version#1.30(EPO)(2)序列SEQ ID NO:1相关信息(ⅰ)序列特征(A)长度16个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型多肽(ⅴ)片段类型氨基末端(ⅵ)来源(A)生物Hyphozyma sp.
(B)株系CBS648.91(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:Ala Ser Pro Ser Gly Ser Tyr Ala Pro Ala Asn Met Pro Cys Xaa Gln1 5 10 15(2)序列SEQ ID NO:2相关信息(ⅰ)序列特征(A)长度7个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅴ)片段类型内部序列(ⅵ)来源(A)生物Hyphozyma sp.
(B)株系CBS648.91(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:Asp Trp Ala Lys Trp Leu Ser1 5(2)序列SEQ ID NO:3相关信息(ⅰ)序列特征(A)长度28个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅴ)片段类型内部序列(ⅵ)来源(A)生物Hyphozyma sp.
(B)株系CBS648.91(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:Asp Gly Arg Xaa Glu Thr Ala Asn Gln Arg Gly Thr Gly Gly Leu Leu1 5 10 15Gln Leu Ala Glu Tyr Ile Ala Gly Leu Ser Gly Gly20 25(2)序列SEQ ID NO:4相关信息(ⅰ)序列特征(A)长度36个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅴ)片段类型内部序列(ⅵ)来源(A)生物Hyphozyma sp.
(B)株系CBS648.91(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:Asp Leu Glu Ser Asn Leu Ile Val Pro Glu Asp Gly Lys Val Ser Phe1 5 10 15Tyr Ala Ser Ile Leu Ala Ala Val Ala Gly Lys Arg Asn Glu Gly Tyr20 25 30Gln Thr Ser Leu35(2)序列SEQ ID NO:5相关信息(ⅰ)序列特征(A)长度41个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅴ)片段类型内部序列(ⅵ)来源(A)生物Hyphozyma sp.
(B)株系CBS648.91(ⅴ)序列描述SEQ ID NO:5:Asp Glu Arg Glu Pro Gly Glu Leu Ile Ile Pro Arg Xaa Thr Thr Ile1 5 10 15Trp Glu Phe Asn Pro Tyr Glu Phe Gly Ser Trp Asn Pro Xaa Val Ser20 25 30Ala Phe Ile Pro Ile Glu Ile Leu Gly35 40(2)序列SEQ ID NO:6相关信息(ⅰ)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅴ)片段类型内部序列(ⅵ)来源(A)生物Hyphozyma sp.
(B)株系CBS648.91(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:Asp Val Ser Leu Val Pro Asn Pro Phe Tyr Gly Tyr Val Gly Glu1 5 10 15(2)序列SEQ ID NO:7相关信息(ⅰ)序列特征
(A)长度30个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅴ)片段类型内部序列(ⅵ)来源(A)生物Hyphozyma sp.
(B)株系CBS648.91(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7Asp Val Thr Asn Trp Pro Xaa Ala Ser Ala Leu Tyr Gln Thr Ser Leu1 5 10 15Arg Ala Gln Tyr Pro Thr Tyr Ser Gln Tyr Ala Phe Pro Val20 25 30(2)序列SEQ ID NO:8相关信息(ⅰ)序列特征(A)长度31个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅴ)片段类型内部序列(ⅵ)来源(A)生物Hyphozyma sp.
(B)株系CBS648.91(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:Asp Thr Ser Phe Xaa Gly Thr Lys Thr Pro Ile Ile Val Tyr Met Pro1 5 10 15Ser Tyr Pro Tyr Ala Ala Phe Ala Asp Thr Ser Thr Phe Lys Leu20 25 30(2)序列SEQ ID NO:9相关信息(ⅰ)序列特征(A)长度1870个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅲ)假设无(ⅳ)反义无(ⅴ)片段类型N-末端(ⅵ)来源(A)生物Hyphozyma sp.
