专利名称：用于皮肤护理中的稳定化蛋白酶的制作方法
用于皮肤护理中的稳定化蛋白酶优先权本申请要求2010年I月19日提交的美国临时申请No. 61/296,052的优先权。概述公开了一项发明，其涉及合成用作皮肤护理剂的源自植物的固定化和交联的蛋白酶。所得到的稳定化蛋白酶将因为其固定化性质而最少限度地渗透皮肤。该蛋白酶将因其交联性质并且在某些实施方案中归因于其借助物理添加剂的稳定作用而保留活性。本发明尤其涉及在局部皮肤应用中使用的连接的木瓜蛋白酶产物。背景 蛋白酶的活性在表皮稳态方面是重要的。因此，当施加至皮肤时，蛋白酶具有多种潜在益处，但是受某些限制作用影响。木瓜蛋白酶是一种源自番木瓜和某些其他植物的有力蛋白酶。然而，它在溶液状态下迅速丧失活性。这是因为与全部蛋白酶相似，木瓜蛋白酶自我消化以及经历变性。此外，当使用常规木瓜蛋白酶产物作为与皮肤渗透和皮肤刺激相关的局部皮肤护理剂时，可以遭遇伴随这些木瓜蛋白酶产物的其他难题。高度地希望的是开发在皮肤护理中使用的没有此类限制的蛋白酶产物，并且更具体地，木瓜蛋白酶产物。为克服常规技术中的上述难题，本发明的示例性实施方案提供借助本文所述的技术改良的稳定的交联蛋白酶产物，并且尤其提供改良的稳定的交联蛋白酶产物。例如，在本发明的一些实施方案中，为了获得稳定的交联木瓜蛋白酶产物、将木瓜蛋白酶在初级交联反应中固定在聚合物如例如卡波姆或卡波普上，并且随后通过添加具有胺反应性的低分子量同源双功能交联试剂(例如己二亚氨酸二甲酯(DMA, Dimethyladipimidate)、辛二酸双(横基玻拍酸亚胺)酯(BS3, Bis (Sulfosuccinimidyl) suberate)、辛二亚氨酸二甲酯(DMS, Dimethyl Suberimidate)、庚二亚氨酸二甲酯(DMP, Dimethylpimelimidate)和辛二酸二玻拍酸亚胺酯(DSS, Disuccinimidyl suberate))进行二级交联反应。在本发明的其他示例性实施方案中，进行初级交联反应和二级交联反应以获得稳定的交联木瓜蛋白酶产物，并且随后稳定的交联木瓜蛋白酶使用物理稳定剂例如糖或糖聚合物进一步稳定。例如，藻酸钠可以根据本发明的示例性实施方案用作物理稳定剂。以上交联的稳定化木瓜蛋白酶产物仍可以通过包括在某些防腐剂体系或水包油制剂中的以上稳定化木瓜蛋白酶产物被进一步稳定化。根据本发明的示例性实施方案的固定化、交联和稳定化蛋白酶(例如木瓜蛋白酶)复合物的益处包括但不限于I.最小的皮肤渗透作用，2.在溶液中或干燥形式下保留蛋白酶活性3.最小的皮肤刺激作用，和4.易于配制。在本发明的其他实施方案中，描述了包含稳定化蛋白酶的化妆品组合物、个人护理组合物和药物组合物。
附图简述以下附图仅出于说明目的而提供，并且不意图是限制性的。图I说明用于形成根据本发明的稳定的交联蛋白酶的交联反应。图2说明根据本发明的示例性实施方案的稳定的交联木瓜蛋白酶产物，所述产物已经历过图I中说明的交联反应。图3说明在多个温度下贮存根据本发明的示例性实施方案的稳定化木瓜蛋白酶的样品多达12周后第0天活性的百分比。图4说明在多个温度下贮存无DMA样品多达12周后第0天活性的百分比。图5说明Sigma木瓜蛋白酶标准曲线。图6(a)说明根据本发明的示例性实施方案在多个温度下贮存稳定化木瓜蛋白酶样品多达12周后保留的第0天活性的百分比。图6 (b)说明在多个温度下贮存无DMA样品多达12周后保留的第0天活性的百分比。图7是说明在根据本发明的示例性实施方案的稳定的交联木瓜蛋白酶产物中不存在游离的活性木瓜蛋白酶的图表。图8是说明含有0. 2% BS3的样品和不含任何BS3的对照样品在不同温度下I周后的活性百分比的图表。图9是说明稳定化木瓜蛋白酶样品在有和没有0. 1%藻酸盐的情况下4周后的保留活性的百分比的图表。
