隔孢伏革菌植酸酶的制作方法

专利名称：隔孢伏革菌植酸酶的制作方法
发明的领域本发明涉及表现有植酸酶活性的分离的多肽、相应的克隆的DNA序列、制备该多肽的方法，及其在许多工业用途中，特别是在动物饲料中的应用。
发明的背景植酸或1,2,3,4,5,6-六磷酸二氢肌醇(或简称六磷酸肌醇)是植物种子中肌醇的主要来源和磷酸盐的主要储存形式。事实上，它是在种子和谷粒成熟期间天然形成的。在豆荚的种子中，其总计占磷酸盐含量的大约70％，并且在结构上是作为植酸钙镁，即肌醇的混合的钾、镁和钙盐与蛋白体整合的。种子、谷粒和豆荚是食物和饲料制品，特别是动物饲料制品的重要成分。而且在人类食物中，谷物和豆类荚果变得越来越重要。
植酸的磷酸盐部分与二价和三价阳离子，如金属离子，特别是营养上必需的钙、铁、锌和镁以及微量矿质元素锰、铜和钼离子螯合。
此外，植酸还在一定程度上借助静电相互作用与蛋白质结合。在pH低于蛋白质的等电点pI时，带正电荷的蛋白质直接与植酸盐结合。在pH高于pI时，带负电荷的蛋白质通过金属离子与植酸盐结合。
植酸和其盐，即植酸盐因为不能在胃肠系统中吸收，所以常常不被代谢，即其三价磷、螯合的金属离子，以及所结合的蛋白质均不能是营养上可利用的。可是，鉴于磷是所有生物体生长的必要元素，所以食物和饲料制品中必需添加无机磷酸盐。另外还常常要添加铁和钙等营养上必不可少的离子。再者，由于食物中的蛋白质被植酸结合，所以也导致其营养价值降低。因此，常常将植酸称为抗营养因子。
还有，由于植酸不被代谢，使植酸磷通过动物胃肠道亦随粪便一起排泄，从而导致环境中的过度磷酸盐污染，例如使水环境富营养化和水藻的广泛生长。
除特别指出者外，术语植酸或植酸盐在本说明书中作为同义词或者随意地使用，都是可被植酸酶降解的。
在含有植酸的大多数植物种子中，也发现有内源性植酸酶。这些酶是在种子发芽期间形成的，并适用于释放磷酸盐和在植物生长期间作为终产物使用的游离肌醇的目的。
当被消化后，食物或饲料成分植酸盐在理论上可被种子的内源性植物植酸酶、来源于消化道微生物菌群的植酸酶以及肠粘膜植酸酶水解。但在实际上，内源性植物植酸酶和肠粘膜植酸酶的水解能力，即使有也远不是以明显地增加植酸盐的结合或组成成分的生物可利用性。如果在制备食品或饲料的工艺中包括萌发、发酵或浸渍过程，则内源性植酸酶可在较大程度上降解植酸盐。
在马和牛等反刍或多胃动物体内，胃肠道系统中寄生有能够降解植酸的微生物。但人、家禽和猪等单胃动物则不是这样。因此，就这些单胃动物来说上述问题就显得特别重要。
已报导了植物及微生物可产生植酸酶。在微生物中，产生植酸酶的细菌及产生植酸酶的真菌都是已知的。
在植物界，麦麸植酸酶是已知的(Thomlinson等人，生物化学，1(1962),166-171)。Barrientos等人(植物生理学，106(1994),1489-1495)已描述了源自百合花花粉的碱性植酸酶。
就细菌来说，已描述了衍生于枯草芽孢杆菌(Paver和Jagannathan,1982，细菌学杂志151:1102-1108)和假单胞菌属(Cosgrove,1970，澳大利亚生物科学杂志23:1207-1220)的植酸酶。另外，Greiner等人(生物化学与生物物理文献，303,107-113,1993)已纯化并定性了大肠杆菌的植酸酶。但这种酶可能是酸性磷酸酶。
也描述了产生植酸酶的酵母，例如酿酒酵母(Nayini等人，1984,Lebensmittel Wissenschaft und Technologie17:24-26)。但这种酶可能是肌醇一磷酸酶(Wodzinski等人，应用微生物学进展(Adv.Appl.Microbiol.),42:263-303)。AU-A-24840/95描述了许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)植酸酶的克隆和表达。
有几篇报导描述了产生植酸酶的丝状真菌，但只是属于真菌的子囊菌门(子囊菌)。具体地说，有几篇参考文献涉及曲霉属如土曲霉的产生植酸酶的子囊菌(Yamada等人，1996，农业生物化学322:1275-1282)。另外还描述了黑曲霉awamori变种中植酸酶基因的克隆和表达(Piddington等人，1993，基因133:55-62)。EP0420358描述了得自无花果曲霉(黑曲霉)的植酸酶的克隆和表达。EP0684313描述了子囊菌嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)和土曲霉(A.ferreus)的植酸酶的克隆和表达。植酸酶的命名和位置特异性在本文中，植酸酶是指催化植酸(六磷酸肌醇)水解成(1)肌醇和/或(2)其一、二、三、四和/或五磷酸盐，及(3)无机磷酸盐的酶。下文中，有时将上述化合物分别简称为IP6、I、IP1、IP2、IP3、IP4、IP5和P。这意味着通过植酸酶的作用IP6被降解成P+一种或多种成分IP5、IP4、IP3、IP2、IP1和I。或者，携带总共n个连接到位置p、q、r,……上的磷酸基团的肌醇被表示为Ins(p、q、r,…)Pn。为方便起见，将Ins(1、2、3、4、5、6)P6(植酸)缩写为PA。
根据酶命名数据库ExPASy(相对于原先基于国际生物化学与分子生物学联合会(IUBMB)的命名委员会所推荐的酶命名给出的信息库，命名中提供了每种类型已鉴定的酶的EC(酶委员会)编号)，已知有两种不同类型的植酸酶所谓的3-植酸酶(六磷酸肌醇3-磷酸水解酶，EC3.1.3.8)和所谓的6-植酸酶(六磷酸肌醇6-磷酸水解酶，EC3.1.3.26)。3-植酸酶首先水解3位上的酯键，而6-植酸酶则首先水解6位上的酯键。磷酸肌醇命名考虑到作用于植酸的植酸酶的初级水解产物，所得到的酯有些是非对映体，有些则是对映体。一般说来，很容易区别不同的非对映体，因为它们具有不同的物理性质；而对映体则彼此是呈镜像结构的，所以很难辨别。
因此，Ins(1,2,4,5,6)P5(除去了3-磷酸)和Ins(1,2,3,4,5)P5(除去了6-磷酸)是非对映体并且易于分辨，而Ins(1,2,4,5,6)P5(除去了3-磷酸)和Ins(2,3,4,5,6)P5(除去了1-磷酸)则是对映体。Ins(1,2,3,4,5,)P5(除去了6-磷酸)和Ins(1,2,3,4,5)P5(除去了4-磷酸)同样是这种情况。因此，从植酸酶催化的水解植酸的第一步得到的6种五磷酸酯中，只能容易地分辨其中已除去了2-、3-、5和6-磷酸的酯，即只得到四种非对映体，其余两种酯中每个都是这些化合物之一的对映体(如1-和3-一样，4-和6-也是对映体)。最低位标规则的使用应提到的是，当使用代号Ins(2,3,4,5,6)P5和Ins(1,2,3,4,5,6)P5时，已放宽了以前推荐的肌醇原子编号。对最低位标规则的放宽是由国际生物化学联合会的命名委员会推荐的(生物化学杂志(1989)258,1-2)，当时作者希望阐明结构关系。
在最低位标规则中，推荐L-和D-命名磷酸肌醇，即肌醇的磷酸酯，一般定名为1D(或IL-)Ins(r,s,t,u,w,x)Pn,n代表磷酸基团数，位标r、s、t、u、w和x则代表它们的位置。按照上文提到的国际生物化学联合会命名委员会(NC-IUB)的规定对各位置编号，使用1D和1L以便使取代基有可能的最低位标或编号(“最低位标规则”)。植酸酶特异性如上所说，按照植酸酶在初始水解步骤中的特异性，即按照其首先水解的磷酸酯基因来划分之。
关于已知植酸酶的特异性，一般植物植酸酶被说成是6-植酸酶，但百合花粉植酸酶一般被说成是5-植酸酶。微生物衍生的植酸酶主要是3-植酸酶。例如，上文提到的ExPASy数据库中把3-植酸酶看作是烟草泡盛曲霉(菌株ALK0243)和黑曲霉(菌株NRRL3135)的四种植酸酶(基因133:55-62(1993)和基因127:87-94(1993))。
在使用D-/L-符号的情况下(其中D-和L-构型是指1位)，麦麸植酸酶首先水解L-6位(=D-4)上的磷酸酯基团，而3-植酸酶则首先水解D-3位(=L-1)上的磷酸酯基团。
可按几种方法检查特异性，例如用HPLC或NMR光谱法。然而，这些方法并不能直接辨别D-6和L-6位上的例如磷酸酯基团的水解，因为水解产物D-Ins(1,2,3,4,5)P5和L-Ins(1,2,3,4,5)P5是对映体(镜像)，并因而具有相同的NMR光谱。
换句话说，本文中6-植酸酶是指L-6-或D-6-植酸酶或两者，即植酸酶是L-6-植酸酶、D-6-植酸酶或((D-6-)+(L6-))-植酸酶(有两者的活性)。其中字母有时也指定为D/L-6-植酸酶。
发明的概要本发明的目的是提供可代用的植酸酶，特别是具有较高的热稳定性或更快地从植酸中释放磷酸等优良性质，并可商品化生产的植酸酶。
本发明人已惊奇地发现，可从Stereales目，特别是隔孢伏革菌科，较好是隔孢伏革菌属的菌株，尤其是从菌株Peniophora lycii得到表现有植酸酶活性的酶，并已成功地克隆了编码所说的酶的DNA序列。序列表的SEQ ID No.1和2中分别列出了该DNA序列和推测的氨基酸序列。
如下文的实验部分中进一步概述的，已惊奇地发现这种新的植酸酶，特别是与已知的植酸酶(黑曲霉植酸酶，植酸酶Novo)相比，显著地加快了从植酸中初始释放三价磷的速度。这一点已在一个于pH3.5和pH5.5进行的相关玉米试验中及NMR研究中显示出来。
再者，已发现本发明的植酸酶具有明显不同的降解过程分布图。在pH3.5时它属于一类新的，对植酸的6-及3-位都表现有高初始亲和性的植酸酶，换句话说，其既不是3-植酸酶，也不是6-植酸酶，而是比迄今报导的任何已知植酸酶都有较小位置特异性的植酸酶。但在pH5.5时，它应被分类为6-植酸酶。
Peniophora lycii植酸酶的比活性处于很高的水平，即超过200，较好在400以上，特别是在600以上，更具体是在800以上，最好是大约100FYT/mg(参见实施例4a)。至少对于真菌植酸酶来说，这一点是出乎预料的(已知曲霉植酸酶的比活性只为大约180FYT/mg)。
Stereales目属于层担子菌的真菌纲和担子菌的真菌门。已知的产生植酸酶的真菌属于子囊菌门。
第一个方面，本发明涉及具有植酸酶活性的和具有SEQ ID NO2的氨基酸序列或其氨基酸序号31至439的序列，或至少与这些序列有70％同源性的氨基酸序列的分离的多肽。
再一个方面，本发明提供编码上述多肽的克隆的DNA序列，以及包含这些克隆的DNA序列的载体和宿主细胞。
在本发明的范围内，再一个方面涉及使用本发明的植酸酶从植酸中释放无机磷酸盐，及某些更具体的应用和组合物，特别是食品和饲料制品，以及包括本发明植酸酶的添加剂。
一般说来，本文所使用的术语和词句均按本领域惯例解释。但在有疑问的情况下，本说明书的定义可能是有用的。一般性定义词句“具有/表现有植酸酶活性的分离的多肽/酶”或“分离的植酸酶”是指具有植酸酶活性(参见下文)并基本上没有其他非植酸酶多肽的，例如用SDS-PAGE检测至少约20％纯，较好至少约40％纯，更好约80％纯，最好约90％纯，最好甚至约95％纯的任何肽或蛋白质。有时这样的多肽也可称为“纯化的”植酸酶。
“分离的多肽”的定义也包括融合的多肽或可裂解的融合多肽，其中另一种多肽在该多肽或其片段的N末端或C末端融合。融合的多肽是通过将编码另一种多肽的核酸序列(或其部分)与本发明的核酸序列(或其部分)融合而产生的。生产融合多肽的技术是本领域已知的，并且包括连接编码这些多肽的编码序列以便它们在读码内，并使融合多肽的表达处于同样启动子和终止子的控制下。