(B)株系CBS648.91(ⅸ)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置214..1869(ⅸ)特征(A)名称/关键词mat_peptide(B)位置442..1869(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9:GGCGAGTGCA CAAGGCCGCG GACCAAATGT CCCTGAGTGC GTGTGTTTGT GTGTGACATA60GCCAGCAGAA TGCAGCTTAC TCTTCTTCCA TTGTGAGACG TTATATACCC ACACACATCT 120CGCCGTCCCG TCAGACCCTT CTGCATCCGT CCGTACGAAC CTGCTCTCTT CCATTTACCT 180CGACACTGTA TCGAGTGCAC GCTTCGAGGC ATC ATG AAG CTG CCG CTC CTC TCT234
Met Lys Leu Pro Leu Leu Ser-76 -75 -70ACG CTG CTC AGC CTC GCG CTG ACC GCC TCG ACC GTC GTC CGT GCC TAT282Thr Leu Leu Ser Leu Ala Leu Thr Ala Ser Thr Val Val Arg Ala Tyr-65 -60 -55CCC TCC ATC CCG GCG CAG CTC ACC GAA GAC GAG ATC ACC CGC ATC AGC330Pro Ser Ile Pro Ala Gln Leu Thr Glu Asp Glu Ile Thr Arg Ile Ser-50 -45 -40CAG CTC TCC CAG GAG GAC AAG GTC AAG TTT GCC GAA CGC ATC CTA GAG378Gln Leu Ser Gln Glu Asp Lys Val Lys Phe Ala Glu Arg Ile Leu Glu-35 -30 -25ATT CGC ACC GCC TAC GAG TAT GAG AAG CAG CAG CTA GCC CGT CAA CAT426Ile Arg Thr Ala Tyr Glu Tyr Glu Lys Gln Gln Leu Ala Arg Gln His-20 -15 -10GCG CTC GAG CGA CGC GCC TCG CCC TCG GGC TCG TAC GCA CCT GCC AAC474Ala Leu Glu Arg Arg Ala Ser Pro Ser Gly Ser Tyr Ala Pro Ala Asn-5 1 5 10ATG CCC TGC CCC CAG CGA ACG TCC CAG CAG GGT CCC GGC TTC ATC CGA522Met Pro Cys Pro Gln Arg Thr Ser Gln Gln Gly Pro Gly Phe Ile Arg15 20 25CCC GCC AAG ACC AAG CAG CTC TCA ATC TCG GAA GCC GAC TAT GTC TCG570Pro Ala Lys Thr Lys Gln Leu Ser Ile Ser Glu Ala Asp Tyr Val Ser30 35 40CGC CGC CGC ACC AAC ACC CAG GCC GAC TGG GCC AAG TGG CTC TCG GAC618Arg Arg Arg Thr Asn Thr Gln Ala Asp Trp Ala Lys Trp Leu Ser Asp45 50 55TCG GCC AAG CTC AAC AGC AGC CTG CCC GGC GGT GCC TCC AAC TAC ACC666Ser Ala Lys Leu Asn Ser Ser Leu Pro Gly Gly Ala Ser Asn Tyr Thr60 65 70 75TCG TCG ACC GAC CGC GTG CCT CGT CTG GGC TTT GCG CTC AGC GGC GGT714Ser Ser Thr Asp Arg Val Pro Arg Leu Gly Phe Ala Leu Ser Gly Gly80 85 90GGA CTG CGT GCC ATG CTC GTT GGT TCG GGC ACG CTC CAG GGC TTT GAC762Gly Leu Arg Ala Met Leu Val Gly Ser Gly Thr Leu Gln Gly Phe Asp95 100 105GGC CGC AAC GAG ACC GCC AAC CAG CGT GGC ACC GGT GGA CTG CTC CAG810Gly Arg Asn Glu Thr Ala Asn Gln Arg Gly Thr Gly Gly Leu Leu Gln110 115 120CTT GCC GAG TAC ATT GCC GGC CTG TCC GGC GGC TCG TGG GCG ACC GCC858Leu Ala Glu Tyr Ile Ala Gly Leu Ser Gly Gly Ser Trp Ala