专利名称：一种酶蛋白环化方法
技术领域：
本发明涉及一种新的酶蛋白环化方法，以提高蛋白酶的性能，特别涉及双内含肽介导的酶蛋白环化方法。本发明还涉及一种增强热稳定性的环化木聚糖酶。
背景技术：
许多天然的酶在应用中存在着许多性能上的不足，如热稳定性低。酿造、饲料工业中的高温制粒的过程需要75V -90°C温度，并持续数分钟，在此过程中会大幅的丧失酶的活性，限制了天然酶在工业生产中的应用。因此提高酶的热稳定性成为急需解决的问题。体外蛋白环化是一种新技术，环化后可增加蛋白的热稳定性，减少蛋白对水解酶剪切的抗性，同时也可增强蛋白的化学抗性。2000年Thomas C. Evans和Ming-Qun Xu利用^p DnaE内含肽，在体内环化了有395个氨基酸的麦芽糖结合蛋白，此种内含肽环化方法的缺点是不利于进行体外环化，因此实现体外蛋白的环化是需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的是开发一种新的体外酶蛋白环化技术，提供具有热稳定性的环化酶。技术解决方案本发明提供了一种环化的酶，其特征在于，其酶蛋白的N、C两端相链接。本发明提供了一种环化酶蛋白的方法，包括整套表达载体的构建、重组子的筛选及环化分子的鉴定方法，其特征在于通过两种内含肽介导环化酶蛋白质，用天然的肽键将酶蛋白的N、C两端链接起来。所述二种内含肽是集胞蓝细菌(Synechocystis sp. ) Ssp DnaB内含肽(GenBank 为 DQ371396.1)和蟾分枝杆菌(Mycobacterium xenopi)Mxe GyrA 内含肽(GenBank 为 U67876.1)。用发明的方法可以对多种天然酶蛋白进行体外环化，其限制条件是酶蛋白的多肽序列的第一个氨基酸是半胱氨酸，且酶蛋白的三维晶体结构已知，同时酶蛋白的N、C两端应位于蛋白结构的同侧。在本发明的一个实例中，所述酶蛋白是木聚糖酶蛋白，经实验证实，环化后的木聚糖酶的热稳定性有所提高。本发明对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的木聚糖酶基因xylB进行环化，环化方法是将核苷酸序列(GenBank为DQ100307. 1)的基因在大肠杆菌中环化表达，通过两种内含肽介导木聚糖酶环化。用本发明的方法改良的木聚糖酶具有更好的热稳定性。1.基因克隆从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的基因组中PCR得到一个中性木聚糖酶基因xylB。2.环化载体的构建从质粒pTWim (ENB公司)上PCR扩增出集胞蓝细菌kp DnaB 内含肽的序列和蟾分枝杆菌Mxe GyrA内含肽的序列。将DnaB片段、xylB基因和Mxe GyrA 序列顺序连接形成融合基因，插入到经酶切消化后的PTWim载体上，形成表达载体pTX。转化到大肠杆菌，获得重组子。3.蛋白的表达和纯化加入IPTG诱导表达木聚糖酶前体，通过几丁质亲和柱得到体外的木聚糖酶融合前体。之后通过温度诱导和MESNA诱导蛋白环化的发生。验证蛋白的环化情况。4.木聚糖酶性质的测定使用DNS法测定木聚糖酶的酶活。
图1为大肠杆菌重组载体pTX的物理图谱；图2表示60 90°C下，环化木聚糖酶和野生木聚糖酶在各温度保温30分钟后，剩余酶活的百分比；图3为SDS-PAGE电泳鉴定蛋白环化情况。图中1为蛋白酶切割后的线性蛋白，2 为环化木聚糖酶。
具体实施例方式下面具体实施例中，用木聚糖酶的环化过程进一步阐述本发明的环化方法。应理解，该实施例仅用于举例说明本发明的方法，而不限制所用酶蛋白的范围。实验条件菌株与载体大肠杆菌菌株E. coli BL21 (DE3)购自Novagen公司，pTWINl质粒购自ENB公司。酶与试剂盒限制性内切酶，连接酶，Taq酶，Factor )(a为NEB公司产品。基因组提取试剂盒为天根生化公司产品。生化试剂DNA合成试剂为Millipore公司产品。引物合成为ABI公司Cyclone DNA 合成仪。IPTG、X-Gal、SDS、木聚糖及MESNA为Sigma公司产品。TEMED、过硫酸铵、丙烯酰胺及甲叉双丙烯酰胺为!Iomega公司产品。木糖、磷酸二氢钠和柠檬酸为国产分析纯。几丁质树脂和lector Xa为NEB公司产品。乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH 5. 5)称取三水乙酸钠23. 14g，加入冰乙酸1. 70ml，再加水溶解，定容至2000ml。1. 0%木糖溶液(w/v)称取无水木糖1. 000g，加缓冲液(3. 4)溶解，定容至100ml。1. 0%木聚糖溶液(w/v)称取木聚糖(Sigma X0672) 1. 00g，加入氢氧化钠0. 34g， 再加入60ml水，搅拌至木聚糖完全溶解。再加入冰乙酸0. 