词句“表现有植酸酶活性的多肽或酶”或“植酸酶”可包括能够影响无机磷酸盐或三价磷从各种磷酸肌醇中释放的任何酶。这样的磷酸肌醇(植酸酶底物)的例子是植酸和其任何盐，如植酸钠或植酸钾或混合的盐。另外，肌醇的一、二、三、四或五磷酸酯的任何立体异构体也可作为植酸酶底物。
按照上述定义，可使用这些底物之一检测植酸酶活性。本文中(除特别指出者外)，以FYT单位确定植酸酶活性，一个FYT是指在下述条件下每分钟释放1μmol无机原磷酸盐所需的酶量pH5.5；温度37℃；底物浓度为0.0050mol/ml的植酸钠(C6H6O24P6Na12)。实验部分中描述了适当的植酸酶检测法。
“多肽同源性”或“氨基酸同源性”是指两个序列间的同一性程度。可借助本领域已知的计算机程序，例如GCG版本8程序包(ProgramManual for the Wisconsin Package,Version 8,Genetics ComputerGroup,575Science Drive,Madison,Wisconsin,USA53711)(Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.,(1970)，分子生物学杂志，48,443-453)中提供的GAP来确定同源性。使用有下列设置的GAP进行多肽序列比较5.0GAP创制补偿和0.3延伸补偿。
在本文中，术语“6-植酸酶”是指首先水解植酸中的6位或对这些位置(因为这一术语覆盖两个位置，故使用复数)有所偏爱。具体地说，第一步骤中的50％以上的水解产物是Ins(1,2,3,4,5)P5和/或Ins(1,2,3,5,6)P5。这两种化合物较好包括至少60％，更好至少70％，更好至少80％，特别是至少90％，并且最好95％以上的PA初始水解步骤的产物。
如“3-植酸酶”、“(3+6)-植酸酶”、“6D-植酸酶”和“6L-植酸酶”等其他特异性术语应作相应的解释，包括同样优选的实施方案。
目前认为短语“克隆到存在于保藏的大肠杆菌菌株中的质粒内的DNA序列的植酸酶编码部分”和“序列表中给出的相应DNA序列的植酸酶编码部分”有相同的意义，因此可以互换使用。
与DNA序列相关使用的术语“植酸酶编码部分”主要是指翻译成具有植酸酶活性多肽序列的DNA序列区域。其常常是第一个“ATG”起始密码子(在mRNA中上是“AUG”密码子)和跟在后面的终止密码子(“TAA”、“TAG”或“TGA”)之间的区域。
然而，如上所述翻译的多肽除表现有植酸酶活性的成熟多肽外，还常常包括有N末端信号序列和/或前肽序列。一般信号序列指导多肽的分泌，前肽指导多肽的折叠。有关更进一步的信息参见Egnell,P.等人，分子微生物学6(9):1115-19(1992)或Stryer,L.，“生物化学”W.H.,Freeman and Company/New York,ISBN0-7167-1920-7。因此，术语“植酸酶编码部分”也将包括相当于被翻译的多肽之成熟部分或每个这样的成熟部分(如果存在几个的话)的DNA序列。
此外，该定义还将包括编码仍保留某些植酸酶活性的多肽片段之DNA序列的任何片段。
克隆的DNA序列或者说“DNA构建物”、“DNA区段”或“分离的DNA序列”是指可按照用于遗传工程中的标准克隆方法克隆，以将DNA区段从其天然位置重新定位到其将被复制的不同位点的DNA序列。该术语一般是指基本上没有其他核酸序列的，即当用琼脂糖凝胶电泳法检测时可见至少约20％纯，较好至少约40％纯，更好约60％纯，特别是至少约80％纯，最好约90％纯，尤其是最好约95％纯的核酸序列。克隆方法可包括切割并分离包括编码多肽之核酸序列的所需核酸片段，将该片段插入到载体分子中，并将重组载体掺入到核酸序列的多拷贝或克隆将在其中复制的宿主细胞内。核酸序列可以是基因组的、cDNA、RNA、半合成的、合成来源的，或其任何联合来源的。
可借助本领域已知的计算机程序，例如GCG程序包(ProgramManual for the Wisconsin Package,Version8,August1996,GeneticsComputer Group,575Science Drive,Madison,Wisconsin,USA53711)(Needlaman,S.B.和Wunsch,C.D.,(1970)，分子生物学杂志，48，443-453)中提供的GAP确定两个核酸序列间的同一性或“同源性”程度。使用有下列设定的GAP进行DNA序列比较5.0GAP创制补偿和0.3GAP延伸补偿。
决定某特定DNA或RNA序列是否与特定核苷酸或寡核苷酸探针“杂交”的适当实验条件包括，在5×SSC(氯化钠/柠檬酸钠)(J.Sambrook,E.F.Fritsch，和T.Maniatis,1989，分子克隆，实验室手册，第2版，冷泉港，纽约)中预浸渍含有DNA片段或RNA的滤膜10分钟，以检查杂交并在5×SSC、5×Denhardt′s溶液(Sambrook等人，1989)、0.5％SDS和100μg/ml变性的超声处理的鲑精子DNA(Sambrook等人，1989)的混合液中预杂交，然后在含有10ng/ml随机引发的(Feinberg,A.P.和Vogelstein,B.(1983)分析生物化学132:6-13)、32P-dCTP标记的(比活性＞1×109cpm/μg)探针的同样溶液中，于大约45℃杂交12小时。
然后在2×SCC、0.5％SDS中，分别于至少55℃(低严格性)、至少60℃(中等严格性)、至少65℃(中等/高严格性)、至少70℃(高严格性)或至少75％(很高严格性)将滤膜洗两次。
使用X光胶片检测在这些条件下与寡核苷酸探针杂交的分子。
已发现，有可能在理论上推断两个给定的DNA序列是否能在某些特定条件下杂交。
因此，作为上述实验方法的可代用方法，可基于理论上计算两个异源DNA序列将在特定条件(例如关于阳离子浓度和温度)下与已知序列杂交的Tm(解链温度)，确定是否某类似的DNA序列将与上述核苷酸探针杂交。
为了确定异源DNA序列的解链温度(Tm(异))，有必要首先确定同源DNA序列的解链温度(Tm(同))。
可使用下列公式确定两条完全互补的DNA链(同源双链形成)之间的解链温度(Tm(同))，Tm(同)=81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L(参见“分子生物学当前方案”，John Wiley and Sons,1995)，其中“M”代表洗涤缓冲液中的阳离子摩尔浓度，“％GC”代表DNA序列中碱基总数的鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)百分比，“％form”代表洗涤缓冲液中的甲酰胺百分比，“L”代表DNA序列的长度。
按上述公式确定的Tm是两个完全互补的DNA序列间同源双链形成的Tm(Tm(同))。为了使Tm值适应两个异源DNA序列的Tm值，推测两个异源序列间核苷酸序列的1％差异相当于Tm降低1℃(“分子生物学当前方案”，John Willey and Sons,1995)。因此，可从Tm(同)中减去所研究的类似的序列间％同源性差异以求出异源双链形成所需的Tm(异)。按本文上述的方法计算将被减去的DNA同源性百分数(参见上文)。
术语“载体”将包括如“核酸构建物”、“DNA构建物”、“表达载体”或“重组载体”等这样一些术语/主题。
核酸构建物包括与一个或多个调控序列可操作地连接的本发明的核酸序列，所说的调控序列能够指导编码序列在与之相容的条件下在适当宿主细胞中表达。
“核酸构建物”在本文中定义为单链或双链的核酸分子，其为从天然基因中分离的，或已被修饰而含有以使之不再以天然形式存在的方式结合和相邻的核酸区段。
当核酸构建物含有表达本发明的编码序列所需的所有调控序列时，术语核酸构建物可以是与表达盒同义的。
本文限定的术语“编码序列”当置于上述调控序列控制下时，其主要含有被转录成mRNA并被翻译成本发明的多肽的序列。编码序列的边界基本上是由5′末端的翻译起始密码子ATG和3′末端的翻译终止密码子确定的。编码序列可包括但不只限于DNA、cDNA和重组核酸序列。
本文限定的术语“调控序列”包括为表达核酸序列中的编码序列所需要的所有成分。每个调控序列都可以是编码多肽的核酸序列所固有的或外源提供的。这样的调控序列包括但不只限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号序列和转录终止序列。调控序列最少包括启动子，和转录与翻译终止信号。可以与为导入特异性限制位点所需的接头一起提供调控序列，以利于调控序列与编码多肽之核酸序列的编码区相连接。
在表达载体中，编码植酸酶的DNA序列应可操作地连接到适当的启动子和终止子序列上。启动子可以是在选择的宿主细胞中表现有转录活性，并可衍生于编码同源或异源于宿主细胞之蛋白质的基因的任何DNA序列。用于连接编码植酸酶的DNA序列、启动子和终止子，以及将它们插入适当的载体的方法是本领域技术人员已知的(如参见Sambrook等人，1989，分子克隆，实验室手册，冷泉港，纽约)。
重组表达载体可以是能够方便地经受重组DNA处理步骤，并可引起核酸序列表达的任何载体(如质粒或病毒)。
可以将编码本发明多肽之核酸序列的一个以上的拷贝插入宿主细胞中，以扩增核酸序列的表达。可以使用本领域已知的方法将序列的至少一个附加拷贝整合到宿主细胞基因组中，并选择转化体，从而获得核酸序列的适当扩增。
用于连接上述各元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员已知的(如参见Sambrook等人，1989，上述文献)。
“宿主细胞”或“重组宿主细胞”包括亲代细胞的任何子代，由于其在复制期间发生突变而不同于亲代细胞。
较好用包括本发明的核酸序列的载体转化细胞，然后将载体整合到宿主染色体内。
“转化”是指将包括本发明之核酸序列的载体导入宿主细胞中，从而作为染色体的整合体或自身复制的染色体外载体保留之。一般认为整合作用是有利的，因为这样核酸序列更可能稳定地保留在细胞中。可以通过如上所述的同源或非同源重组使载体整合到宿主染色体内。
宿主细胞可以是单细胞微生物如原核细胞，或非单细胞微生物如真核细胞。真核细胞例如可以是哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞或真菌细胞。适用的哺乳动物细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、COS细胞或例如可从美国典型培养物保藏中心得到的其他无限增殖细胞系的任何成员。
在一优选实施方案中，宿主细胞是真菌细胞。本文中使用的术语“真菌”包括子囊菌门、担子菌门、壶菌门和接合菌门(如Hawksworth等人在Ainsworth和Bisby的真菌字典，第8版，1995,CAB International,大学出版社，Cambrige，英国中限定的)，以及卵菌门(如Hawksworth在上述文献中列出的)和所有的有丝分裂孢子真菌(Hawksworth等人，1995，上述文献)。还参见Julich,1981，担子菌的高级分类单位和Hansen&Knudsen(编辑)，Nordic Macromgcetes,Vol.2(1992)和3(1997)。
可使用原生质体形成，原生质体转化和细胞壁再生等已知方法转化真菌细胞。