Thr Ala125 130 135AGT CTC ACC ATG AAC AAC TGG GCC ACC ACC CAG TCG CTC AAG GAC AAC906Ser Leu Thr Met Asn Asn Trp Ala Thr Thr Gln Ser Leu Lys Asp Asn140 145 150 155ATC TGG GAT CTC GAG TCC AAC CTC ATC GTC CCC GAG GAC GGC AAG GTC954Ile Trp Asp Leu Glu Ser Asn Leu Ile Val Pro Glu Asp Gly Lys Val160 165 170TCG TTT TAC GCC TCG ATC CTG GCC GCC GTC GCG GGC AAG AGG AAC GAA 1002Ser Phe Tyr Ala Ser Ile Leu Ala Ala Val Ala Gly Lys Arg Asn Glu175 180 185GGT TAC CAG ACC AGT CTC ACC GAC TAC TTT GGC CTC TCG ATC GCC GAC 1050Gly Tyr Gln Thr Ser Leu Thr Asp Tyr Phe Gly Leu Ser Ile Ala Asp190 195 200AAG ATT CTC AAC GGC TCC ATG TAC GGC AAC AAG TTC AGC GTC GAG TGG 1098Lys Ile Leu Asn Gly Ser Met Tyr Gly Asn Lys Phe Ser Val Glu Trp205 210 215AGC GAC GTC AAG AAT ACG TCC AAG TTC ACC GAT GCC TCC ATG CCG TTC 1146Ser Asp Val Lys Asn Thr Ser Lys Phe Thr Asp Ala Ser Met Pro Phe220 225 230 235CCC ATC ATT ATT GCC GAC GAG CGC GAG CCC GGC GAG CTC ATC ATC CCG 1194Pro Ile Ile Ile Ala Asp Glu Arg Glu Pro Gly Glu Leu Ile Ile Pro240 245 250CGC AAC ACC ACC ATC TGG GAG TTC AAC CCG TAC GAG TTC GGT TCT TGG 1242Arg Asn Thr Thr Ile Trp Glu Phe Asn Pro Tyr Glu Phe Gly Ser Trp255 260 265AAC CCC AAT GTT TCG GCT TTC ATC CCC ATC GAG ATC CTC GGC TCG AGT 1290Asn Pro Asn Val Ser Ala Phe Ile Pro Ile Glu Ile Leu Gly Ser Ser270 275 280CTG GAC AAC GGC ACC AGC GTC CTG CCC GAC GGC GTC TGT GTC GGC GGA 1338Leu Asp Asn Gly Thr Ser Val Leu Pro Asp Gly Val Cys Val Gly Gly285 290 295TAC GAG ACC GTT GCC TGG GTG ACT GGC ACC TCG GCG ACT CTG TTC TCT 1386Tyr Glu Thr Val Ala Trp Val Thr Gly Thr Ser Ala Thr Leu Phe Ser300 305 310 315GGT CTG TAC CTC GAA CTT ATC TCG ACC TCG AGC AAC AAC ATC ATC GTC 1434Gly Leu Tyr Leu Glu Leu Ile Ser Thr Ser Ser Asn Asn Ile Ile Val320 325 330GAT GCG CTC AAG GAG ATT GCC CAG GCG GTA TCA AAC GAG CAG AAC GAT 1482Asp Ala Leu Lys Glu Ile Ala Gln Ala Val Ser Asn Glu Gln Asn Asp335 340 345GTC TCG CTC GTG CCC AAC CCG TTC TAC GGC TAC GTC GGC GAA GGC GAC 1530Val Ser Leu Val Pro Asn Pro Phe Tyr Gly Tyr Val Gly Glu Gly Asp350 355 360GTC CAA GTG TCG GAC CTG CGC AAT ATT ACG CTC GTC GAT GGT GGT CTC 1578Val Gln Val Ser Asp Leu Arg Asn Ile Thr Leu Val Asp Gly Gly Leu365 370 375GAC AAC GAG AAT GTG CCA CTC TGG CCG CTT GTC GAG CCG GCG CGC GAT 1626Asp Asn Glu Asn Val Pro Leu Trp Pro Leu Val Glu