酪氨酸蛋白激酶jak2基因中与猪抗蓝耳病相关的snp标记及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及酪氨酸蛋白激酶JAK2基因中与猪抗蓝耳病相关的SNP标记及其应用，所述与猪抗蓝耳病相关的SNP标记位于猪的酪氨酸蛋白激酶JAK2基因上，所述SNP标记的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，其中，该序列的81bp、115bp、151bp和264bp四处碱基分别为T、A、G和A的待测猪为易感蓝耳病猪品种，而这四处碱基分别为C、G、A和T的待测猪为抗蓝耳病猪品种。本发明提供的分子遗传标记不受猪的年龄、性别等限制，可用于抗蓝耳病猪品种的早期选育，甚至在猪刚出生时就可准确地进行筛选，可大大加快抗蓝耳病猪的育种进程；筛选方法准确，操作简单，成本低，效率高。
【专利说明】酪氨酸蛋白激酶J AK2基因中与猪抗蓝耳病相关的SNP标记及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程及分子生物学领域，具体地说，涉及酪氨酸蛋白激酶JAK2基因中与猪抗蓝耳病相关的SNP标记及其应用。
【背景技术】
[0002]猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)，俗称“蓝耳病”是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的,该病毒是巢状病毒目动脉炎病毒科的一个成员，同属的病毒还有马动脉炎病毒，鼠乳酸脱氢酶酶病毒和猴出血热病毒。该病主要引起猪的繁殖与呼吸症状，表现为间质性肺炎和母猪流产木乃伊胎等，每年对全世界的养猪业造成了巨大的经济损失。2007年在中国爆发了一场高热病，该病迅速在全国范围扩散 ，超过200万头猪被感染，40万头猪死亡，该病最后证实是由一种高致病性的蓝耳病毒引起的。PRRSV主要感染猪的肺泡巨噬细胞，现在研究表明在感染PRRSV后，先天免疫中PRRSV感染不能引起有效的I型干扰素应答，体液免疫不能及时产生有效的中和抗体，而且会形成抗体依赖的病毒增强效应，最终导致免疫抑制和持续感染，由于该病毒的突变率极高，传统疫苗方法也不能有效控制该病，很多研究都致力于寻找RNAi，干扰素等新的方法来针对该病毒，用于弥补传统方法的不足。
[0003]由于不同的猪品种和个体的遗传背景差异，对蓝耳病的抗性也不同，研究表明在临床症状和生理生化指标上，通城猪、梅山猪等国内猪品种相较于国外长白猪、大白猪等感染高致病性PRRSV后有较强的抗性。通过高通量测序的方法，对感染PRRSV前后长白猪和通城猪的组织做差异基因表达分析，某些免疫相关的基因表达量在感染前后四个品种间有显著的差异。另外，存在一些品种间的SNP位点，这些基因在宿主的免疫应答中起到了很重要的作用，而且这些SNP位于基因的外显子中，通过找出不同品种间PRRSV感染造成的基因表达差异，不仅可以研究PRRSV的感染机制，还可以找出抗性或易感相关的基因，通过对品种间的SNP进行比较分析，从而筛选出抗性较强的猪。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供酪氨酸蛋白激酶JAK2基因中与猪抗蓝耳病相关的SNP标记及其应用。
[0005]酪氨酸蛋白激酶JAK2参与细胞生长、发育、分化以及组蛋白修饰等许多重要的生理过程，在天然免疫和和获得性免疫的信号调节通路中起到了重要的作用，它可以和II类型受体，如IFN-α ,IFN-β、细胞白介素的受体结合，在信号转到的过程中发挥重要作用，当干扰素等细胞因子结合到受体上时，JAK随即结合到受体的细胞质末端，随后磷酸化SATA形成同源或异源二聚体，进入到细胞核里，激活相关基因的转录。本发明人首次发现在两个不同抗性的猪品种:长白猪(易感猪)、通城猪(抗病猪)之间的酪氨酸蛋白激酶JAK2基因外显子中存在四个品种间SNP位点，用常规分子生物学方法检测这四个位点的碱基类型，可以作为一种检测抗病和易感猪的方法。
[0006]为了实现本发明目的，本发明提供一种与猪抗蓝耳病相关的SNP标记，其位于猪的酪氨酸蛋白激酶JAK2基因上，所述SNP标记的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，其中，该序列的81bp、115bp、151bp和264bp四处碱基分别为T、A、G和A的待测猪为易感蓝耳病猪品种，而这四处碱基分别为C、G、A和T的待测猪为抗蓝耳病猪品种。