优选的宿主细胞是镰孢霉属、木霉属或曲霉属的菌株，特别是禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、F.venenatum、F.cerealis、有镰孢霉ATCC20334的识别特征的菌种(如PCT/US/95/07743所述)、Trichoderma harzianum或T.reesei、黑曲霉或米曲霉。
附图简要说明在本发明的详细描述中必须参考下列附图

图1是隔孢伏革菌植酸酶的pH-活性曲线(5mM植酸盐，30分钟，37℃)；图2是其pH-稳定性曲线(40℃预保温1小时)；图3是其温度-活性曲线(0.1M乙酸钠、5mM植酸盐，pH5.5,30分钟)；图4是其温度-稳定性曲线(在0.1M乙酸钠(pH5.5)中预保温60分钟)；图5是其差示扫描量热(DSC)曲线(0.1M乙酸钠，pH5.5；Td=59.6℃)；图6-7分别显示黑曲霉和隔孢伏革菌植酸酶产物型式的叠合作图的NMR光谱(达24小时)；图8-9同上述NMR光谱，但重叠作图达4.5小时；图10a-c是分别在20分钟(pH5.5)、24小时(pH5.5)和20分钟(pH3.5)后观察到的NMR分布图。
图11是分别显示Ins(1,2)P2和Ins(2)P的浓度对时间的曲线；图12-13是分别显示pH5.5和pH3.5条件下从玉米得到的无机磷酸盐释放对时间的曲线。
寄存已按照国际公认用于专利程序的布达佩斯条约的规定，将从中得到本发明的植酸酶的分离的Peniophora lycii的菌株寄存在Centraalbureanvoor Schimmel-cultures,P.O.Box273,3740AG Baarn，荷兰，(CBS)；寄存日1996年12月4日；寄存号NN006113；CBS号Peniophoralycii CBS No.686.96。
另外，也已将转化到大肠杆菌菌株中的含有编码本发明的该植酸酶的全长度cDNA序列的表达质粒(穿梭载体)pYES2.0，按照国际公认用于专利程序的布达佩斯条约的规定保藏在Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH.,Mascheroder Weg 1b,D-38124Braunschweig，德国，(DSM)；寄存日1996年12月2日；寄存号NN049282；DSM号大肠杆菌DMS No.11312。发明的详细描述已知的植酸酶与有SEQ ID No.2所示氨基酸序列和SEQ ID No.1所示DNA序列的植酸酶的同源性如下与下列植酸酶的同源性(分别在氨基酸和DNA水平上)为氨基酸DNA黑曲霉(NRRL3135)41％51％土曲霉(菌株9A-1)41％53％嗜热毁丝霉(ATCC48102):45％54％许旺酵母26％38％大肠杆菌K12(ATCC33965):- 39％符号“-”表示没有真正识别P.lycii和大肠杆菌的植酸酶。
因此，隔孢伏革菌植酸酶与已知植酸酶相当不同，其中最密切相关的是嗜热毁丝霉的植酸酶(EP0684313)。
如下文实验部分中更详细描述的，当在曲霉中表达时，隔孢伏革菌植酸酶具有N末端氨基酸序列Leu-Pro-Ile-Pro-Ala-Gln-Asn-(SEQ ID NO.2的氨基酸序号31-37)。因此，目前认为SEQ ID No.2的氨基酸序号31-439的序列是成熟植酸酶序列。
本申请的所有氨基酸同源性至少为55％，或至少60％，或至少65％，特别是至少70％。同源性程度至少为80％，较好为至少90％，更好是至少95％，特别是至少97％。
植酸酶多肽可得自Peniophora lycii CBS686.96，并且具有下列一种或多种特征(ⅰ)最适pH3-6，(ⅱ)最适温度30-65℃，(ⅲ)在pH3-9和40℃至少稳定1小时，(ⅳ)于0-50℃预保温1小时后保留75％以上的残留活性，(ⅴ)去糖基化酶的分子量为43-53KDa，(ⅵ)70℃预保温60分钟后至少保留20％的残留活性，(ⅶ)用DSC法检测解折叠温度为50-65℃。
某些可替代的或更优选的范围是(ⅰ)最适pH较好为3.5-5.5，更好为3.7-5.2，最好为3.85.0，(ⅱ)最适温度较好为35-62℃，更好约为37-58℃，可能约为50℃，(ⅲ)在pH3-6，最好是pH3-5和40℃条件下至少稳定1小时，(ⅳ)于pH5.5条件下，0-50℃保温1小时后的残留活性至少80％，最好是至少90％，(ⅴ)SEQ ID No.2所示多肽的去糖基化形式的计算的分子量为48KDa。可用酶学或化学方法使多肽去糖基化并用质谱法或SDS-PAGE凝胶电泳法测定分子量。M.F.Chaplin和J.F.
Kennedy所编写的“碳水化合物分析-实用方法”(IRL出版社，Oxford,1986，特别是参见第5章)中描述了化学去糖基化方法。按照酶供应商指出的方法进行酶促去糖基化。或者在SDS-PAGE中测得相对分子量标志物迁移率的表观分子量约为67KDa。该值(约67KDa)是当酶在曲霉中表达时得到的(参见下文实施例)。
(ⅵ)在pH5.5,70℃预保温60分钟后的残留活性至少为30％，较好至少40％，最好至少50％；或者于pH5.5,60-80℃预保温1小时后的残留活性至少为30％，较好至少40％，最好至少50％，(ⅶ)DSC方法测定解折叠温度较好为55-62℃，更好58-62℃，最好约60℃。
或者说，下列特征是多肽所特有的37℃测得最适pH为3-7；较好是37℃测得最适pH为4-6；更好37℃测得最适pH为4.5-5.5；70℃保温20分钟后测得相对于26℃保温后至少保留有65％残留植酸酶活性；较好是70℃保温20分钟后测得相对于26℃活性至少保留65％残留植酸酶活性；更好是70℃保温20分钟后测得相对于26℃时的活性，至少保留80％残留植酸酶活性。
最近注意到，也可从层担子菌纲，较好从Stereales目，更好是从隔孢伏革菌属，特别是Peniophora lycii的菌株中得到本发明的多肽。
本发明的多肽能够在其已变性后重新折叠以恢复其植酸酶活性的至少10％，较好至少20％，更好至少30％，再好至少40％，最好至少50％。
一种筛选这种真菌多肽的方法是将所研究的微生物铺覆在植酸酶复制平板上(参见实施例1，“阳性菌落的鉴定”)并于例如30或37℃保温。分离植酸酶阳性菌落，在摇瓶中培养并除去上清。按实施例1的方法(“米曲霉转化体的试验”)，于70℃热处理例如20分钟之前和之后检测上清液的植酸酶活性。那些例如在70℃保温20分钟后仍为植酸酶阳性的样品即为热稳定的，或能够重新折叠以恢复其大部分植酸酶活性的。可按照实施例5或6所述方法，即在许多不同温度下(在确定残留活性是否随温度增加而下降和再升高的相对温度范围内)保温后检测残留活性来排除真正的热稳定性样品。
可使用所研究的生物体所要求的基本培养基和温度，将该方法应用于其他微生物，如细菌。
本发明还涉及在应用中使PA底物(完全磷酸化的)很早地消失，具体地说是在5小时内，较好在4小时内，更好在3小时内，特别是在2小时内，尤其是在1小时内，最好在1/2小时内消失的，表现有植酸酶活性的分离的多肽(参见本文实施例5)；特别是在pH3.5条件下较快地从植酸中释放无机磷酸盐的表现有植酸酶活性的分离的多肽(参见本文实施例6)；以及这四种类型植酸酶中的任何一种在烘烤面包、调合面团、制备肌醇或其衍生物，以及在食物和饲料，特别是动物饲料或动物饲料添加剂中的应用。
权利要求4涉及本发明植酸酶的核苷酸序列，特别是DNA序列。
有关“杂交”的定义请参见“一般性定义”部分，其中也列出了某些优选的杂交条件。
可按“一般性定义”部分中描述的方法确定两个核酸序列间的同一性或同源性程度。就权利要求4的特征(c)中所述的同源性来说，与(a)和(b)项所列核酸序列的同源性程度至少约为55％(仍编码有植酸酶活性的多肽)。具体地说，同源性至少为60％，或至少为65％，特别是至少70％，较好至少约80％，优选的是至少约90％，更优选的是至少约95％，最优选的是至少约97％。具体地说，同源性程度是基于所列出的完整序列与其互补链或其相当于“成熟”植酸酶的任何亚序列间比较。
杂交条件(特征(d))较好是低、中度、中度/高度、高度或很高严格性的。
也可用包括下列步骤的任何一般性方法克隆本发明的DNA序列·将来自任何预期产生所需植酸酶的生物体的cDNA文库在适当的载体中克隆，·用所说的载体转化适当的酵母宿主细胞，·在表达由cDNA文库中的克隆编码的有用酶的适当条件下培养宿主细胞，·经检测由这些克隆产生的酶的植酸酶活性筛选阳性克隆，以及·分离由这些克隆中的DNA编码的酶。WO93/11249和WO94/14953中已公开了一般性分离方法。实验部分中给出了筛选方法的详细步骤。
本发明还总地涉及使用根据权利要求1-3任一项的多肽从植酸盐或植酸中释放(或催化释放)无机磷酸盐。换句话说，即将植酸盐转化成无机磷酸盐和肌醇和/或其一、二、三、四、五磷酸酯。在该权利要求范围内，包括其中本发明的植酸酶发挥其如以前限定的植酸酶活性的任何方法。
根据本发明的更具体的应用是在人食品或动物饲料制品中或在这些制品的添加剂中，其中植酸酶例如可用于以下目的(ⅰ)降低粪尿中的植酸盐水平，(ⅱ)例如通过制造其本身已被植酸盐结合的可用蛋白质，改善可消化性、促进生长、或改善食品和饲料利用率或其转化效率，(ⅲ)预防营养不良或由必需离子和磷酸盐缺乏引起的疾病如贫血，即改善物质的生物可利用率或增加其吸收，而不必另外添加磷酸盐和离子等。
具体地说，本发明的植酸酶也可用于鸡饲料中以改善卵壳质量(减少因破碎造成的损失)，如参见Merck兽医手册，第7版，Merck&Co.,Inc.,Rahway,N.J.,USA,1991,p.1268；Jeroch等人，Bodenkultur Vol.45,No.4,pp.361-368(1994)；禽类科学，Vol.75,No.1,PP.62-68(1996)；加拿大动物科学杂志Vol.75,No.3,PP.439-444(1995)；禽类科学74,No.5,PP.784-787(1995)和禽类科学Vol.73,No.10,pp.1590-1596(1994)。
“饲料”和“食品”分别是指任何天然或人工食物、饮食等，或适于动物和人类食用、摄入、消化的这些食物的成分。
植酸酶可在体外或体内，即其摄入之前或在个体的胃中发挥其作用。也可能有联合作用。
本发明的植酸酶组合物总是包括至少一种本发明的植酸酶。
一般说来，植酸酶组合物是液体或干燥的。
液体组合物不需要含有植酸酶以外的任何成分，并且较好是高度纯化形式的。但通常也加入稳定剂如甘油、山梨醇或丙二醇。液体组合物还可包括其他添加剂，如盐、糖、防腐剂、pH调节剂、蛋白质、植酸盐(植酸酶底物)。典型的液体组合物是含水或油基的浆液。液体组合物可在适当地制成粒状沉淀后加到食品或饲料中。
干燥组合物可以是喷雾干燥的组合物，在这种情况下，组合物不一定含有干燥形式酶以外的任何其他成分。但干燥组合物是可很容易与食品或饲料成分混合的所谓颗粒，或最好形成预混物的成分。酶颗粒的粒子大小最好是与混合物的其他成分的颗粒大小匹配的。如此提供一种将酶掺入例如动物饲料中的安全和方便的方法。
在填充材料和酶共团聚以形成颗粒期间，在高剪切力混合器(如Lodige)中使用团聚技术制备团聚颗粒。用酶包被/吸收载体材料核心以制备吸收颗粒。
典型的填充材料是盐，例如硫酸二钠。其他填充材料是高岭土、滑石粉、硅酸铝镁和纤维素纤维。也可在团聚颗粒中加入粘合剂例如糊精。
典型的载体材料是淀粉、例如木薯、玉米、马铃薯、稻米和小麦的淀粉。也可以使用盐。
必要时可用包被混合物包被颗粒。这样的混合物包括涂层剂，较好是疏水涂层剂，例如氢化棕榈油和炼制的牛油脂，以及高岭土或碳酸钙等必要的其他添加剂。