Pro Ala Arg Asp380 385 390 395CTG GAC GTG ATC ATC GCC ATT GAC AGC TCG GCG GAC GTG ACC AAC TGG 1674Leu Asp Val Ile Ile Ala Ile Asp Ser Ser Ala Asp Val Thr Asn Trp400 405 410CCG AAC GCG TCG GCG CTG TAC CAG ACG TCG CTG CGT GCT CAG TAC CCG 1722Pro Asn Ala Ser Ala Leu Tyr Gln Thr Ser Leu Arg Ala Gln Tyr Pro415 420 425ACC TAT AGC CAG TAC GCG TTC CCG GTG ATG CCG GAC ACC AAC ACG GTG 1770Thr Tyr Ser Gln Tyr Ala Phe Pro Val Met Pro Asp Thr Asn Thr Val430 435 440GTC AAC CGC GGC CTC AAC ACG CGC CCC GTG TTC TAC GGC TGC AAT GCG 1818Val Asn Arg Gly Leu Asn Thr Arg Pro Val Phe Tyr Gly Cys Asn Ala445 450 455ACC GTC AAC GTC ACC AAC GCG GAT ACG TCG TTC AAC GGC ACC AAG ACG 1866Thr Val Asn Val Thr ASn Ala Asp Thr Ser Phe Asn Gly Thr Lys Thr460 465 470 475CCA A 1870Pro(2)序列SEQ ID NO:10相关信息(ⅰ)序列特征(A)长度552个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述sEQ ID NO:10:Met Lys Leu Pro Leu Leu Ser Thr Leu Leu Ser Leu Ala Leu Thr Ala-76 -75 -70 -65Ser Thr Val Val Arg Ala Tyr Pro Ser Ile Pro Ala Gln Leu Thr Glu-60 -55 -50 -45Asp Glu Ile Thr Arg Ile Ser Gln Leu Ser Gln Glu Asp Lys Val Lys-40 -35 -30Phe Ala Glu Arg Ile Leu Glu Ile Arg Thr Ala Tyr Glu Tyr Glu Lys-25 -20 -15Gln Gln Leu Ala Arg Gln His Ala Leu Glu Arg Arg Ala Ser Pro Ser-10 -5 1Gly Ser Tyr Ala Pro Ala Asn Met Pro Cys Pro Gln Arg Thr Ser Gln5 10 15 20Gln Gly Pro Gly Phe Ile Arg Pro Ala Lys Thr Lys Gln Leu Ser Ile25 30 35Ser Glu Ala Asp Tyr Val Ser Arg Arg Arg Thr Asn Thr Gln Ala Asp40 45 50Trp Ala Lys Trp Leu Ser Asp Ser Ala Lys Leu Asn Ser Ser Leu Pro55 60 65Gly Gly Ala Ser Asn Tyr Thr Ser Ser Thr Asp Arg Val Pro Arg Leu70 75 80Gly Phe Ala Leu Ser Gly Gly Gly Leu Arg Ala Met Leu Val Gly Ser85 90 95 100Gly Thr Leu Gln Gly Phe Asp Gly Arg Asn Glu Thr Ala Asn Gln Arg105 110 115Gly Thr Gly Gly Leu Leu Gln Leu Ala Glu Tyr Ile Ala Gly Leu Ser120 125 130Gly Gly Ser Trp Ala Thr Ala Ser Leu Thr Met Asn Asn Trp Ala Thr135 140 145Thr Gln Ser Leu Lys Asp Asn Ile Trp Asp Leu Glu Ser Asn Leu Ile150 155 160Val Pro Glu Asp Gly Lys Val Ser Phe Tyr Ala Ser Ile Leu Ala Ala165 l70 175 180Val Ala Gly Lys Arg Asn Glu Gly Tyr Gln Thr Ser Leu Thr Asp Tyr185 190 195Phe Gly Leu Ser Ile Ala Asp Lys Ile Leu Asn Gly Ser Met Tyr Gly200 205 210Asn Lys Phe Ser Val Glu Trp Ser Asp Val Lys Asn Thr Ser Lys Phe215 220 225Thr Asp Ala