趋化因子受体cxcr3基因中与猪抗蓝耳病相关的snp标记及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及趋化因子受体CXCR3基因中与猪抗蓝耳病相关的SNP标记及其应用，所述与猪抗蓝耳病相关的SNP标记位于猪的趋化因子受体CXCR3基因上，所述SNP标记的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，其中，该序列的171bp和279bp两处碱基为T的待测猪为易感蓝耳病猪品种，而该两处碱基为C的待测猪为抗蓝耳病猪品种。本发明提供的分子遗传标记不受猪的年龄、性别等限制，可用于抗蓝耳病猪品种的早期选育，甚至在猪刚出生时就可准确地进行筛选，可大大加快抗蓝耳病猪的育种进程；筛选方法准确，操作简单，成本低，效率高。
【专利说明】趋化因子受体CXCR3基因中与猪抗蓝耳病相关的SNP标记 及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程及分子生物学领域，具体地说，涉及趋化因子受体CXCR3基 因中与猪抗蓝耳病相关的SNP标记及其应用。
【背景技术】
[0002] 猪繁殖与呼吸综合征（PRRS)，俗称"蓝耳病"是由猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)引起的，该病毒是巢状病毒目动脉炎病毒科的一个成员，同属的病毒还有马动脉炎 病毒，鼠乳酸脱氢酶酶病毒和猴出血热病毒。该病主要引起猪的繁殖与呼吸症状，表现为间 质性肺炎和母猪流产木乃伊胎等，每年对全世界的养猪业造成了巨大的经济损失。2007年 在中国爆发了一场高热病，该病迅速在全国范围扩散，超过200万头猪被感染，40万头猪死 亡，该病最后证实是由一种高致病性的蓝耳病毒引起的。PRRSV主要感染猪的肺泡巨噬细 胞，现在研究表明在感染PRRSV后，先天免疫中PRRSV感染不能引起有效的I型干扰素应 答，体液免疫不能及时产生有效的中和抗体，而且会形成抗体依赖的病毒增强效应，最终导 致免疫抑制和持续感染，由于该病毒的突变率极高，传统疫苗方法也不能有效控制该病，很 多研究都致力于寻找RNAi，干扰素等新的方法来针对该病毒，用于弥补传统方法的不足。
[0003] 由于不同的猪品种和个体的遗传背景差异，对蓝耳病的抗性也不同，研究表明在 临床症状和生理生化指标上，通城猪、梅山猪等国内猪品种相较于国外长白猪、大白猪等感 染高致病性PRRSV后有较强的抗性。通过高通量测序的方法，对感染PRRSV前后长白猪和 通城猪的组织做差异基因表达分析，某些免疫相关的基因表达量在感染前后两个品种间有 显著的差异。另外，存在一些品种间的SNP位点，这些基因在宿主的免疫应答中起到了很重 要的作用，而且这些SNP位于基因的外显子中，通过找出不同品种间PRRSV感染造成的基因 表达差异，不仅可以研究PRRSV的感染机制，还可以找出抗性或易感相关的基因，通过对品 种间的SNP进行比较分析，从而筛选出抗性较强的猪。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供趋化因子受体CXCR3基因中与猪抗蓝耳病相关的SNP标记及 其应用。
[0005] CXCR3是一种趋化因子受体，可结合CXCL9、CXCL10、CXCL11，可以调节白血球细胞 的转运。当这些趋化因子和CXCR3结合后可以促进引起一系列细胞应答，如细胞骨架的改 变，趋化运动等，还可以吸引Thl细胞，促进Thl细胞的成熟，在伤口的愈合中也起到一定的 作用，本发明人首次发现在两个不同抗性的猪品种：长白猪(易感猪)、通城猪(抗病猪）之间 的趋化因子受体CXCR3基因外显子中存在两个品种间SNP位点，用常规分子生物学方法检 测这两个位点的碱基类型，可以作为一种检测抗病和易感猪的方法。
[0006] 为了实现本发明目的，本发明提供一种与猪抗蓝耳病相关的SNP标记，其位于猪 的趋化因子受体CXCR3基因上，所述SNP标记的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，其中，该 序列的171bp和279bp两处喊基为T的待测猪为易感监耳病猪品种，而该两处喊基分别为 G和C的待测猪为抗蓝耳病猪品种。
[0007] 本发明还提供用于检测与猪抗蓝耳病相关的SNP标记的引物对，其包括上游引物 F :5' -CGCTCCCAGACTTCATCTTC-3' 和下游引物 R :5' -GAGGCAGTCACCTCTGAAGC-3'。
[0008] 本发明还提供与猪抗蓝耳病相关的SNP标记在鉴定抗蓝耳病猪品种中的应用，其 包括步骤：1)提取待测猪样品组织中的总RNA，反转录成cDNA ;2)以步骤1)中的cDNA为模 板，F和R为引物，进行RT-PCR反应；3)分析PCR产物，如果扩增产物序列中171bp和279bp 两处的碱基为C，则待测猪为抗蓝耳病猪品种。