此外，植酸酶组合物可含有其他成分，如着色剂、产香化合物、稳定剂、维生素、矿物质、其他饲养或食品增效酶等。这对于所谓的预混合物也是一样的。
“食品或饲料添加剂”是适于加入到食品或饲料中的基本上纯的化合物或多成分组合物。具体地说，它是一种可成为食品或饲料产品的成分或影响食品或饲料产品的任何特征的物质。它参予组成上述植酸酶组合物。典型的添加剂通常包括维生素、矿物盐或饲料增效酶，和适当的载体和/或赋形剂等的一种或多种化合物。
在一优选实施方案中，本发明的植酸酶组合物另外还包括有效量的一种或多种饲养增效酶，特别是选自α半乳糖苷酶、β半乳糖苷酶，特别是乳糖酶、其他植酸酶、β葡聚糖酶，特别是内切-β-1,4-葡聚糖酶和内切-β-1,3(4)-葡聚糖酶、纤维素酶、木聚糖苷酶，半乳聚糖酶，特别是阿拉伯半乳聚糖内切-1,4-β-半乳糖苷酶和阿拉伯半乳聚糖内切-1,3-β-半乳糖苷酶，内切葡聚糖酶，特别是内切-1,2-β-葡聚糖酶、内切-1,3-α-葡聚糖酶和内切-1,3-β-葡聚糖酶，果胶降解酶，特别是果胶酶、果胶酯酶、果胶裂合酶、多聚半乳糖醛酸酶、阿拉伯糖酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖-α-鼠李糖苷酶、果胶酸裂合酶，和α-半乳糖醛酸苷酶、甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶、甘露聚糖乙酰酯酶、木聚糖乙酰酯酶、蛋白酶、木聚糖酶、阿拉伯糖木聚糖酶和脂解酶，如脂酶、磷脂酶和角质酶。
在进食之前或进食的同时将本发明的动物饲料添加剂补充给单胃动物。较好是与食物一起将本发明的动物饲料添加剂补充给单胃动物。在一优选实施方案中，将动物饲料添加剂以颗粒或稳定化液体的形式加到食物中。
食品或饲料中植酸酶的有效量约为10-20,000，较好约10-15,000，更好约为10-10,000，特别是约为100-5,000，尤其是约为100至2,000FYT/公斤饲料或食品。
本发明植酸酶的其他特定用途是例如用于大豆加工和生产肌醇或其衍生物。
本发明还涉及降低动物粪尿中植酸盐水平的方法，其中包括给动物喂饲包含有有效量本发明植酸酶的饲料。如本申请开头所指出的，其一个重要作用是降低环境中的磷酸盐污染。
本发明还包括在制备食品或饲料制品或添加剂期间使用本发明的植酸酶，即只在生产期间使植酸酶发挥其植酸酶活性，而其在食品或饲料终产品中则没有活性。这方面的相关例子是例如调和面团和烘烤面包中。
本发明还涉及实质上纯的已寄存之微生物的生物学培养物；和包含作为其遗传材料的一部分的，编码本发明植酸酶的DNA序列的菌株。实质上纯的生物学培养物是指所说菌株的保留有植酸酶编码能力的任何突变体。
下列实施例旨在进一步地详细描述本发明，而不是以任何方式限制本发明的范围。实施例材料和方法培养基植酸盐复制平板
向200ml熔化的SC琼脂中加入20ml 20％半乳糖、800μl5％苏氨酸、25ml溶液A、25ml溶液B、200μl微量元素溶液(DSM目录141)。
溶液A6g CaCl2·2H2O、8g MgCl2·6H2O、加ddH2O至1升，pH=6.5。
溶液B35.12g植酸钠，加H2O至1升，pH=6.5。
培养基A酵母氮基W/O氨基酸(Difco0919)7.5g/l琥珀酸(Merck822260) 11.3g/lNaOH(Merck6498)6.8g/l酪蛋白氨基酸W/O维生素(Difco0288)5.6g/l色氨酸(Merck8374) 0.1g/l苏氨酸 1.0g/l植酸钠(35.12g/l,pH6.5) 125ml/l半乳糖 20.0g/l微量金属(DSM141)1.0ml/l加水至1升微量金属溶液次氮基三乙酸1.50g、MgSO4·7H2O3.00g、MnSO4·2H2O0.50g、NaCl1.00g、FeSO4·7H2O0.10g、CoSO4·7H2O0.18g、CaCl2·2H2O0.10g、ZnSO4·7H2O0.18g、CuSO4·5H2O0.01g、KAl(SO4)2·12H2O0.02g、H3BO30.01g、Na2MoO4·2H2O0.01g、NiCl2·6H2O0.025g、Na2Se3O·5H2O0.30g，加蒸馏水至1升，pH7.0。
首先溶解次氮基三乙酸并用KOH将pH调到6.5，然后加入矿物质。最后的pH为7.0(用KOH调整)。
培养基B
相似于培养基A，所不同的是加入葡萄糖作为C源，以代替半乳糖。
YPD10g酵母提取物、20g蛋白胨，加水至900ml。高压灭菌，加入100ml20％葡萄糖(无菌过滤)。
YPM10g酵母提取物、20g蛋白胨，加水至900ml。高压灭菌，加入100ml20％无菌过滤的麦芽糖糊精。
10X基本盐75g酵母氮基、113g琥珀酸、68g NaOH，加水至1000ml，然后无菌过滤。
SC-URA100ml 10X基本盐、28ml 20％没有维生素的酪蛋白氨基酸、10ml1％色氨酸，加水至900ml，高压灭菌，然后加入3.6ml 5％苏氨酸和100ml20％葡萄糖或20％半乳糖。
SC-琼脂SC-URA，加入20g/l琼脂。
SC-变体琼脂20g琼脂、20ml 10x基本盐，加水至900ml，然后高压灭菌。一般分子生物学方法除另外指出者外，所有DNA操作和转化均按分子生物学的标准方法进行(Sambrook等人(1989)分子克隆实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约；Ausubel,F.M.等人(编辑)“分子生物学当前方案”，John Wileyand Sons,1995；Harwood,C.R，和Cutting,S.M.(编辑)“芽孢杆菌的分子生物学方法”，John Willey and Sons,1990)。
除特别提到者外，用于DNA操作的所有酶，例如限制性核酸内切酶、连接酶等均得自New England Biolabs,Inc.。按照供应商的说明书中所述方法使用这些酶。实施例1从Peniophora lycii CBS No.686.96克隆并表达植酸酶保藏的生物体
Peniophora lycii CBS No.686.96含有编码本发明植酸酶的DNA序列。
大肠杆菌DSM No.11312包含存在于穿梭载体pYES2.0中的编码本发明植酸酶的全长度cDNA序列。
其他菌株酵母菌株使用的酿酒酵母菌株是W3124(van den Hazel,H.B.；Kielland-Brandt,M.C；Winther,J.R，欧洲生物化学杂志207:277-283,1992)(MATa；ura3-52；Leu2-3,112；his3-D200；pep4-1137；prcl:HIS3；prb1∷LEU2；cir+)。
大肠杆菌菌株DH10B(Life Technologies)质粒曲霉表达载体pHD414是质粒p775(EP238023中所述)的衍生物。pHD414的构建详见WO93/11249。
pYES2.0(Invitrogen)pA2phy2(见实施例1)在酵母中表达克隆按照H.Dalboege等人(Mol.Gen.Genet.,(1994),243:253-260；WO93/11249；WO94/14953；引入本文作为参考)所述的方法进行酵母中的表达克隆。总RNA延伸、cDNA合成、绿豆核酸酶处理、用T4DNA聚合酶修剪平头及文库构建均按以上参考文献所述方法完成。
发酵培养Peniophora lycii CBS No.686.96以分离mRNA将长出菌丝体的平板中的Peniophora lycii CBS686.96接种到含有100ml培养基B(大豆粉30g/l，麦芽糖糊精15g/l，细菌蛋白胨5g/l，多聚醇(Pluronic)0.2g/l)的摇瓶中。26℃将培养物静止保温15天。通过滤布(Miracloth)过滤所得到的培养物并在液氮中冷冻菌丝体。按上文所述H.Dalboege等人的方法从该培养物的菌丝体中分离mRNA。
总RNA的提取和poly(A)+RNA的方离用硫氰酸鈲提取总RNA，然后通过5.7M CsCl垫层超离心，并使用WO94/14953中所述方法，通过Oligo(dT)纤维素亲合层析分离poly(A)+RNA。
cDNA合成用RNase H方法(Gubler和Hoffman，(1983)基因25:263-269；Sambrook等人，(1989)，上述文献)从5mg poly(A)+RNA合成双链cDNA。将poly(A)+RNA(5μg，在5μl DEPC处理的水中)于70℃在预硅化的，无RNase的Eppendorph管中加热8分钟，在冰上骤冷并以50μl终体积与含有1mM dATP、dGTP和dTTP及0.5mM 5-甲基-dCTP(Pharmacia)、40单位人胎盘核糖核酸酶抑制剂(RNasin，Promega)、1.45μg Oligo(dT)18-Not Ⅰ引物(Pharmacia)和1000单位SuperScriptⅡRNase H反转录酶(Bethesda Research Laboratories)的反转录酶缓冲液(50mM Tris-HCl(pH8.3)、75mM KCl、3mM MgCl2、10mM DTT)(Bethesda Research Laboratories)合并。于45℃将反应混合物保温1小时以合成第一条cDNA链。合成后，按照生产商提供的使用说明通过MicroSpin S-400HR(Pharmacia)旋转柱凝胶过滤mRNA:cDNA杂合混合物。
凝胶过滤后，在含有各200μl dNTP、60单位大肠杆菌DNA聚合酶I(Pharmacia),5.25单位RNase H(Promega)和15单位大肠杆菌DNA连接酶(Boehringer Mannheim)的250μl第二链缓冲液(20mMTris-Cl(pH7.4)、90mM KCl、4.6mM MgCl2、10mM(NH4)2SO4、0.16mM bNAD+)中稀释所得到的杂合体。将反应管于16℃保温2小时，再于25℃保温15分钟来完成第二条cDNA链的合成。加入终浓度为20mM的EDTA终止反应，然后进行苯酚和氯仿提取。
绿豆核酸酶处理加入2倍体积96％乙醇，0.2体积10M NH4Ac于-20℃将双链cDNA沉淀12小时，离心回收，在70％EtOH中洗涤，干燥并重新悬浮在含有25单位绿豆核酸酶(Pharmacia)的30μl绿豆核酸酶缓冲液(30mM NaAc(pH 4.6)、300mM NaCl、1mM ZnSO4、0.35mM DTT、2％甘油)中。将反应混合物于30℃保温30分钟以修剪单链发夹DNA，然后加入70μl 10mM Tris-Cl(pH7.5)和1mM EDTA，用苯酚提取并在冰上用2体积96％EtOH和0.1体积3M NaAc(pH5.2)沉淀30分钟。
用T4DNA聚合酶修平头离心回收双链cDNA，并在含有各0.5mM dNTP和5单位T4DNA聚合酶(New England Biolabs)的30ml T4 DNA聚合酶缓冲液(20mMTris-乙酸盐(pH7.9)、10mM MgAc、50mM KAc、1mM DTT)中将反应混合物于16℃保温1小时以修成平头。加入终浓度为20mM的EDTA以终止反应，然后进行苯酚和氯仿提取，通过加入2体积96％EtOH和0.1体积3M NaAc(pH5.2)于-20℃沉淀12小时。