Ser Met Pro Phe Pro Ile Ile Ile Ala Asp Glu Arg Glu230 235 240Pro Gly Glu Leu Ile Ile Pro Arg Asn Thr Thr Ile Trp Glu Phe Asn245 250 255 260Pro Tyr Glu Phe Gly Ser Trp Asn Pro Asn Val Ser Ala Phe Ile Pro265 270 275Ile Glu Ile Leu Gly Ser Ser Leu Asp Asn Gly Thr Ser Val Leu Pro280 285 290Asp Gly Val Cys Val Gly Gly Tyr Glu Thr Val Ala Trp Val Thr Gly295 300 305Thr Ser Ala Thr Leu Phe Ser Gly Leu Tyr Leu Glu Leu Ile Ser Thr310 315 320Ser Ser Asn Asn Ile Ile Val Asp Ala Leu Lys Glu Ile Ala Gln Ala325 330 335 340Val Ser Asn Glu Gln Asn Asp Val Ser Leu Val Pro Asn Pro Phe Tyr345 350 355Gly Tyr Val Gly Glu Gly Asp Val Gln Val Ser Asp Leu Arg Asn Ile360 365 370Thr Leu Val Asp Gly Gly Leu Asp Asn Glu Asn Val Pro Leu Trp Pro375 380 385Leu Val Glu Pro Ala Arg Asp Leu Asp Val Ile Ile Ala Ile Asp Ser390 395 400Ser Ala Asp Val Thr Asn Trp Pro Asn Ala Ser Ala Leu Tyr Gln Thr405 410 415 420Ser Leu Arg Ala Gln Tyr Pro Thr Tyr Ser Gln Tyr Ala Phe Pro Val425 430 435Met Pro Asp Thr Asn Thr Val Val Asn Arg Gly Leu Asn Thr Arg Pro440 445 450Val Phe Tyr Gly Cys Asn Ala Thr Val Asn Val Thr Asn Ala Asp Thr455 460 465Ser Phe Asn Gly Thr Lys Thr Pro470 475(2)序列SEQ ID NO:11相关信息(ⅰ)序列特征(A)长度573个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型多肽(ⅴ)片段类型氨基末端(ⅵ)来源(A)生物Hyphozyma sp.
(B)株系CBS648.91(ⅸ)特征(A)名称/关键词蛋白质(B)位置1..497(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:11:Met Lys Leu Pro Leu Leu Ser Thr Leu Leu Ser Leu Ala Leu Thr Ala-75 -70 -65Ser Thr Val Val Arg Ala Tyr Pro Ser Ile Pro Ala Gln Leu Thr Glu-60 -55 -50 -45Asp Glu Ile Thr Arg Ile Ser Gln Leu Ser Gln Glu Asp Lys Val Lys-40 -35 -30Phe Ala Glu Arg Ile Leu Glu Ile Arg Thr Ala Tyr Glu Tyr Glu Lys-25 -20 -15Gln Gln Leu A la Arg Gln His Ala Leu Glu Arg Arg Ala Ser Pro Ser-10 -5 1Gly Ser Tyr Ala Pro Ala Asn Met Pro Cys Pro Gln Arg Thr Ser Gln5 10 15 20Gln Gly Pro Gly Phe Ile Arg Pro Ala Lys Thr Lys Gln Leu Ser Ile25 30 35Ser Glu Ala Asp Tyr Val Ser Arg Arg Arg Thr Asn Thr Gln Ala Asp40 45 50Trp Ala Lys Trp Leu Ser Asp Ser Ala Lys Leu Asn Ser Sar Leu Pro55 60 65Gly Gly Ala Ser Asn Tyr Thr Ser Ser Thr Asp Arg Val Pro Arg Leu70 75 80Gly Phe Ala Leu Ser Gly Gly Gly Leu Arg Ala Met Leu Val Gly Ser85 90 95 100Gly Thr Leu Gln Gly Phe Asp Gly Arg Asn Glu Thr Ala Asn Gln Arg105 110 115Gly Thr Gly Gly