图10是Sigma木瓜蛋白酶标准曲线。图11是说明糖或糖聚合物对在25°C和40°C下10天后的游离木瓜蛋白酶的稳定性的影响的图表。图12是说明0. 4%木瓜蛋白酶在2周后保留的活性的百分比的图表。图13(a)说明已经由DMA交联并且已经与藻酸钠进一步反应的稳定的交联木瓜蛋白酶产物。图13 (b)是说明在多个温度下贮存I % DMA样品多达12周后保留的活性的百分比的图表。图13(c)是说明在多个温度下贮存无DMA样品多达12周后第0天活性的百分比的图表。图14是说明DMA对连接的木瓜蛋白酶的活性保留的影响的曲线图。图15是说明在不同温度下12周后的连接木瓜蛋白酶样品中的活性的图表。图16是Sigma木瓜蛋白酶标准曲线。图17是说明在制剂中保留的(含DMA的)连接木瓜蛋白酶的活性的曲线图。图18是说明在制剂中保留的(不含DMA的)连接木瓜蛋白酶的活性的曲线图。图19是说明在制剂内保留的连接木瓜蛋白酶的活性的曲线图。图20是在安慰剂制剂中的Sigma木瓜蛋白酶的标准曲线。图21是说明在油和水制剂中保留的连接木瓜蛋白酶的活性的曲线图。详述除非另外限定，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料可以用于实施或检验本发明，然而现在描述合适的方法和材料。本文所提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用方式完整地并入。在矛盾的情况下，本说明书(包括定义)将居主导。此外，所述材料、方法和实施例仅是说明性的并且不意图是限制性的。本发明的其他特征和优点将从以下详细描述并且从权利要求书中是显而易见的。如对本领域技术人员而言将显而易见的，本文所述的具体特征和实施方案可以与任何其他特征或实施方案组合。表皮由几个层(strata)或层组成。最外层一角质层由死亡的细胞组成，所述细胞已经在几天范围内从该层下方向上移行。这些死亡细胞通常借助一个称作表皮脱屑的过程从皮肤表面撒落，所述过程刺激新细胞在更深水平下生长。较年幼的皮肤在这个过程中比老化或受损的皮肤更高效。因此，老化的皮肤显得晦暗、厚和较无光泽(less toned)。这可以因环境因素而恶化，如暴露于阳光；激素影响，如雄激素、雌激素和表皮生长因子；和维生素缺乏如维生素A和D的缺乏。蛋白酶活性是脱屑过程中的关键因素。因此，为化妆效 果(如皮肤光滑和抗老化)施加蛋白酶至皮肤是合乎需要的。然而，蛋白酶在化妆品和其他应用中的用途已知具有三个主要限制不稳定性、可能有变应原性和皮肤渗透作用。本发明基于，至少部分地基于这样的发现蛋白酶可以借助某些交联反应来稳定以形成蛋白酶卡波姆共聚物，在本文也称作“稳定化蛋白酶”。此类稳定化蛋白酶包含与卡波姆交联的蛋白酶，其中蛋白酶的伯胺与卡波姆的羧基交联并且其中蛋白酶的胺经胺反应性交联试剂进一步交联。在本发明的一个实施方案中，稳定化蛋白酶还包含物理稳定剂，例如糖或糖聚合物。还公开了一种形成此类稳定化蛋白酶产物的方法，其中进行初级交联反应以将与所述蛋白酶的伯胺与卡波姆的羧基交联并且通过胺反应性交联试剂进行二级交联反应。蛋白酶蛋白酶是催化蛋白质分解的酶。蛋白酶，本身作为蛋白质，具有自我降解的倾向并且在本质上是不稳定的。这种蛋白质本质也使得它们具有变应原性。另外，因为它们降解蛋白质的能力，所以它们可以渗透至表皮的更深层并且对下层造成损伤。