连接物连接、NotⅠ消化和按大小选择填充反应后，离心回收cDNA，在70％乙醇中洗并干燥。将cDNA沉淀物重新悬浮于含有2.5μg非回文BstXⅠ连接物(Invitrogen)和30单位T4连接酶(Promega)的25μl连接缓冲液(30mM Tris-Cl(pH7.8)、10mM MgCl2、10mM DTT、0.5mM ATP)中并于16℃保温12小时。于65℃加热20分钟以终止反应，然后在冰上冷却5分钟。加入20μl水、5μl 10X NotⅠ限制性酶缓冲液(New England Biolabs)和50单位NotⅠ(New England Biolabs)，然后于37℃保温2.5小时，以用NotⅠ限制性酶消化衔接的cDNA。于65℃加热10分钟以终止反应。在1×TBE中，于0.8％SeaPlaque GTG低熔点凝胶(FMC)上进行凝胶电泳按大小分级分离cDNA，以分离出未连接的连接物和小的cDNA。以0.7Kb的截断值按大小选择cDNA，并按生产商的使用说明使用b-Agarase(NewEngland Biolabs)从凝胶中拯救所需大小的片段，然后加入2体积96％EtOH和0.1体积3M NaAc(pH5.2)于-20℃沉淀之。
文库的构建离心回收有方向性的，按大小选择的cDNA，在70％EtOH中洗涤，干燥并重新悬浮于30μl 10mM Tris-HCl(pH7.5)、1mM EDTA中。按照生产商的使用说明通过MicroSpin S-300HR(Pharmacia)旋转柱，以凝胶过滤法将cDNA脱盐。在含有5μl双链cDNA(#1和#2反应管)、15单位T4连接酶(Promega)和30ng(#1管)、40ng(#2管)和40ng(#3管，载体本底对照)BstXⅠ-NotⅠ切割的pYES2.0载体的10μl连接缓冲液(30mM Tris-Cl(pH7.8)、10mM MgCl2、10mM DTT、0.5mM ATP)中进行三次试验连接。于16℃保温12小时，于70℃加热20分钟并向各管内加入10μl水完成连接反应。按已述方法(Sambrook等人，(1989)，上述文献)将各1μl连接混合物电穿孔转化到40μl电感受态大肠杆菌DH10B细胞(Bethesda Research Laboratories)中。使用最适条件在由集合体组成的大肠杆菌中建立文库。将转化的大肠杆菌分散于LB+氨苄青霉素琼脂平板上，37℃保温24小时后得到15,000-30,000个菌落/平板，从而制得各集合体。将20ml LB+氨苄青霉素加到平板上并将细胞悬浮在其中。将细胞悬液于37℃在50ml管中振荡1小时。使用QIAGEN质粒试剂盒按生产商提供的使用说明从细胞中分离质粒DNA并于-20℃贮存之。
将从各个集合体分出的1μl纯化的质粒DNA(100ng/ml)以电穿孔法(Becker和Guarante,(1991)，酶学方法194:182-187)转化到酿酒酵母W3124中，将转化体铺覆在含有2％葡萄糖的SC琼脂板上并于30℃保温。
阳性菌落的鉴定生长3-5天后，将琼脂板复印到一组植酸盐复制板上，并于30℃保温3-5天。将含有0.2M CaCl2的1％LSB琼脂糖倾倒在平板上并在1-4天后根据菌落周围亮区的出现鉴定植酸酶阳性菌落。
将酶阳性菌落中的用于单菌落分离的细胞散布于琼脂上，并从每个所鉴定的植酸酶生产菌落中分离产生酶的单个菌落。
分离用于在曲霉中表达的cDNA基因将产生植酸酶的酵母菌落接种到50ml玻璃试管内的20ml YPD培养液中。将试管于30℃振荡2天。以3,000rpm离心10分钟以收获细胞。
按照WO94/14953所述方法分离DNA并溶解于50ml水中。按标准方法将DNA转化到大肠杆菌中。以标准方法从大肠杆菌中分离质粒DNA，并进行限制性酶切分析。
用限制性酶HindⅢ和XbaⅠ切割cDNA插入物并连接到曲霉表达载体pHD414中，得到质粒pA2phy2。
使用Taq脱氧末端循环测序试剂盒(Perkin Elmer,USA)和合成的寡核苷酸引物，在Applied Biosystems ABI PRISMTM377 DNA测序仪中按仪器使用说明书测定Qiagen纯化之质粒pA2phy2(Qiagen,USA)DNA的cDNA插入物的序列。
米曲霉和黑曲霉的转化按照WO95/02043，第16页第21行至第17页第12行中所述方法制备原生质体。
将100μl原生质体悬液与5-25μg溶于10μl STC(1.2M山梨糖醇、10mM Tris-HCl(pH7.5)、10mM CaCl2)中的适当的DNA混合。将原生质体与p3SR2(携带构巢曲霉amdS基因的质粒)(Tove Christensen等人，生物/技术，PP.1419-1422,vol.6,Dec.1988)混合。将混合物于室温下放置25分钟。加入0.2ml 60％PEG 4000(BDH29576)、10mM CaCl2和10mM Tris-HCl(pH7.5)并小心混匀(两次)，最后加入0.85ml同样的溶液并小心混匀。将混合物室温放置25分钟，以2500g离心15分钟并将沉淀重新悬浮于2ml 1.2M山梨糖醇中。经一次以上沉降后，将原生质体散布于含有1.0M蔗糖(pH7.0)、10mM乙酰胺(作为氮源)和20mM CsCl的基本培养基平板(Cove，生物化学与生物物理学学报，(1966)113:51-56)上，以抑制本底生长。37℃保温4-7天后挑取孢子并分散成单个菌落。重复该方法，并在第二次再分离后保存单个菌落的孢子以作为限定的转化体。
米曲霉转化体的试验在10ml YPM中接种各米曲霉转化体(参见下文)并增殖之。30℃保温2-5天后，去除上清液。
将20μl上清液加到在含有0.1M乙酸钠(pH4.5)和0.1％六磷酸肌醇的1％LSB琼脂糖平板打出的4mm直径的孔中。将平板37℃放置过夜。将由0.2M乙酸钠(pH4.5)和0.1M CaCl2组成的缓冲液倾倒到平板上并将平板室温放置1小时。然后根据亮区的出现鉴定植酸酶活性。
补料分批发酵在含有麦芽糖糊精(作为碳源)、尿素(作为氮源)和酵母提取物的培养基中进行补料分批发酵。将所研究的米曲霉宿主细胞的摇瓶培养物接种到含有3.5％碳源和0.5％氮源的培养基中进行补料分批发酵。培养(34℃，pH7.0)24小时后，开始连续补充碳和氮源。保持碳源作为限制因素，并保证有过量氧存在。连续补料分批培养4天。
分离SEQ ID No.1中所示的DNA序列可用本领域已知的方法(Sambrook等人，(1989)分子克隆实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)，经提取质粒DNA从已寄存的大肠杆菌DSM11312中得到编码本发明植酸酶的SEQ ID No.1中所示DNA序列的植酸酶编码部分。
使用上述在酵母中表达克隆技术进行克隆和表达。
按上述方法从生长的Peniophora lycii CBS No.686.96中分离mRNA。
生长15天后收获菌丝体，立即在液氮中冷冻并贮存于-80℃下。在上述有1％载体本底的大肠杆菌中构建由大约9×105个单个克隆组成的Peniophora lycii,CBS No.686.96的文库。将得自某些集合体的质粒DNA转化到酵母中，并从各集合体得到含有250-400个酵母菌落的50-100个平板。
按上述方法鉴定并分离植酸酶阳性菌落，并接种到50ml玻璃试管内的20ml YPD培养液中。将试管30℃振荡2天。3,000rpm离心10分钟以收获细胞。按照WO94/14953所述方法分离DNA并溶解于50μl水中。按标准方法将DNA转化到大肠杆菌中。用标准方法从大肠杆菌中分离质粒DNA，并使用Applied Biosystems ABI PRISMTM377 DNA序列仪，按生产商的使用说明书所述方法，利用Taq脱氧末端循环测序试剂盒(Perkin Elmer,USA)和合成的寡核苷酸引物测定编码植酸酶之cDNA的DNA序列。SEQ ID No.1中显示了编码植酸酶的cDNA的DNA序列，并且SEQ ID No.2中显示了相应的氨基酸序列。SEQ ID No.1中的DNA核苷酸序列1至1320限定为植酸酶编码区。
SEQ ID No.1编码植酸酶之成熟部分的DNA序列部分是从位置91至1320，其相应于SEQ ID No.2中的氨基酸位置31-439。
可从DSM11312中的质粒制得cDNA。
从酵母菌落中分离总DNA并按上述方法转化大肠杆菌以拯救质粒DNA。为了在曲霉中表达植酸酶，用适当的限制性内切酶消化DNA，在凝胶上进行分级分离，并纯化相当于植酸酶基因的片段。然后将基因连接到pHD414上，用适当的限制性内切酶消化，得到质粒pA2phy2。
在大肠杆菌中扩增DNA后，按上述方法将质粒转化到米曲霉中。
米曲霉转化体的试验按上述方法试验各转化体的酶活性。某些转化体具有明显大于米曲霉本底的植酸酶活性。这一结果证明植酸酶在米曲霉中得到有效表达。实施例2在米曲霉中表达的Peniophora lycii植酸酶的分离和特征鉴定在米曲霉IFO4177中表达并从中分泌Peniophora lycii植酸酶。
向通过滤布过滤的培养液中加入助滤剂。进一步通过Seitz深度滤板过滤该溶液，得到澄清的溶液。在3KDa截留分子量的聚醚砜膜上超滤浓缩滤液，然后用蒸馏水渗滤以降低导电性。将浓缩的酶液的pH调到7.5。浓缩酶液的导电率为1.2mS/cm。
将植酸酶加样到在20mM Tris/CH3COOH(pH7.5)中平衡的Q-Sepharose FF柱上，并用渐增的线性NaCl梯度(0→0.5M)洗脱酶。作为单一峰洗脱植酸酶活性。合并该峰值部分并向其中加入(NH4)2SO4至1.5M终浓度。在1.5M(NH4)2SO4,10mM琥珀酸/NaOH(pH6.0)中平衡Phenyl Toyopearl650S柱，然后将植酸酶上柱并用渐降的线性(NH4)2SO4梯度(1.5→0M)洗脱。合并含植酸酶部分，并在Sephadex G25柱上将缓冲液换成20mM Tris/CH3COOH(pH7.5)。将G25滤液加样到已在20mMTris/CH3COOH(pH7.5)中平衡的Q-Sepharose FF柱上。用平衡缓冲液彻底洗柱后，用渐增的线性NaCl梯度(0-0.5M)洗脱植酸酶。合并含植酸酶活性部分并经透析将缓冲液换成20mM Tris/CH3COOH(pH7.5)。将透析的植酸酶加样于在20mM Tris/CH3COOH(pH7.5)中平衡过的SOURCE30Q柱上。用平衡缓冲液彻底洗柱后，用渐增的线性NaCl梯度(0→0.3M)洗脱植酸酶。用SDS-PAGE分析从SOURCE300柱上洗脱的各部分，并合并含纯植酸酶的部分。
隔孢伏革菌植酸酶在凝胶中作为Mr=67KDa的带迁移。在SDS-PAGE之后测定67KDa成分的N末端氨基酸序列并电印迹到PVDF膜上。可推测出下列N末端氨基酸序列Leu-Pro-Ile-Pro-Ala-Gln-Asn-，该序列相当于cDNA衍生的氨基酸序列的氨基酸残基31-37。
因此推测在曲霉中表达时植酸酶的成熟氨基酸序列是SEQ ID No.2的氨基酸31-439。实施例3当存在于粗发酵液的上清中时，Peniophora lycii植酸酶的特征鉴定对粗培养物发酵液的上清进行下列特征鉴定。
植酸酶活性测定将每份植酸酶样品的各20μl两等份样品加到100μl植酸中(0.1M乙酸钠缓冲液(pH5.5)中的5mM植酸钠)。
在时间T=0分钟时向参考样品中加入100μl铁试剂(1.1gFeSO4·7H2O在15ml钼酸铵溶液(2.5g(NH4)6MO7O24·4H2O和8mlH2SO4，用水稀释到250ml))。将参考混合物37℃保温5分钟。然后于750nm处以分光光度法检测蓝色强度。