[0009] 反转录PCR的步骤为：
[0010] i )打开RNA二级结构
[0011] 在一支无核酸酶污染的小离心管中加入：
[0012] RNA 2μ g
[0013] oligodT lug
[0014] 无核酸酶水补齐至 15 μ 1
[0015] 加热离心管至70°C，5分钟。
[0016] ii)反转录 PCR
[0017] 向上述离心管中加入：
[0018] M-MLV 5 X反应缓冲液 5μ1 10mM dATP 1.25μ! 10mM dCTP ?.25μ1 lOmM dGTP 1,25μ1 lOmM dTTP 1.25μ? RNasin?核酸酶抑制剂 25U M-MLV反转录酶 200U〇
[0019] 反转录PCR的反应条件为：42°C，60min。
[0020] 常规PCR使用的扩增体系以15 μ 1计为：
[0021] ΙΟμΜ上游引物F 0 5μΙ ΙΟμΜ下游引物R 0.5μ1 lOmM dNT'P l.0 μ! lOxPCR反应缓冲液 1.5μ1 TaqDNA聚合酶 0.2 μ? cDNA 模板 Ι.ΟμΙ 加 ddH20补足至 Ι5μΙ。
[0022] 常规 PCR 的反应条件为：：95°C 5min ;以 95°C 30s，50°C -70°C，30s-2min ; 72°C 30s-2min 做 35 个循环；72°C lOmin，于 4°C保温。
[0023] 本发明还提供含有引物F和R的用于检测抗蓝耳病猪品种的试剂盒。所述试剂盒 还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的一种或多种。优选地，所述试剂盒 还包括标准阳性模板。
[0024] 本发明进一步提供与猪抗蓝耳病相关的SNP标记在猪的分子标记辅助育种中的 应用。
[0025] 本发明提供了一种基于趋化因子受体CXCR3基因中与猪抗蓝耳病相关的SNP标记 筛选抗蓝耳病猪的方法，该方法的优点在于：（一）本发明提供的分子遗传标记不受猪的年 龄、性别等限制，可用于抗蓝耳病猪品种的早期选育，甚至在猪刚出生时就可准确地进行筛 选，可大大加快抗蓝耳病猪的育种进程；（二）筛选方法准确，操作简单，成本低，效率高。
【专利附图】
【附图说明】
[0026] 图1为本发明实施例1中进行常规PCR所使用的扩增程序。
【具体实施方式】
[0027] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（New York:Gold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0028] 实施例1趋化因子受体CXCR3基因中与猪抗蓝耳病相关的SNP标记筛选抗蓝耳病 猪的方法
[0029] 前期实验通过对6个品种猪(长白猪、大白猪、杜洛克猪、清平猪、梅山猪、通城猪） 感染高致病性蓝耳病毒（PRRSV)进行抗病猪的筛选，通过临床症状记录：采食量、体温、生 理生化、细胞因子以及存活时间等的检测，最后得到了对蓝耳病抗性差异较大的两个品种 ： 长白猪(易感猪)、通城猪(抗病猪)。为了研究高致病性蓝耳病的感染机制和筛选抗性基因， 后期实验选取了 35日龄抗病猪和易感猪各16头进行攻毒试验，对感染PRRSV后不同时间 点的猪肺转录组进行了高通量solexa测序，通过分子生物信息学的方法，发现在免疫相关 的趋化因子受体CXCR3基因（GenBank登录号为XM_003135179)外显子中存在两个品种间 的SNP位点，在抗性猪品种中这两个位点的单核苷酸分别是鸟嘌呤（G)和胞嘧啶（C)，而在 易感猪中，这两个位点的单核苷酸均为胸腺嘌呤（T)，通过在这两个SNP位点附近设计引物 扩增目的片段，测序检测SNP碱基类型，可得到同样的结果，扩增片段的引物序列如下：上 游引物 F :5'-CGCTCCCAGACTTCATCTTC-3'和下游引物 R :5' -GAGGCAGTCACCTCTGAAGC-3'。用 该对引物检测待测猪这两个SNP位点的碱基类型，即可用来筛选抗病猪。
[0030] 一、总RNA的提取
[0031] 1.动物组织：取新鲜或_70°C冻存动物组织，每30-50mg组织加入1ml Trizol，匀 浆仪进行匀浆处理。样品体积一般不要超过Trizol体积的10%。
[0032] 2.将以上样品在15_30°C放置5分钟，使得核酸蛋白复合物完全分离。
[0033] 3.可选步骤：4°C 12, OOOrpm(约13, 400g)离心10分钟，取上清。
[0034] 注意：如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可离心去 除。
[0035] 4.向以上溶液中加入氯仿，每使用1ml Trizol加入0. 2ml氯仿，盖好管盖，剧烈振 荡15秒，室温放置3分钟。