Leu Leu Gln Leu Ala Glu Tyr Ile Ala Gly Leu Ser120 125 130Gly Gly Ser Trp Ala Thr Ala Ser Leu Thr Met Asn Asn Trp Ala Thr135 140 145Thr Gln Ser Leu Lys Asp Asn Ile Trp Asp Leu Glu Ser Asn Leu Ile150 155 160Val Pro Glu Asp Gly Lys Val Ser Phe Tyr Ala Ser Ile Leu Ala Ala165 170 175 180Val Ala Gly Lys Arg Asn Glu Gly Tyr Gln Thr Ser Leu Thr Asp Tyr185 190 195Phe Gly Leu Ser Ile Ala Asp Lys Ile Leu Asn Gly Ser Met Tyr Gly200 205 210Asn Lys Phe Ser Val Glu Trp Ser Asp Val Lys Asn Thr Ser Lys Phe215 220 225Thr Asp Ala Ser Met Pro Phe Pro Ile Ile Ile Ala Asp Glu Arg Glu230 235 240Pro Gly Glu Leu Ile Ile Pro Arg Asn Thr Thr Ile Trp Glu Phe Asn245 250 255 260Pro Tyr Glu Phe Gly Ser Trp Asn Pro Asn Val Ser Ala Phe Ile Pro265 270 275Ile Glu Ile Leu Gly Ser Ser Leu Asp Asn Gly Thr Ser Val Leu Pro280 285 290Asp Gly Val Cys Val Gly Gly Tyr Glu Thr Val Ala Trp Val Thr Gly295 300 305Thr Ser Ala Thr Leu Phe Ser Gly Leu Tyr Leu Glu Leu Ile Ser Thr310 315 320Ser Ser Asn Asn Ile Ile Val Asp Ala Leu Lys Glu Ile Ala Gln Ala325 330 335 340Val Ser Asn Glu Gln Asn Asp Val Ser Leu Val Pro Asn Pro Phe Tyr345 350 355Gly Tyr Val Gly Glu Gly Asp Val Gln Val Ser Asp Leu Arg Asn Ile360 365 370Thr Leu Val Asp Gly Gly Leu Asp Asn Glu Asn Val Pro Leu Trp Pro375 380 385Leu Val Glu Pro Ala Arg Asp Leu Asp Val Ile Ile Ala Ile Asp Ser390 395 400Ser Ala Asp Val Thr Asn Trp Pro Asn Ala Ser Ala Leu Tyr Gln Thr405 410 415 420Ser Leu Arg Ala Gln Tyr Pro Thr Tyr Ser Gln Tyr Ala Phe Pro Val425 430 435Met Pro Asp Thr Asn Thr Val Val Asn Arg Gly Leu Asn Thr Arg Pro440 445 450Val Phe Tyr Gly Cys Asn Ala Thr Val Asn Val Thr Asn Ala Asp Thr455 460 465Ser Phe Asn Gly Thr Lys Thr Pro Ile Ile Val Tyr Met Pro Ser Tyr470 475 480Pro Tyr Ala Ala Phe Ala Asp Thr Ser Thr Phe Lys Leu485 490 495(2)序列SEQ ID NO:12相关信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核酸(ⅸ)特征(A)名称/关键词modified_base(B)位置3..18(D)其它资料mod_base=OTHER/note=″deoxyinosine″(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:12:GCNCCNGCNA AYATGCCNTG 20(2)序列SEQ ID NO:13相关信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核酸(ⅸ)特征(A)名称/关键词modified_base(B)位置6(D)其它资料mod_base=OTHER/note=″deoxyinosine″(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:13:TCGTANGGGT TRAAYTCCCA 20(2)序列SEQ ID NO:14相关信息(ⅰ)序列特征(A)长度17个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:14:CCATGCTCGT TGGTTCG 17(2)序列SEQ ID NO:15相关信息(ⅰ)序列特征(A)长度17个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其它核酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:15:GGCATGTAGA CGATGAT1权利要求