将酶样品37℃保温30分钟。于T=30分钟时加入100μl铁试剂。37℃保温样品5分钟并于750nm进行分光光度检测。以酶样品和参考样品之间的差异作为相对于磷酸盐校正曲线的所释放之磷酸盐的量的指标。
温度稳定性在下表中指出的温度下将酶样品预保温20分钟，然后冷却至室温并检测残留活性，借以检测植酸酶的稳定性。
所得到的相对于26℃保温20分钟后的残留活性的检测结果也示于下表中。<
<p>最适pH还使用上述植酸酶活性检测法检测粗培养物发酵液上清的pH分布曲线。在下列缓冲液中制备5mM植酸溶液pH3.0(0.1M甘氨酸/HCl)、pH4.0(0.1M乙酸钠)、pH5.0(乙酸钠)、pH5.5(乙酸钠)、pH6.0(50mMMES)、pH7.0(0.1M Tris-HCL)、pH8.0(0.1M Tris-HCl)、pH9.0(0.1M甘氨酸/NaOH)。
结果以相对值示于下表中，指数100代表pH5.0时的活性。
实施例4纯化的Peniophora lycii植酸酶的特征鉴定按实施例2中所述方法在曲霉中表达并纯化Peniophora lycii的植酸酶。
使用下述检测法检测植酸酶活性将10μl稀释的酶样品(在0.1M乙酸钠、0.01％Tween20,pH5.5中稀释)加到溶于0.1M乙酸钠、0.01％Tween20,pH5.5的250μl植酸钠(Sigma)中(溶解植酸钠后调整pH；预加热底物)，并于37℃保温30分钟。加入250μl10％TCA以终止反应，并加入500μl溶于100ml钼酸盐试剂(2.5g(NH4)6Mo7O24·4H2O加在8ml H2SO4中，稀释到250ml)中的7.3g FeSO4的溶液以检测游离磷酸盐。在96孔微量滴定板中检测200μl样品的750nm吸光率。实验中包括底物和酶空白对照，还包括磷酸盐标准曲线(0-2mM磷酸盐)。1FYT等于在给定的条件下每分钟释放1μmol磷酸盐所需的酶量。
在不同温度(预加热底物)下进行检测，以得到温度分布型。
在检测残留活性之前于不同温度下预保温溶于0.1M磷酸钠(pH5.5)中的植酸酶，以研究温度稳定性。
将酶于pH3(25mM甘氨酸/HCl)、pH4-5(25mM乙酸钠)、pH6(25mM MES)、pH7-9(25mM Tris-HCl)条件下40℃保温1小时，然后检测残留活性，以测定pH稳定性。
使用同样的缓冲系统(50mM，当溶解底物时重新调整pH)，在不同pH条件下进行检测，得到pH分布型。
上述pH分布型、pH稳定性、温度分布型和温度稳定性研究的结果分别示于图1、2、3和4中。
从图1可以看出，Peniophora lycii的植酸酶在pH3-6时具有合理的活性(即最大活性的40％以上)。在pH3.5-5.5时见有60％以上的最大活性，pH3.8-5.0时为最大活性的90％以上。最适pH似乎在pH4-5范围内。
从图2可以看出，在pH3-9的整个范围内，40℃保温1小时后Peniophora lycii的植酸酶是很稳定的(为保留最大活性的80％以上)。
就温度分布型而言，从图3可以看出，在30-65℃温度范围内，Peniophora lycii植酸酶具有合理的活性(即最大活性的60％以上)，而在35-62℃时，活性为最大活性的70％以上，并且最适温度可能接近50℃。
最后，就图4所示的温度稳定性来说，本发明的植酸酶在0至大约50℃时是很稳定的(即有90％以上的残留活性)。在50℃以上预保温后，可见残留活性有一定的降低。但无论如何，在60-80℃时仍保留大约50-60％的残留活性。
这一事实可能是由于在酶经过热变性后能够很好地重新折叠。重新折叠的程度将取决于准确的条件(pH、酶浓度)。
图5显示对隔孢伏革菌植酸酶所作差式扫描量热法(DSC)检测的结果。
在DSC中，相对于参考小室，测得样品小室中的热消耗保持一个恒定的温度增加。保持了恒定的加热率(如90℃/小时)。由于转移到小室中的热量增加，以保持恒定温度增加，从而观察到吸热过程(热消耗过程-例如酶/蛋白质的解折叠)。
使用MicroCal的MC2装置进行DSC检测。在以90℃/小时的扫描速率扫描到90℃之前于20℃将小室平衡20分钟。装添溶于0.1M乙酸钠(pH5.5)中的约2.5mg/ml的隔孢伏革菌植酸酶样品。
DSC进一步证实了温度稳定性研究结果，因为从图5可以看出，隔孢伏革菌植酸酶在pH5.5时具有大约60℃的变性或“熔解”温度。实施例4a隔孢伏革菌植酸酶比活性的检测对高度纯化的植酸酶样品(提前在显示只存在一种成分的SDS聚丙烯酰胺凝胶上检查纯度)进行比活性检测。
以下述氨基酸分析法测定植酸酶样品中的蛋白质浓度于110℃，在抽真空的玻璃管中用6NHCl,0.1％苯酚水解植酸酶的等分样品。使用按说明书操作的Applied Biosystems 420A氨基酸分析系统定量分析所得到的氨基酸。可根据测得的氨基酸量计算出水解的等分样品中蛋白质的总质量，以及浓度。
以FYT单位确定活性。1FYT等于于pH5.5和37℃条件下每分钟从植酸盐(5mM)中释放1μmol无机磷酸盐所需酶量；检测法参见实施例4。
计算的比活性为987FYT/mg酶蛋白。实施例5以1H NMR光谱法定时分辨的植酸酶催化植酸水解的产物分布图形在24小时过程中，以1H NMR法绘制产品混合物分布图，以研究由隔孢伏革菌植酸酶和市售黑曲霉植酸酶(Phytase Novo)催化的植酸(PA)水解(27mM植酸盐，1FYT/ml,pH5.5和3.5，和27℃)。
下文中Ins(p、q、r、…)Pn代表携带总共n个连接到位置p、q、r、…上的磷酸基团的肌醇。为方便起见将Ins(1,2,3,4,5,6)P6(植酸)简写为PA。详细说明请参见本申请一般描述部分中“植酸酶的命名和位置特异性”一节。
该技术提供关于酶在PA分子上攻击起始点的特定信息和关于认定终产物的信息。在其他方面，反映中间产物混合物组成之峰值的推定图形为鉴定个别酶之间的相似性和差异提供定性手段，即指纹检测。
NMR如大多数其他分析方法一样，可区分不是镜像的立体异构体(非对映体)，但不能区分一组是镜像的异构体(对映体)，因为它们表现有相同的NMR光谱。
因此，Ins(1,2,4,5,6)P5(除去了3-磷酸)表现有不同于Ins(1,2,3,4,5)P5(除去了6-磷酸)的NMR光谱(由于这些异构体是非对映体)。
但由于Ins(1,2,4,5,6)P5和Ins(2,3,4,5,6)P5(除去了1-磷酸)是对映异构体，所以两者的NMR光谱是完全相同的。Ins(1,2,3,4,5)P5和Ins(1,2,3,5,6)P5(除去了4-磷酸)这一对异构体也是这种情况。
因此单靠NMR不可能区分3-和1-植酸酶，并且不可能区分6-和4-植酸酶(或使用最低位标规则的L-6-和D-6-植酸酶)。
与文献中对3-和6-植酸酶的描述不同，我们已将术语3-和6-植酸酶用于定义我们的酶，尽管不大可能，但我们并不真正知道是否还有1-和4-植酸酶。
实验在配有5mm选择性倒转探头的Bruker DRX400装置上于300K(27℃)记录NMR光谱。使用由8K数据点覆盖的2003Hz(5ppm)扫描宽度累积4个模拟扫描之前的16个扫描。经3秒预饱和期间达到残留HOD共振的衰减。光谱涉及HOD信号(δ4.70)。
按下述方法制备用于NMR分析的PA样品将PA(100mg，植酸二钾盐，Sigma P-5681)溶解于去离子水(4.0ml)中并加入NaOH水溶液(4N)将pH调到5.5或3.5。加入去离子水(加至5ml)，将各相当于20mg植酸的1ml部分转入螺旋帽小瓶中并蒸发(真空离心)除去溶剂。将干燥样品溶解于氧化氘(2ml,Merck99.5％D)中并再次蒸发至干(贮存于-18℃备用)。
为了进行NMR分析，将一份20mg植酸样品溶解于氧化氘(1.0ml，Merck99.95％D)中。将溶液转移到NMR管中并记录1H NMR光谱。加入酶溶液(1FTU，根据需要用氧化氘溶解/稀释)，然后彻底混合(1分钟)。加入酶后立即(t=0)及5、10、15、20、25、30、45、60、75、90、105、120、135、150、165、180、195、210分钟(=3.5小时)和4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、11.5、13.5、15.5、17.5、19.5、21.5和23.5小时后记录1H NMR光谱。检测NMR管中的pH。48和120小时(5天)后获得附加光谱，其中加入一部分底物(PA,6mg)以探查酶是否保留其催化活性。
借助对部分消化PA所得到的磷酸肌醇酯混合物的2D NMR分析，结合已公布的NMR数据(Scholz,p.；Bergmann,G.，和Mayr,G.W.,Methods in Inositide Research(Ed.Irvine,R.F.),PP.65-82,Raven出版有限公司，纽约(1990))，鉴定贡献于Ins(1,2,3,4,5,6)P6(PA)、Ins(1,2,4,5,6)P5、Ins(1,2,3,4,5)P5、Ins(1,2,5,6)P4、Ins(1,2,6)P3、Ins(1,2)P2和Ins(2)P的特征性1HNMR信号，并允许在反应过程中相对量化这些衍生物。
图6和图7中分别给出了在pH5.5条件下，24小时反应时间内曲霉植酸酶和隔孢伏革菌植酸酶产物分布型的叠层曲线。
δ3.25(t)处的信号代表Ins(1,2)P2中的H-5，而δ3.18(t)处的信号则代表Ins(2)P中的H-5。用曲霉植酸酶约反应4小时后和用隔孢伏革菌植酸酶约反应1小时后Ins(1,2)P2开始聚积。用曲霉植酸酶约反应10小时后和用隔孢伏革菌植酸酶反应约3小时后观察到Ins(2)P。反应24小时后Ins(1,2)P2的量或水平对于两种植酸酶来说都很低，而24小时后对于两种植酸酶来说Ins(2)P的量最大。
因此，反应24小时后观察到的分布型证明两种植酸酶均将PA降解成Ins(2)P。
对于两种酶，24小时的反应混合物除含有Ins(2)P外还含有很小量Ins(1,2)P2。延长反应时间(数日)导致了残留的Ins(1,2)P2的消失，但完全未见有彻底去磷酸化的肌醇(Ins)。酶的不可逆抑制作用/变性作用不能解释这一观察结果，因为如根据其在室温下保存5天后仍能消化加到NMR管中的新鲜PA的能力所证明的，酶长时间保留了它们的催化活性。
现在转向图8和9，这些图更详细地描绘初始4.5小时期间(pH5.5)演化的分布图。从图10推论出Ins(1,2,4,5,6)P5(指定为A)中的H-3显示δ3.66(dd)处的信号，Ins(1,2,3,4,5)P5(B)中的H-6显示δ3.87(t)处的信号，Ins(1,2,5,6)P4(C)中的H-3则显示δ3.56(dd)处的信号。这样，化合物A即相当已被水解的位置3中的磷酸，化合物B相当于位置6中的磷酸，而C则相当于位置3和4中的磷酸。
从图8中可以看出，化合物A表现为使用曲霉植酸酶得到的主要基本产物(t=5分钟)，而化合物B则未出现。化合物C在20-25分钟后出现。
从图9(隔孢伏革菌植酸酶)可推论出，化合物B是作为使用隔孢伏革菌植酸酶得到的主要基本产物(t=5分钟)出现的。
δ4.82(dt,H-2)、4.38(q,H-4/H-6)、4.13(q,H-5)和4.11(dt,H1/H3)处的信号可归因于底物植酸(PA)。比较图8和9可以看出，用隔孢伏革菌植酸酶比用曲霉植酸酶使这些峰更快地缩小。