用于本发明中的合适蛋白酶包括木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶和奇异果蛋白酶。无花果蛋白酶是从无花果(榕属(Ficus)树的果实)的胶乳中分离的非特异性巯基蛋白酶。无花果蛋白酶最常见地从无花果(Ficus carica)和脱毛格木(Ficus glabatra)获得。然而，无花果蛋白酶也可以从其他格属物种(如印度格(Ficus elastica)和Ficusinsipida)的果实中分离。菠萝蛋白酶是从菠萝(凤梨(Ananas comosus))的莖和/或果实分离的巯基蛋白酶。奇异果蛋白酶，也称猕猴桃蛋白酶，是一种从猕猴桃果实(硬毛猕猴桃(Actinidia deliciosa))获得的半胱氨酸蛋白酶。木瓜蛋白酶是一种从番木瓜(Carciapapaya)和山地番木瓜(Vasconcellea cundinamarcensis)、最经常地从绿色未成熟果实的胶乳中获得的半胱氨酸蛋白酶。这些蛋白酶按重量计以约0. 1%和5%之间的浓度存在。卡波姆蛋白酶首先固定在卡波姆上。卡波姆是具有高分子量的丙烯酸的均聚物，所述丙烯酸与几种多元醇烯丙基醚(例如烯丙基醚季戊四醇、蔗糖的烯丙基醚或丙烯的烯丙基醚)中的任一种交联。合适卡波姆的例子是卡波姆910、卡波姆934、卡波姆934p、卡波姆940和卡波姆941，其中数字后缀表示聚合物链的平均分子量。如本文所用，“固定化”蛋白酶或“连接的”蛋白酶指已经通过初级交联反应与卡波姆反应的蛋白酶。适用于这种初级交联反应的交联剂是能够将羧基与伯胺偶联的试剂。合适交联剂的一个例子是水溶性碳二亚胺I-乙基-3-(3- 二甲氨基丙基)碳二亚胺。EDC是用来将羧基与伯胺偶联的零长度交联剂。EDC与羧酸基团反应以产生O-酰基异脲基团，该基团与游离的胺基团反应后形成交联键。EDC在这个实施方案中是在反应期间转变成双取代脲的初级交联剂。NHS是一种增加交联速率并且在交联反应期间保持不变的酸酯和催化剂。化学交联剂一旦固定在卡波姆上，则固定化蛋白酶与胺反应性交联试剂在二级交联反应中反应以形成蛋白酶卡波姆共聚物，在本文也称作“稳定化蛋白酶”。交联试剂优选地是低分子量交联试剂，从而该交联试剂将在二级交联反应中完全反应或近乎完全反应。可以使用的合适交联试剂的例子包括亚氨酯交联试剂如己二亚氨酸二甲酯(DMA)、庚二亚氨酸二甲酯(DMP)、辛二亚氨酸二甲酯(DMS)和二甲基3,3 二硫代双(dimethyl 3, 3dithiobis)。胺反·应性交联试剂可以按重量计以范围从约0. 05%至约5 %、优选地约I %和5%之间的多个浓度提供。在某些实施方案中，使用DMA。物理稳定剂在化学交联后，固定化和交联的蛋白酶任选地用物理稳定剂例如糖或糖聚合物进一步稳定。合适的糖或糖聚合物的例子是藻酸钠、海藻糖、甘露醇、甘油和黄原胶。在一个实施方案中，使用藻酸钠。这种物理稳定剂可以按重量计约0. 1%和5%之间的浓度包含。在图I中显示用于形成本发明稳定化蛋白酶的一个实施方案的交联反应的图示。在图2中显不稳定化木瓜蛋白酶广物的图不。应用/制剂本发明的稳定化蛋白酶具有最小的皮肤渗透作用，以溶液或干燥形式保留蛋白酶活性，具有最小的皮肤刺激作用并且相对易于在制剂中提供。因此，与常规技术的蛋白酶产物相比，本发明的示例性实施方案提供更稳定和安全得多的蛋白酶产物，特别是稳定化木瓜蛋白酶产物实施方案。稳定化蛋白酶适用于化妆品和个人护理制剂中，例如，剥脱制品、抗皱纹和/或抗老化制品、沐浴添加剂、护发制品、液体皂和销售皂、清洁溶液、湿润清洁布、油剂或粉剂、抗痤疮制品。