[0036] 5. 4°C 12, OOOrpm(约13, 400g)离心10-15分钟，此时样品分成三层：黄色的有 机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要在水相中，把水相(约500μ 1)转移到一个新的 RNase-Free离心管中。
[0037] 6.在得到的水相溶液中加入等体积异丙醇，混匀，室温放置20-30分钟。
[0038] 7. 4°C 12, 000 rpm(约 13, 400g)离心 10 分钟，弃上清。
[0039] 8.加入75%乙醇(用RNase-free水配制）洗漆沉淀。每使用lml Trizol用lml 75%乙醇对沉淀进行洗涤。
[0040] 9. 4°C 5, 000 rpm(约2, 300g)离心3分钟。用枪头小心吸出上层液体，保留沉淀。
[0041] 注意：不要吸出沉淀，剩余的少量液体可短暂离心，然后用枪头吸出，注意不要吸 弃沉淀。
[0042] 10.室温放置2-3分钟，晾干，加入30-100 μ 1 RNase-free水，充分溶解RNA。所 得到RNA置-70°C保存。
[0043] 二、反转录 PCR
[0044] 1.打开RNA二级结构
[0045] 在一支无核酸酶污染的小离心管中加入：
[0046] RNA 2 μ g
[0047] oligodT lug
[0048] 无核酸酶水补齐至 15 μ 1。
[0049] 加热离心管到70°C，5分钟。
[0050] 2.反转录 PCR
[0051] 向上述离心管中加入：
[0052] M-MLV ( Promega ) 5 X 反应缓冲液 5μ1 lOmM clATP 1.25μ1 ΙΟηιΜ ciCTP 1.25μΙ lOmM dGTP 1.25μ] lOmMdTTP 1.25μ1 RNasin?核酸酶抑制剂 25U M-MLV反转录酶 200U。
[0053] 在42 °C孵育60分钟进行反应。
[0054] 三、常规PCR反应
[0055] 1.按下列反应体系（15 μ L体系）加样
[0056] ΙΟμΜ上游引物F 0.5μ1 ΙΟμΜ下游引物R 0.5μ1 lOmM dNTP 1.0 μ? lOxPCR反应缓冲液 1.5μ1 TaqDNA聚合酶 0.2 μ? cDNA 模板 Ι.ΟμΙ 加ddH20补·足至 15μ1。
[0057] 2.按如图1所述的反应条件进行PCR扩增
[0058] 四、克隆和测序
[0059] 1.将PCR产物用Ε· Ζ· N. A Gel Extraction Kit胶回收试剂盒回收
[0060] 2.将回收的产物连接pMD-19T载体（Takara)，转化大肠杆菌，获得阳性克隆，摇 菌，测序(上海生工)。酶切、连接、转化操作详细步骤见《分子克隆》第三版。
[0061] 五、结果分析
[0062] 测序结果如SEQ ID NO. 1所示，其中，该序列的171bp和279bp两处碱基为T的待 测猪为易感蓝耳病猪品种，而该两处碱基分别为G和C的待测猪为抗蓝耳病猪品种。
[0063] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
[0001] 序列表 <11〇> 中国农业大学 <120〉趋化Μ子受体CXCR3基Η中与猪抗蓝耳病相关的SNP标记及其应用 <130> ΚΗΡ13113337,2 <160> 3 <170> Patentln version 3. 5 <210〉 1 <21D 756 <212> DNA <213〉猪 <220> <221> misc-feature <222> (171).. (171) <223〉n=g 或 t <220> <221> misc-feature <222> (279)\ . (279) <223〉n-c 或 t <400> 1 cgctcccaga cttcatcttc ctatcggccc accctgatga gcgcctcaac gccacccact 60 gccagtacag cttcccccag gtgggccgca cagccctgcg tgtcctgcag ctggtcgcag 120 gtttcctgct gcccctgctg gtcatggcc-t attgctacgc ccgcatcctg nctgtgctgc 180 tggtctccag aggccagagg cggctcagag ccatgcggct ggtggtggtg gtcgtcgtgg 240 cctttgccct ctgctggacc ccctaccacc tggtggtgnt ggtggacacc ctcatgtact 300 tgggggectt ggcccgcaac tgtagccaag aaagtagggt ggacgtagcc aagteggtca 360 catcgggcct gggctacatg cactgctgcc tcaacccact gctctacgcc ttcgtgggtg 420 tcaagttccg agagcggatg tggatgctgc