这些差异在图10a中特别明显，其给出在pH5.5反应20分钟后观察到的分布图形，指出了标示的判定信号(A、B、C)。
图10b显示于pH5.5水解植酸(即相当于图6和7的上行)的最后结果(在这些条件下)。在上方隔孢伏革菌实例中标出的所有信号均代表化合物Ins(2)P，即其质子，从右至左H-5、H1和H3、H4和H6，最后是H-2。相对强度1∶2∶2∶1。在下方曲霉实例上发现有相应的信号。这意味着两实例中的终产物都是Ins(2)P。但两实例中也检测到很小量Ins(1,2)P2，只在曲霉实例处指出相应的峰。
观察到的显著差异曲霉鉴定初始主产物为Ins(1,2,4,5,6)P5(A)然后出现Ins(1,2,5,6)P4(C)和Ins(1,2,6)P3(D)(11/2小时后在δ3.49(dd)处的H-3)，此相当于连续去除3-、4-和5-位中的磷酸基团。Ins(1,2)P2(E)的浓度在4小时起始缓慢升高并在12和14小时间很陡峭地降低，伴随有Ins(2)P(F)水平的迅速增加。这一点在图11中可以看出，如通过检测分别相当于Ins(1,2)P2(δ3.25(t))和Ins(2)P(δ3.18(t))中H-5的信号下的面积(相对于相应底物信号(t=0)下的面积)所确定的，其分别代表Ins(1,2)P2和Ins(2)P的时间依赖性浓度。
隔孢伏革菌在pH5.5时，只有6位开始受到攻击。征象性特点是与曲霉植酸酶相比，PA以更快的速度被消化。其他征象性特点是终产物，Ins(2)P(F)出现很早(3小时)并缓慢升高，与用曲霉植酸酶观察到的反应将结束时Ins(2)P水平很快增加相反。
图10c是与图10a相似的作图，但是在pH3.5条件下记录的。令人惊奇的是，在此pH时隔孢伏革菌植酸酶转向对PA的6-及3-位有高初始亲合性(观察B及A)，此可能对6位稍有偏爱。
所产生的数据尤其可得出下列结论在pHS.5及3.5时，曲霉植酸酶以高度选择性在3位攻击PA，而隔孢伏革菌植酸酶在pH5.5时以高度选择性在6位攻击PA，但在pH3.5时它似乎以差不多的速度在3和6位上水解磷酸盐基团。
在pH5.5时，与曲霉植酸酶相比，隔孢伏革菌植酸酶以更快的速率消化PA。
在pH3.5及5.5时，在所应用的条件下，终产物是Ins(2)P(F)。
整体反应速率(PA→Ins(2)P)是可比较的，约为20小时(图11，pHS.5)。
因此，曲霉植酸酶证明是基本上纯净的3-植酸酶，而隔孢伏革菌植酸酶在pH5.5时似乎是基本上纯净的6-植酸酶，并且在pH3.5时为迄今未知类型的植酸酶，即3+6-植酸酶。实施例6曲霉和隔孢伏革菌植酸酶从玉米中释放无机磷酸盐的比较试验本实施例给出在pH3.5和5.5条件下，植酸酶催化的从玉米中释放三价磷的简单试验。两个参数已集中于速度和磷释放的水平上。
材料和方法玉米得自北卡罗来纳州立大学(样品号R27)并在粉碎机(BuhlerUniversal)(点6.8处)上磨碎。
将20g磨碎的玉米称入250ml蓝帽瓶中并加入100ml缓冲液以制备玉米悬液(16.7％w/w)。所使用的缓冲液是pH5.5,0.22M乙酸盐缓冲液。用8N HCl/NaOH将pH值调到3.5。
试验的酶试验两种植酸酶市售的黑曲霉植酸酶(Phytase Novo)和按实施例3和4中所述方法纯化的本发明的隔孢伏革菌植酸酶。
剂量所有的酶均以25FYT/20g玉米(相当于1250FYT/kg)应用。
用帽密闭合玉米悬液的瓶子，立即放在37℃水浴中并持续搅拌。在此阶段测pH并在24小时后再次测pH。搅拌30分钟后收集5ml样品。
然后以25FYT/20g玉米的剂量加入植酸酶。
加入植酸酶后5、10、15、20、25、30、40、50、60和120分钟时收集样品并按下述方法测定所释放的P的量在缓冲液中1∶4稀释含植酸酶的样品。然后以3,000rpm将样品离心5分钟，并收集1.0ml上清液。加入2.0ml缓冲液和2.0ml MoV终止溶液(参见实施例6的FYT检测法)。将样品放在3-5℃冰箱中直到可于415nm进行分光光度检测。于0和20小时检测pH。
为了进行检测，制备所使用的磷酸盐标准品和贮备溶液。使用缓冲液将0.5、1.0、1.5和2.0ml原液稀释到50ml总体积。将3.0ml各溶液加入2.0ml MoV终止溶液。
在pH5.5和pH3.5时进行两次实验。图12和13(分别为pH5.5和3.5)显示了分析结果。这些附图中，符号“◆”代表对照实验，“▲”代表隔孢伏革菌植酸酶，“■”代表曲霉植酸酶。
结果和讨论图12(pH5.5)显示，在此pH下，与曲霉植酸酶相比，隔孢伏革菌植酸酶以明显改善的速率从玉米中释放P。
从图13(pH3.5)可以看出，在此pH下隔孢伏革菌植酸酶从磨碎的玉米中释放三价磷的速度比曲霉植酸酶(0-120分钟)快得多。
例如无论pH高低，鸡/雏鸡消化系统的通过时间正常情况下是30分钟至2小时数量级的，所以观察到的差异是有一定重要性的。不过3.5pH值在这方面比pH5.5值更为相关。
这就说明，在例如肉用仔鸡的消化系统中，作为P释放剂，隔孢伏革菌酶显然比已知的曲霉植酸酶更为有效。
序列表SEQ ID No.1显示本发明的克隆的DNA序列，包括编码有植酸酶活性之酶的DNA序列。(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)长度1320碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅵ)来源(A)生物体Peniophora lycii(B)菌株 CBS 686.96(ⅸ)特征(A)名称/键CDS(B)定位1..1320(xⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:ATG GTT TCT TCG GCA TTC GCA CCT TCC ATC CTA CTT AGC TTG ATG TCG 48Met Val Ser Ser Ala Phe Ala Pro Ser Ile Leu Leu Ser Leu Met Ser1 5 10 15AGT CTT GCT TTG AGC ACG CAG TTC AGC TTT GTT GCG GCG CAG CTA CCT 96Ser Leu Ala Leu Ser Thr Gln Phe Ser Phe Val Ala Ala Gln Leu Pro20 25 30ATC CCC GCA CAA AAC ACA AGT AAT TGG GGG CCT TAC GAT CCC TTC TTT144Ile Pro Ala Gln Asn Thr Ser Asn Trp Gly Pro Tyr Asp Pro Phe Phe35 40 45CCC GTC GAA CCG TAT GCA GCT CCG CCG GAA GGG TGC ACA GTG ACA CAG 192Pro Val Glu Pro Tyr Ala Ala Pro Pro Glu Gly Cys Thr Val Thr Gln50 55 60GTC AAC CTG ATT CAG AGG CAC GGC GCG CGT TGG CCC ACA TCC GGC GCG 240Val Asn Leu Ile Gln Arg His Gly Ala Arg Trp Pro Thr Ser Gly Ala65 70 75 80CGG TCG CGG CAG GTC GCC GCC GTA GCG AAG ATA CAA ATG GCG CGA CCA 288Arg Ser Arg Gln Val Ala Ala Val Ala Lys Ile Gln Met Ala Arg Pro85 90 95TTC ACG GAT CCC AAG TAT GAG TTC CTC AAC GAC TTC GTG TAC AAG TTC 336Phe Thr Asp Pro Lys Tyr Glu Phe Leu Asn Asp Phe Val Tyr Lys Phe100 105 110GGC GTC GCC GAT CTG CTA CCG TTC GGG GCT AAC CAA TCG CAC CAA ACC 384Gly Val Ala Asp Leu Leu Pro Phe Gly Ala Asn Gln Ser His Gln Thr115 120 125GGC ACC GAT ATG TAT ACG CGC TAC AGT ACA CTA TTT GAG GGC GGG GAT 432Gly Thr Asp Met Tyr Thr Arg Tyr Ser Thr Leu Phe Glu Gly Gly Asp130 135 140GTA CCC TTT GTG CGC GCG GCT GGT GAC CAA CGC GTC GTT GAC TCC TCG 480Val Pro Phe Val Arg Ala Ala Gly Asp Gln Arg Val Val Asp Ser Ser145 150 155 160ACG AAC TGG ACG GCA GGC TTT GGC GAT GCT TCT GGC GAG ACT GTT CTC 528Thr Asn Trp Thr Ala Gly Phe Gly Asp Ala Ser Gly Glu Thr Val Leu165 170 175CCG ACG CTC CAG GTT GTG CTT CAA GAA GAG GGG AAC TGC ACG CTC TGC 576Pro Thr Leu Gln Val Val Leu Gln Glu Glu Gly Asn Cys Thr Leu Cys180 185 190AAT AAT ATG TGC CCG AAT GAA GTG GAT GGT GAC GAA TCC ACA ACG TGG 624Asn Asn Met Cys Pro Asn Glu Val Asp Gly Asp Glu Ser Thr Thr Trp195 200 205CTG GGG GTC TTT GCG CCG AAC ATC ACC GCG CGA TTG AAC GCT GCT GCG 672Leu Gly Val Phe Ala Pro Asn Ile Thr Ala Arg Leu Asn Ala Ala Ala210 215 220CCG AGT GCC AAC CTC TCA GAC AGC GAC GCG CTC ACT CTC ATG GAT ATG 720Pro Ser Ala Asn Leu Ser Asp Ser Asp Ala Leu Thr Leu Met Asp Met225 230 235 240TGC CCG TTC GAC ACT CTC AGC TCC GGG AAC GCC AGC CCC TTC TGT GAC 768Cys Pro Phe Asp Thr Leu Ser Ser Gly Asn Ala Ser Pro Phe Cys Asp245 250 255CTA TTT ACC GCG GAG GAG TAT GTG TCG TAC GAG TAC TAC TAT GAC CTC 816Leu Phe Thr Ala Glu Glu Tyr Val Ser Tyr Glu Tyr Tyr Tyr Asp Leu260 265 270GAC AAG TAC TAT GGC ACG GGC CCC GGG AAC