5ml，再用乙酸溶液调节pH值至 5.5。继续搅拌30min，用乙酸-乙酸钠缓冲溶液定容至100ml。木聚糖溶液能立即使用，使用前适当摇勻。4°C避光保存，有效期为7天。DNS试剂称取3，5- 二硝基水杨酸3. 15g(化学纯)，加水500ml，搅拌5s，水浴至45°C.然后逐步加入100ml 200g/L氢氧化钠溶液，同时不断搅拌，直到溶液清澈透明 (注意在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48°C .).再逐步加入四水酒石酸钾钠 91. 0g，苯酚2. 50g和无水亚硫酸钠2. 50g。继续45°C水浴加热，同时补加水300ml，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解.停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000ml。用烧结玻璃过滤器过滤.取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存.室温下存放7天后可以使用。培养基大肠杆菌培养基为LB(1%蛋白胨、0. 5%酵母提取物、NaCl, pH7. 0)。
实施例中其它未注明具体条件的实验方法，按照常规方法进行，如Sambrook等人的方法，分子克隆按(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)实验室手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。仪器与设备超声波破碎仪，分析天平，PH计，离心机，恒温水浴，紫外分光光度计及4度冰箱，蛋白电泳仪。实施例1木聚糖酶基因的克隆及环化载体的构建首先提取质粒pTWINl(ENB公司)，以所提取质粒为模板，PCR扩增集胞蓝细菌 Ssp DnaB内含肽的序列。所使用的引物根据DnaB基因的5’和3’端序列合成，2个引物序列分别为5，ATACATATGA AAATCGAAGA AGGTAAAC 3，禾口 5，GAATTCGTTG TGTACAATGA TGTCATTC 3，，扩增后进行凝胶电泳，回收大小680bp的片段。之后经过Nde I和EcoR I 双酶切后回收片段。另外，以所提质粒为模板，PCR扩增蟾分枝杆菌Mxe GyrA内含肽的序列。所使用的引物根据Mxe GyrA基因的5’和3’端序列合成，2个引物序列分别为 5，CTCGAGTGCATCACGGGAGATGCACTAG 3，和 5，GGATCCCCTTCCTGCAGTCATTGAAG 3，，扩增后进行凝胶电泳，回收大小806bp的片段。之后将得到片段使用BioI和BamHI双酶切，后回收片段。提取枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)基因组，以所提取的基因组为模板， 进行PCR扩增，电泳回收木聚糖酶xylB基因约678bp片段。所使用的引物根据xylB基因的5，禾Π 3，端序列合成，2个引物序列分别为5，GAATTCTGCTTTAACATTAGCATG 3，和 5，CTCGAGATATTCGCCTTTCCTTCCCTCG 3，。扩增后进行凝胶电泳，回收大小67^3ρ的片段，与 PGEM-T载体连接，转化大肠杆菌ToplO。LB培养基涂板后筛选阳性重组子，提取质粒进行鉴定，得到重组子PGEMX。之后提取pGEMX质粒，使用BioI和EcoRI酶切后回收678bp的片段。最后将回收后的dnaB基因片段、Mxe GyrA片段和xylB基因片段一同与经NdeI和 BamHI双酶切的pTWim质粒片段4°C连接过夜，转化大肠杆菌BL21 (DE3)，LB培养基涂板后筛选阳性重组子，提取质粒进行鉴定，得到重组子。xylB基因插入DnaB和GyrA两种内含肽之间，重组质粒PTX图谱见图1。实施例2木聚糖酶的体外环化1)蛋白环化及纯化程序将重组子接种到20mL的LB培养基中，37°C振荡培养过夜，按接种量接种于1 升LB培养基中，与37°C培养至OD为0. 5，加入IPTG至终浓度0. 5mM,继续培养3小时，诱导表达木聚糖酶。离心收集菌体，菌体重悬于IOOmL含500mM NaCl的Tris-HCl (pH7. 0)缓冲液中，超声波破碎菌体，I3OOOrpm离心30分钟去除细胞碎片。上清液通过几丁质柱，之后用20倍柱床体积的缓冲液l(20mM Tris-HCl pH7.0，0. 5M NaCl)彻底洗柱。停止柱流， 20°C放置16小时，诱导kp DnaB内含肽的剪切。后用3倍柱床体积的缓冲液1过柱，再使用3倍柱体积的缓冲液2(20mM Tris-HCl pH7. 0,0. 5M NaCl，含50mM MESNA)过柱，之后停止柱流，4°C放置过夜，诱导Mxe GyrA内含肽的剪切及环化的发生。