tcatgcgcet gggctgccac caacggcagc 480 cgccagtttc ccgccgggat tcctcctggt cggagaccac agagggttcc tactcaggct 540 tgtgaggctg gggtggggga at.ccaccttc accacgcagc ctgacccccc cccccccacc 600 ttccaggctc ctccctccca agccccggag acacacactc ctgggagtct ccaggggccc 660 caggaccaca ggtctcccat ggagcctccc tctaggctct gggggc-tgag ccatcgctgc- 720 tccttagctg cccgccgctt cagaggtgac tgcctc 756 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213〉人丁序列 <400> 2 c gc tcccaga c 11 cat c 11 c 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213〉人工序列 <400 3 gaggcagtca cctctgaagc 20
【权利要求】
1. 一种与猪抗蓝耳病相关的SNP标记，其特征在于，其位于猪的趋化因子受体CXCR3基 因上，所述SNP标记的核苷酸序列如SEQID NO. 1所示，其中，该序列的171bp和279bp两处 碱基为T的待测猪为易感蓝耳病猪品种，而两处碱基分别为G和C的待测猪为抗蓝耳病猪 品种。
2. 用于检测权利要求1所述与猪抗蓝耳病相关的SNP标记的引物对，其特征在于，包括 上游引物 F :5' -CGCTCCCAGACTTCATCTTC-3' 和下游引物 R :5' -GAGGCAGTCACCTCTGAAGC-3'。
3. 权利要求1所述与猪抗蓝耳病相关的SNP标记在鉴定抗蓝耳病猪品种中的应用，其 包括步骤： 1) 提取待测猪样品组织中的总RNA，反转录成cDNA ; 2) 以步骤1)中的cDNA为模板，F和R为引物，进行RT-PCR反应； 3) 分析PCR产物，如果扩增产物序列中171bp和279bp两处的碱基分别为G和C，则待 测猪为抗蓝耳病猪品种。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤2)中反转录PCR包括的步骤为： i) 打开RNA二级结构 在一支无核酸酶污染的离心管中加入： RNA 2 μ g oligodT lug 无核酸酶水补齐至 15μ 1 ; 加热离心管至70°C，5分钟； ii) 反转录PCR 向上述离心管中加入： M-MLV 5 X反应缓冲液 5μ1 10mM dATP 1.25li1 !0mM dCTP 1.25μ1 lOmM dGTP 1.25μ1 !0mM dTTP 1.25μΙ RNasin?核酸酶抑制剂 25U M-MLV反转录酶 200U; 反转录PCR的反应条件为：42°C，60min。
5. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤2)中常规PCR使用的扩增体系以 15 μ 1计为： ΙΟμΜ上游引物F 0.5μ1 ΙΟμΜ下游引物R 0.5μ1 lOmMdNTP 1.0 μ? lOxPCR反应缓冲液 1.5μ1 TaqDNA聚合酶 0.2 μ? cDNA 模板 1 ,Ομ! 加ddH20补足至 15μ1。
6. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤2)中常规PCR的反应条件为：： 95°C 5min ;以 95°C 30s，5(TC -7(TC，30s-2min ;72°C 30s-2min 做 35 个循环；72°C lOmin，于 4 C保温。
7. 含有权利要求2所述引物对的用于检测抗蓝耳病猪品种的试剂盒。
8. 根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚 合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的一种或多种。
9. 根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
10. 权利要求1所述与猪抗蓝耳病相关的SNP标记在猪的分子标记辅助育种中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK104046623SQ201310082332
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2013年3月14日 优先权日:2013年3月14日
【发明者】李宁, 陈志胜, 任立明, 胡晓湘 申请人:中国农业大学