GCT CTC GGT CCT GTC CAG 864Asp Lys Tyr Tyr Gly Thr Gly Pro Gly Asn Ala Leu Gly Pro Val Gln275 280 285GGC GTC GGA TAC GTC AAT GAG CTG CTT GCA CGC TTG ACC GGC CAA GCC 912Gly Val Gly Tyr Val Asn Glu Leu Leu Ala Arg Leu Thr Gly Gln Ala290 295 300GTT CGA GAC GAG ACG CAG ACG AAC CGC ACG CTC GAC AGC GAC CCT GCA 960Val Arg Asp Glu Thr Gln Thr Asn Arg Thr Leu Asp Ser Asp Pro Ala305 310 315 320ACA TTC CCG CTG AAC CGT ACG TTC TAC GCC GAC TTC TCG CAT GAT AAC 1008Thr Phe Pro Leu Asn Arg Thr Phe Tyr Ala Asp Phe Ser His Asp Asn325 330 335ACC ATG GTG CCC ATC TTT GCG GCG CTC GGG CTC TTC AAC GCC ACC GCC 1056Thr Met Val Pro Ile Phe Ala Ala Leu Gly Leu Phe Asn Ala Thr Ala340 345 350CTC GAC CCG CTG AAG CCC GAC GAG AAC AGG TTG TGG GTG GAC TCT AAG 1104Leu Asp Pro Leu Lys Pro Asp Glu Asn Arg Leu Trp Val Asp Ser Lys355 360 365CTG GTA CCG TTC TCT GGA CAT ATG ACG GTC GAG AAG CTG GCA TGT TCT 1152Leu Val Pro Phe Ser Gly His Met Thr Val Glu Lys Leu Ala Cys Ser370 375 380GGG AAG GAG GCG GTC AGG GTG CTC GTG AAC GAC GCG GTG CAG CCG CTG 1200Gly Lys Glu Ala Val Arg Val Leu Val Asn Asp Ala Val Gln Pro Leu385 390 395 400GAG TTC TGC GGA GGT GTT GAT GGG GTG TGC GAG CTT TCG GCT TTC GTA 1248Glu Phe Cys Gly Gly Val Asp Gly Val Cys Glu Leu Ser Ala Phe Val405 410 415GAG AGC CAG ACG TAT GCG CGG GAG AAT GGG CAA GGC GAC TTC GCC AAG 1296Glu Ser Gln Thr Tyr Ala Arg Glu Asn Gly Gln Gly Asp Phe Ala Lys420 425 430TGC GGC TTT GTT CCG TCG GAA TAG 1320Cys Gly Phe Val Pro Ser Glu *435 440SEQ ID No.2显示本发明植酸酶的氨基酸序列。2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)长度439个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:Met Val Ser Ser Ala Phe Ala Pro Ser Ile Leu Leu Ser Leu Met Ser1 5 10 15Ser Leu Ala Leu Ser Thr Gln Phe Ser Phe Val Ala Ala Gln Leu Pro20 25 30Ile Pro Ala Gln Asn Thr Ser Asn Trp Gly Pro Tyr Asp Pro Phe Phe35 40 45Pro Val Glu Pro Tyr Ala Ala Pro Pro Glu Gly Cys Thr Val Thr Gln50 55 60Val Asn Leu Ile Gln Arg His Gly Ala Arg Trp Pro Thr Ser Gly Ala65 70 75 80Arg Ser Arg Gln Val Ala Ala Val Ala Lys Ile Gln Met Ala Arg Pro85 90 95Phe Thr Asp Pro Lys Tyr Glu Phe Leu Asn Asp Phe Val Tyr Lys Phe100 105 110Gly Val Ala Asp Leu Leu Pro Phe Gly Ala Asn Gln Ser His Gln Thr115 120 125Gly Thr Asp Met Tyr Thr Arg Tyr Ser Thr Leu Phe Glu Gly Gly Asp130 135 140Val Pro Phe Val Arg Ala Ala Gly Asp Gln Arg Val Val Asp Ser Ser145 150 155 160Thr Asn Trp Thr Ala Gly Phe Gly Asp Ala Ser Gly Glu Thr Val Leu165 170 175Pro Thr Leu Gln val Val Leu Gln Glu Glu Gly Asn Cys Thr Leu Cys180 185 190Asn Asn Met Cys Pro Asn Glu Val Asp Gly Asp Glu Ser Thr Thr Trp195 200 205Leu Gly Val Phe Ala Pro Asn Ile Thr Ala Arg Leu Asn Ala Ala Ala210 215 220Pro Ser Ala Asn Leu Ser Asp Ser Asp Ala Leu Thr Leu Met Asp Met225 230 235 240Cys Pro Phe Asp Thr Leu Ser Ser Gly Asn Ala Ser Pro Phe Cys Asp245 250 255Leu Phe Thr Ala Glu Glu Tyr Val Ser Tyr Glu Tyr Tyr Tyr Asp Leu260 265 270Asp Lys Tyr Tyr Gly Thr Gly Pro Gly Asn Ala Leu Gly Pro Val Gln275 280 285Gly Val Gly Tyr Val Asn Glu Leu Leu Ala Arg Leu Thr Gly Gln Ala290 295 300Val Arg Asp Glu Thr Gln Thr Asn Arg Thr Leu Asp Ser Asp Pro Ala305 310 315 320Thr Phe Pro Leu Asn Arg Thr Phe Tyr Ala Asp Phe Ser His Asp Asn325 330 335Thr Met Val Pro Ile Phe Ala Ala Leu Gly Leu Phe Asn Ala Thr Ala340 345 350Leu Asp Pro Leu Lys Pro Asp Glu Asn Arg Leu Trp Val Asp Ser Lys355 360 365Leu Val Pro Phe Ser Gly His Met Thr Val Glu Lys Leu Ala Cys Ser370 375 380Gly Lys Glu Ala Val Arg Val Leu Val Asn Asp Ala Val Gln Pro Leu385 390 395 400Glu Phe Cys Gly Gly Val Asp Gly Val Cys Glu Leu Ser Ala Phe Val405 410 415Glu Ser Gln Thr Tyr Ala Arg Glu Asn Gly Gln Gly Asp Phe Ala Lys420 425 430Cys Gly Phe Val Pro Ser Glu*435 440
权利要求
1．表现有植酸酶活性的，并包括SEQ ID NO:2之氨基酸序列，或与该序列至少70％同源的氨基酸序列的分离的多肽。
2．表现有植酸酶活性的，并包括SEQ ID NO:2之氨基酸序号31至439的氨基酸序列，或包括至少与该序列70％同源的氨基酸序列的分离的多肽。
3．表现有植酸酶活性并由下列序列的植酸酶编码部分编码的分离的多肽ⅰ)SEQ ID NO:1，或ⅱ)克隆到存在于大肠杆菌DSM11312中之质粒pYES2.0中的DNA序列，或与所说的多肽至少70％同源的类似物或衍生物。
4．编码有植酸酶活性的多肽的分离的DNA序列，所说的DNA序列选自于(a)SEQ ID NO:1的植酸酶编码部分；(b)克隆到存在于大肠杆菌DSM11312中之质粒pYES2.0中的DNA序列的植酸酶编码部分；(c)(a)或(b)中限定的DNA序列的至少与所说的DNA序列70％同源的类似物；(d)能够在中度/高度严格性条件下与(a)或(b)的DNA序列杂交的DNA序列；(e)由于遗传密码的简并性而不与(a)或(b)的序列杂交的，但编码包括SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列之多肽的DNA序列。
5．包含根据权利要求4之克隆的DNA序列的载体。
6．包含根据权利要求4之克隆的DNA序列或根据权利要求5之载体的宿主细胞。
7．制备有植酸酶活性的多肽的方法，该方法包括在得以产生该多肽的条件下培养根据权利要求6的细胞，并从培养液中回收该多肽。
8．包含权利要求1-3中任何一项的至少一种多肽的饲料或食品。
9．制备根据权利要求8的饲料或食品的方法，其中在食品或饲养成分中加入至少一种多肽。
10．包含权利要求1-3之任一项的多肽的组合物。
11．适用于食品或饲料制品中的根据权利要求10的组合物。
12．根据权利要求10-11之任一项的组合物，其为动物饲料添加剂。
13．降低动物粪尿中植酸盐水平的方法，包括用有效量的根据权利要求8的，或可按照权利要求9的方法得到的饲料喂饲动物。
14．权利要求1-3中任何一项的多肽用于从植酸中释放无机磷酸盐的应用。
15．权利要求1-3中任何一项的多肽或权利要求10-12中任何一项的组合物用于改善食品或饲料利用率的应用。
全文摘要
本发明涉及表现有植酸酶活性的分离的多肽、相应的克隆的DNA序列、制备该多肽的方法,及其在许多工业用途中,特别是在动物饲料中的应用。新的植酸酶衍生于Peniophora lycii并具有某些令人感兴趣的特征,例如对植酸的6－位有高的初始亲和性、从植酸中释放磷酸盐的高初始速率,以及特别高的比活性。
文档编号C12R1/69GK1234070SQ97199018
公开日1999年11月3日 申请日期1997年12月10日 优先权日1996年12月20日
发明者S·F·拉森, L·比克, C·C·夫格桑, J·布林霍特, A·奥赫曼, P·R·奥斯特加德 申请人:诺沃挪第克公司