[0007]本发明还提供用于检测与猪抗蓝耳病相关的SNP标记的引物对，其包括上游引物F:5’ -AAGCATGATGAGCCAGCTTT-3’ 和下游引物 R:5’ -CCACTTCCCCAGTGTTGTCT-3’。
[0008]本发明还提供与猪抗蓝耳病相关的SNP标记在鉴定抗蓝耳病猪品种中的应用，其包括步骤:I)提取待测猪样品组织中的总RNA，反转录成CDNA ;2)以步骤I)中的cDNA为模板，F和R为引物，进行RT-PCR反应；3)分析PCR产物，如果扩增产物序列中81bp、115bp、151bp和264bp四处的碱基分别为C、G、A和T，则待测猪为抗蓝耳病猪品种。
[0009]反转录PCR的步骤为:
[0010]i )打开RNA 二级结构
[0011]在一支无核酸酶污染的小离心管中加入:
[0012]
RNA2μ^,
o! igodTIiLig
无核酸酶水补齐至 15μ1。
加热离心管至70°C, 5分钟。
[0013]ii)反转录 PCR
[0014]向上述离心管中加入:
[0015]
M-MLV 5 X反应缓冲液5μ1
1mMdATP1.25μΙ
1mMdCTP1.25μ1
1mMdGTP1.25μ1
1mMdTTP1.25μΙ
RNasin?核酸酶抑制剂25U
M-MLV反转录酶200U。
[0016]反转录PCR的反应条件为:42°C，60min。
[0017]常规PCR使用的扩增体系以15 μ I计为:
[0018]
【权利要求】
1.一种与猪抗蓝耳病相关的SNP标记，其特征在于，其位于猪的酪氨酸蛋白激酶JAK2基因上，所述SNP标记的核苷酸序列如SEQID N0.1所示,其中，该序列的81bp、115bp、151bp和264bp四处碱基分别为T、A、G和A的待测猪为易感蓝耳病猪品种，而这四处碱基分别为C、G、A和T的待测猪为抗蓝耳病猪品种。
2.用于检测权利要求1所述与猪抗蓝耳病相关的SNP标记的引物对，其特征在于，包括上游引物 F:5’ -AAGCATGATGAGCCAGCTTT-3’ 和下游引物 R:5’ -CCACTTCCCCAGTGTTGTCT-3’。
3.权利要求1所述与猪抗蓝耳病相关的SNP标记在鉴定抗蓝耳病猪品种中的应用，其包括步骤: .1)提取待测猪样品组织中的总RNA，反转录成cDNA；. 2)以步骤I)中的cDNA为模板，F和R为引物，进行RT-PCR反应； . 3)分析PCR产物，如果扩增产物序列中81bp、115bp、151bp和264bp四处的碱基分别为C、G、A和T，则待测猪为抗蓝耳病猪品种。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤2)中反转录PCR包括的步骤为: i)打开RNA 二级结构 在一支无核酸酶污染的离心管中加入:
II)反转录PCR 向上述离心管中加入:
反转录PCR的反应条件为:42°C，60min。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤2)中常规PCR使用的扩增体系以.15 μ I计为:
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤2)中常规PCR的反应条件为:95°C5min;以 95°C 30s, 50°C -70°C, 30s-2min ；72°C 30s_2min 做 35 个循环；72°C lOmin，于 4°C保温。
7.含有权利要求2所述引物对的用于检测抗蓝耳病猪品种的试剂盒。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的一种或多种。
9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
10.权利要求1所述与猪抗蓝耳病相关的SNP标记在猪的分子标记辅助育种中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK104046621SQ201310082138
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2013年3月14日 优先权日:2013年3月14日
【发明者】李宁, 陈志胜, 任立明, 胡晓湘 申请人:中国农业大学