稳定化蛋白酶特别适于通过施加本发明的一种或多种稳定化蛋白酶至需要治疗的干燥、老化或受损皮肤来治疗干燥、老化或受损的皮肤。化妆品和/或个人护理制剂可以为例如油包水或水包油乳液、醇性或含醇制剂、离子型或非离子型两性脂质的囊泡状分散体或凝胶的形式。示例性化妆品和/或个人护理制剂包含按重量计约0. 5%和5%之间、优选地约1%和3%之间的稳定化蛋白酶。本发明的稳定化蛋白酶也适于药物应用，例如，清创应用。清创是从伤口(例如溃疡伤口或烧伤)除去死亡或受损组织以辅助愈合。在本发明的一个实施方案中，将本发明的一种或多种稳定化蛋白酶施加至需要清创的皮肤伤口或烧伤。用于治疗伤口或烧伤的包含稳定化蛋白酶的示例性制剂和产品包括绷带/敷料、贴剂、洗涤溶液剂、油膏剂或凝胶剂或合成性组织。在某些实施方案中，清创组合物，例如绷带、敷料或贴剂，可以任选地包括抗微生物药。对于清创应用，在药物组合物中包括的稳定化蛋白酶的量将是有效清除坏死组织和使伤口中的脓液化并且在合理时间内(例如，在七天时间内)实现基本上除去全部此类物质的量。除皮肤护理应用之外，本发明的稳定化蛋白酶也可以适于本领域已知的其中将希望有稳定形式蛋白酶的其他应用中。一 个示例性应用是口腔护理组合物。包含稳定化蛋白酶的局部用组合物可以进一步包含在化妆品制剂、个人护理制剂或药物制剂中常规使用的多种其他成分，只要它们没有不可接受地更改本发明的益处。任选常规成分类别的非限制性例子包括香料、颜料、着色剂、精油、收敛剂、抗老化剂、抗痤疮剂、抗结块剂、消泡剂、抗微生物剂、抗氧化剂、粘合剂、PH调节剂、皮肤漂白剂和光亮剂、皮肤调理剂、防晒剂、防腐剂、抗炎剂、润湿剂、增稠剂和维生素。对于化妆品、个人护理和/或药物应用的某些实施方案，需要随稳定化蛋白酶进一步包括防腐剂体系。酶已知在苛刻条件(如较高温度和存在不相容性的化学品如强力乳化剂)下变性。与稳定化蛋白质一起使用并且特别适用于稳定化木瓜蛋白酶的两个示例性防腐剂体系是(a)苯氧乙醇+苯甲酸(b) Diocide (苯氧乙醇+辛二醇+己二醇的掺合物)
实施例本发明在以下实施例中进一步描述，这些实施例不限制在权利要求书中描述的本发明范围。实施例I通过进行初级交联反应产生了保留其蛋白酶活性并且比含有游离木瓜蛋白酶更安全的稳定的木瓜蛋白酶产物，在所述初级交联反应中，使用碳二亚胺I-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)连同N-羟基磺基琥珀酰亚胺(NHS) —起，使1%木瓜蛋白酶与卡波姆交联。接下来，随后进行二级交联反应，在所述二级交联反应中，固定化木瓜蛋白酶与己二亚氨酸二甲酯(DMA)反应以进一步交联了交联的木瓜蛋白酶，从而形成稳定的交联木瓜蛋白酶产物。按重量计，DMA以1%浓度提供并且木瓜蛋白酶以1%浓度提供。产生三个(3)实验性实验批次的以上稳定化木瓜蛋白酶产物以确定1% DMA在经过12周的贮存期后对初级交联木瓜蛋白酶的酶活性/稳定性的影响。表I中描述了用于开展这些实验的反应条件。表I
权利要求
1.一种稳定化蛋白酶产物，包含 与卡波姆交联的蛋白酶，其中所述蛋白酶的伯胺与卡波姆的羧基交联并且其中所述蛋白酶的胺经胺反应性交联试剂进一步交联。
2.如权利要求I所述的稳定化蛋白酶，其中所述稳定化蛋白酶还包含物理稳定剂。
3.如权利要求2所述的稳定化蛋白酶，其中所述物理稳定剂是糖或糖聚合物。
4.如权利要求3所述的稳定化蛋白酶，其中所述稳定化蛋白酶包含O.1%和5%之间的物理稳定剂。