次日，用3倍柱床体积的缓冲液1洗脱，大约收集8-10管，每管5ml。通过^Onm UV吸光值进行蛋白检测。2)环化情况的检验将洗脱得到的蛋白液取50 μ 1，加入1 μ 1 Factor fci蛋白酶20°C切割6小时酶。之后将酶切前后的蛋白液进行SDS-PAGE电泳。环化的蛋白的电泳迁移速率要快于经!^ctoriCa蛋白酶切割线性后的蛋白，由此判断环化的发生。结果见图3，环化的木聚糖蛋白的电泳迁移速率快于i^actoriCa蛋白酶重新线性化的蛋白迁移速率，证明环化成功。实施例3环化木聚糖酶酶活测定1)标准曲线制作分别吸取木糖标准液1. O，2. O，3. O，4. O，5. Oml于50ml容量瓶中，蒸馏水定容至刻度，稀释成浓度分别为0. 2,0. 4,0. 6,0. 8，1. Omg/ml木糖标准液。取不同浓度的稀释木糖标准液0. 5ml于三支试管中，加入磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲液1. 5ml，加入DNS试剂 3. 0ml，沸水浴5分钟，之后用加入去离子水稀释10ml，混勻。用去离子水做对照。冷却后 MOnm测定吸光值。以吸光值为纵坐标，木糖浓度为横坐标，绘制标准曲线。过木糖标准曲线的回归方程为y = 0. 148x-0. 0754，其中R2 = 0. 9997。2)木聚糖酶酶活测定酶活性单位(U)定义为1ml酶液于37°C、pH5. 5条件下，每分钟催化分解木聚糖产生1 μ mol木糖的酶量为一个酶活力单位U。酶活测定方法如下将实施例2中洗脱得到的酶液稀释500倍后，吸取0. 5ml，加入1 %木聚糖底物1. 5ml。混合后37°C水浴反应30分钟，加入DNS液3. Oml终止反应，然后沸水浴处理5分钟，取出后加入IOml蒸馏水，混勻后使用紫外分光光度计于540nm测定吸光值。将吸光值带入木糖标准曲线的回归方程算出对应的木糖浓度。测得吸光值A结果为0. 535，得到对应的木糖浓度为4. 124mg/mL·将所得的木糖浓度为4. 12%ig/ml，带入如下公式计算酶活力木聚糖酶活力(U/ml)= CX500X1000/MXt。式中，C为所得的木糖浓度；M为木糖的分子量(150. 2)；t为酶解反应时间30min。酶活测定结果所得酶活为458U/ml。实施例4环化木聚糖酶和野生型木聚糖酶的热稳定性测定比较在乙酸-乙酸钠缓冲溶液缓冲液体系缓冲液和条件下，热稳定性测定为酶液分别在65、70、75、80、85、90、95°C下水浴处理30分钟，之后迅速放入冰上冷却。在37°C下进行酶活测定，方法同实施例3。野生型木聚糖酶的纯化方法同实施例2，酶活测定方法同实施例3。不同之处是野生型木聚糖酶的第一个氨基酸为色氨酸。剩余酶活百分比为热处理后的酶活与未做热处理所测酶活之比，以处理温度为横坐标，剩余酶活％为纵坐标作图。如图 2所示，结果表明环化木聚糖酶95°C热处理后剩余酶活为206U/ml，为热处理前458U/ml的 45%，而野生型木聚糖酶95°C热处理后剩余酶活约为88U/ml，为热处理前20%。显示环化木聚糖酶较野生型木聚糖酶耐热性有所提高。
权利要求
1.一种环化酶蛋白的方法，包括整套表达载体的构建、重组子的筛选及环化分子鉴定， 其特征在于通过集胞蓝细菌kp DnaB内含肽和蟾分枝杆菌Mxe GyrA内含肽介导环化酶蛋白质，用天然的肽键将酶蛋白的N、C两端链接起来。
2.权利要求1所述的方法，所述酶蛋白的多肽序列的第一个氨基酸是半胱氨酸，且酶蛋白的三维晶体结构已知，同时酶蛋白的N、C两端应位于蛋白结构的同侧。
3.—种环化的酶，其特征在于酶蛋白的多肽序列第1个氨基酸为半胱氨酸，且酶蛋白的N、C两端相链接。
4.一种环化的木聚糖酶，编码该酶的基因具有GenBank为DQ100307. 1所示的核苷酸序列。
5.一种环化木聚糖酶蛋白的方法，其特征在于通过集胞蓝细菌kp DnaB内含肽和蟾分枝杆菌Mxe GyrA内含肽介导的环化方法，用天然的肽键将酶蛋白的N、C两端链接起来， 并且在大肠杆菌中表达GenBank为DQ100307. 1所示核苷酸序列的基因。
6.一种重组大肠杆菌细胞，含有GenBank为DQ100307. 1所示核苷酸序列的基因。
全文摘要
本发明涉及一种酶蛋白环化方法，通过集胞蓝细菌Ssp DnaB内含肽和蟾分枝杆菌Mxe GyrA内含肽介导环化酶蛋白质，用天然的肽键将酶蛋白的N、C两端链接起来。本发明用上述方法得到了增强热稳定性的环化木聚糖酶。
文档编号C12N9/00GK102296081SQ20101021812
公开日2011年12月28日 申请日期2010年6月24日 优先权日2010年6月24日
发明者平淑珍, 张维, 林敏 , 燕永亮, 赵仲麟, 陆伟, 陈明 申请人:中国农业科学院生物技术研究所