1．一种磷脂酶，其a)能够水解磷脂中的两个脂酰基团，b)来自于Hyphozyma的一个株系，c)在pH3-4经10分钟测得最佳温度为50℃左右，并且d)在40℃经10分钟测得最佳pH为pH3左右。
2．一种磷脂酶，其a)能够水解磷脂中的两个脂酰基团，b)是一种多肽，其包含的N末端氨基酸序列是序列SEQ IDNO:11的第1-497位所示序列，或与之有至少50％的同一性。
3．一种磷脂酶，其a)能够水解磷脂中的两个脂酰基团，b)是一种多肽，其包含与序列SEQ ID NO:1-8所示氨基酸序列有至少50％同一性的氨基酸序列。
4．权利要求2或3的磷脂酶，其中所述序列同一性为至少60％，优选至少70％，更优选至少80％，最优选至少90％。
5．前述任一权利要求的磷脂酶，其来自于Hyphozyma sp.株系CBS 648.91。
6．前述任一权利要求的磷脂酶，其基本上无脂酶活性。
7．编码权利要求2的磷脂酶的DNA序列。
8．前一权利要求的DNA序列，其包含SEQ ID NO:9中第457-1870位所示序列。
9．一种生产磷脂酶的方法，包括在适宜的营养培养基中培养可产生磷脂酶的Hyphozyma株系，以及随后回收磷脂酶。
10．前一权利要求的方法，其中所述株系为Hyphozyma sp.株系CBS 648.91。
11．权利要求9或10的方法，其中的回收步骤包括除去脂酶活性的分离过程。
12．一种生产磷脂酶的方法，包括a)从可产生磷脂酶的Hyphozyma株系中分离编码磷脂酶的DNA序列，b)在合适的载体上将该DNA片段连上合适的表达信号，c)用该载体转化合适的异源宿主生物体，d)在可导致磷脂酶表达的条件下培养经转化的宿主生物体，和e)从培养基中回收磷脂酶。
13．前一权利要求的方法，其中的宿主生物体是真核细胞，特别为真菌细胞，例如酵母细胞或丝状真菌细胞，优选曲霉属、镰孢属、木霉属或酵母属的株系，最优选黑曲霉、米曲霉、禾本科镰孢，接骨木镰孢、淀粉镰孢或酿酒酵母。
14．权利要求12或13的方法，其中的DNA序列是通过包含下述步骤的一种方法分离得到的a)将可产生磷脂酶的Hyphozyma株系的cDNA文库克隆到合适的载体中，b)用所述载体转化合适的酵母宿主细胞，c)在合适的条件下培养已转化了的酵母宿主细胞以表达磷脂酶，d)通过检测步骤(c)中表达的磷脂酶活性来筛选阳性克隆。
15．权利要求12-14中任一项的方法，其中的Hyphozyma株系是Hyphozyma sp.株系CBS648.91。
16．一种水解磷脂或溶血磷脂中脂酰基团的方法，包括用权利要求1-6中任一项的磷脂酶处理所述磷脂或溶血磷脂。
17．前一权利要求的方法，其中的磷脂或溶血磷脂包括卵磷脂或溶血卵磷脂。
18．权利要求16或17的方法，其中的处理是在pH1.5-5(优选pH2-4),30-70℃的条件下进行的。
19．权利要求16-18中任一项的方法，它是用来提高含有磷脂之糖源的水溶液或悬浮液的滤过性的一种方法。
20．前一权利要求的方法，其中所述溶液或悬浮液含有淀粉水解产物，特别是小麦淀粉水解产物。
21．权利要求16-18中任一项的方法，它是一种用于制备面包的方法，包括将磷脂酶加入生面配料中，揉面和烘焙面团以制备面包。
22．权利要求16-18中任一项的方法，它是一种用来降低食用油中磷脂含量的方法，包括用磷脂酶处理油脂以水解大部分磷脂，以及将含已水解磷脂的水相与油脂分离。
23．从食用油中除去磷脂的方法，包括a)通过在pH1.5-3的条件下，将具有在所述pH水解完整磷脂能力的磷脂酶的水溶液分散液处理油脂，以水解大部分磷脂，和b)将含已水解磷脂的水相与油脂分离。
24．前一权利要求的方法，其中的油脂在用磷脂酶处理之前还进行处理以除去粘质。
25．权利要求23或24的方法，其中用磷脂酶处理前的油脂中含有磷脂的量相当于50-250ppm磷。
26．权利要求23-25中任一项的方法，其中的磷脂酶是权利要求1-6中任一项的磷脂酶。
27．权利要求23-26中任一项的方法，其中的磷脂酶处理是在30-45℃，磷脂酶用量为O.1-10毫克/升，存在0.5-5％的水的情况下进行1-12小时的。
全文摘要
从Hyphozyma属的一个株系中获得一种酸性磷脂酶。它能够水解完整磷脂中的两个脂酰基团。有利之处在于,它无脂酶活性,而且在非常低的pH下也有活性;这些特性使得它非常适用于油脂脱胶,因为此时油脂的酶促及碱性水解(皂化)都受到抑制。该磷脂酶为非膜结合型,使其适于商业生产和纯化。
文档编号C12R1/645GK1235636SQ9719932
公开日1999年11月17日 申请日期1997年10月30日 优先权日1996年10月31日
发明者桥田妙子, 堤纪子, T·豪奇尔, M·A·斯特林格 申请人:诺沃挪第克公司 被以下专利引用 (2),