5.如权利要求3所述的稳定化蛋白酶，其中所述糖或糖聚合物选自藻酸钠、海藻糖、甘露醇、甘油、黄原胶、蔗糖和山梨醇。
6.如权利要求5所述的稳定化蛋白酶，其中所述物理稳定剂是藻酸钠。
7.如权利要求I所述的稳定化蛋白酶，其中所述蛋白酶选自木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶和猕猴桃蛋白酶。
8.如权利要求7所述的稳定化蛋白酶，其中所述蛋白酶是木瓜蛋白酶。
9.如权利要求7所述的稳定化蛋白酶，其包含O.1%和5%之间的所述蛋白酶。
10.如权利要求I所述的稳定化蛋白酶，其中所述胺反应性交联试剂选自己二亚氨酸二甲酯(DMA)、辛二酸双(磺基琥珀酰亚胺)酯(BS3)、辛二亚氨酸二甲酯(DMS)、庚二亚氨酸二甲酯(DMP)和辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)。
11.如权利要求I所述的稳定化蛋白酶，其中所述蛋白酶是木瓜蛋白酶并且所述胺反应性交联试剂是DMA。
12.如权利要求I所述的稳定化蛋白酶产物，还包含防腐剂体系。
13.如权利要求12所述的稳定化蛋白酶产物，其中所述防腐剂体系包含苯氧乙醇和苯甲酸。
14.如权利要求12所述的稳定化蛋白酶产物,其中所述防腐剂体系包含diocide。
15.一种形成稳定化蛋白酶的方法，包括 进行初级交联反应以将与所述蛋白酶的伯胺与卡波姆的羧基交联；并且 借助胺反应性交联试剂在所述蛋白酶上进行二级交联反应。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述初级交联反应使用交联试剂碳二亚胺I-乙基-3 (3- 二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基磺基琥珀酰亚胺实施。
17.如权利要求15所述的方法，其中用于进行二级交联反应的交联试剂是一种选自己二亚氨酸二甲酯(DMA)、辛二酸双(磺基琥珀酰亚胺)酯(BS3)、辛二亚氨酸二甲酯(DMS)、庚二亚氨酸二甲酯(DMP)和辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)的交联试剂。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述用于进行二级交联反应的交联试剂是DMA。
19.如权利要求15所述的方法，其中所述二级交联反应借助按重量计I%至5 %的胺反应性交联试剂进行。
20.如权利要求15所述的方法，还包括在进行所述二级交联反应后添加物理稳定剂。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述物理稳定剂是藻酸钠。
22.—种治疗干燥、老化或受损皮肤的方法，包括施加包含一种或多种如权利要求I所述的稳定化蛋白酶的化妆品组合物至所述皮肤。
23.一种伤口或烧伤清创的方法，包括局部施加包含一种或多种如权利要求I所述的稳定化蛋白酶的 组合物。
全文摘要
公开了一项涉及合成用作皮肤护理剂的源自植物的固定化和交联的蛋白酶的发明。所得到的稳定化蛋白酶将因为其固定化性质而最少限度地渗透皮肤。该蛋白酶将因其交联性质并且在某些实施方案中归因于其借助物理添加剂的稳定作用而保留活性。本发明尤其涉及在局部皮肤应用中使用的连接的木瓜蛋白酶产物。
文档编号A61K8/73GK102802670SQ201180014449
公开日2012年11月28日 申请日期2011年1月19日 优先权日2010年1月19日
发明者M·恰范 申请人:巴斯夫公司