一种高效分泌表达短小芽孢杆菌漆酶的方法
【专利摘要】本发明公开了一种高效分泌表达短小芽孢杆菌漆酶的方法，属于生物工程【技术领域】。本发明以短小芽孢杆菌的漆酶基因cotA，构建分泌表达载体pMA0911-CotA并转化枯草芽孢杆菌表达菌株WB600中，通过培养条件优化，在3L发酵罐中实现了高效分泌表达。该短小芽孢杆菌漆酶已被证明具有耐碱性环境和耐高温的优点，在工业印染废水处理中具有重要应用价值。
【专利说明】一种高效分泌表达短小芽孢杆菌漆酶的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种高效分泌表达短小芽孢杆菌漆酶的方法，属于生物工程技术领 域。
【背景技术】
[0002] 漆酶（laccase，E. C. 1. 10. 3. 2)是一种含铜多酚氧化酶，能催化酚类物质的氧化 还原反应，在木质素及其前体类似物的生物降解中发挥重要作用。漆酶的氧化底物极为广 泛，包括酚类及其衍生物、芳胺及其衍生物、芳香羧酸及其衍生物等，因此漆酶应用潜力巨 大。在木材加工领域，漆酶能代替化学胶合剂，不但能提高产品质量，而且能减轻对人体健 康的伤害及对环境的污染；在造纸工业中，漆酶用于纸张生物漂白和制浆，可减少制浆造纸 厂的污染，有助于造纸业最终实现清洁生产；在食品加工领域，漆酶可用于除去果汁中酚类 化合物引起的混浊，从而提高果汁的质量。此外，漆酶还可氧化氯酚及其衍生物，降低其毒 性，减少以氯酚类为工业原料生产染料、防腐剂、除草剂、杀虫剂等化工产品而造成的环境 污染。
[0003] 漆酶按来源不同可分为三大类：植物漆酶、真菌漆酶和细菌漆酶。植物漆酶主要由 漆树漆液分离而得。真菌漆酶来源更为广泛（存在于多种担子菌中），具单电子氧化还原电 位高、催化活性强等优点，既能催化底物的氧化聚合又能对木质素进行催化降解，是一直以 来人们重点研究的漆酶种类。细菌漆酶则发现相对较晚，最初是1993年由Givaudan等人 首先在一种生脂固氮螺菌中鉴定出来的。随后，科研人员又陆续在交替单胞菌、大肠杆菌、 假单胞菌、粘质沙雷氏菌、球形芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、极端耐碱芽孢杆菌、灰色链霉菌等 细菌中发现了不同种类的具漆酶活性的功能蛋白，如枯草/地衣/短小芽孢杆菌的CotA蛋 白、海单胞菌的PpoA蛋白、大肠杆菌的CueO蛋白、灰色链霉菌的EpoA蛋白等，这些细菌漆 酶与真菌漆酶蛋白结构相似，都具有4个铜离子结合位点。
[0004] 由于真菌来源漆酶在工作环境pH偏碱性时活性非常低或几乎没有，热稳定性也 较差，且丝状真菌生长周期长，培养基要求高，菌丝在发酵罐中易受到高剪切力的损伤，这 大大限制了真菌漆酶在工业上的应用。研究揭示，细菌来源漆酶虽氧化活性普遍略低于真 菌来源漆酶，然而它们往往具有一些自身独特的优点：如无需糖基化修饰、热稳定性好、酶 活性的最适PH范围广等，这些性质正是目前漆酶工业应用所急需的。
[0005] 据最新资料统计，我国每年印染废水排放量占总工业废水排放量的35%，己成为 危害最大的重要污染源，大部分合成染料都难以被微生物降解。这些染料化合物通常被 用于纺织、食品、塑胶和生物医学的着色剂，每年全世界商用染料使用达7X IO5吨，种类达 IX IO4种，其中5?10%的染料都以工业污水形式排放出来。有色污水直接释放到环境中， 许多染料在厌氧环境下可能转化为有毒物质或致癌物质，众多国家相继都颁布了严厉的法 规来限制工业染料污水的排放。由于染料自身特殊的化学结构，使用物理或化学法（凝结、 臭氧、活性炭）处理往往效果不佳，且还易造成二次污染。研究表明，生物法（使用漆酶、锰 过氧化物酶等）具有脱色率高、运行成本低、绿色环保的优势，是处理印染废水的潜在有效 手段，是当前印染废水脱色研究的热点。绝大多数排放的工业印染污水往往温度很高且pH 值偏碱。在各类来源的漆酶中，真菌漆酶由于只在pH偏酸环境下具有较好的脱色效果，在 偏碱性条件下难以发挥作用，且耐热温度低于细菌漆酶，所以细菌漆酶凭借其独特优势在 工业印染废水处理中更具应用潜力，是处理印染废水的潜在生物利器。
[0006] 由于短小芽孢杆菌漆酶（cotA基因编码）自身产量非常低，而大肠杆菌重组表 达系统只能在胞内异源生产漆酶，两者均达不到工业化应用要求，因此采用枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)重组表达系统，构建高效分泌表达短小芽孢杆菌漆酶的基因工程菌 株，同时建立高产量发酵方法，具有重要应用价值。
【发明内容】
[0007] 本发明要解决的技术问题是提供一种高效分泌表达短小芽孢杆菌漆酶的基因工 程菌，是将短小芽孢杆菌漆酶基因 cotA以pMA0911为表达载体，以枯草芽孢杆菌为宿主构 建得到的基因工程菌，所述枯草芽孢杆菌是B. subtilis WB400、WB600或WB800中的一种。
[0008] 所述漆酶基因 cotA的序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0009] 在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌是B. subtilis WB600。
[0010] 本发明的第二个目的在于提供上述基因工程菌的构建方法，成功分泌表达了短 小芽孢杆菌漆酶蛋白，主要包括以下步骤= (I)PCR扩增或化学合成cotA基因序列，（2) 将cotA基因与表达质粒pMA0911(wapA)连接，构建重组质粒pMA0911-CotA;(3)随后将 pMA0911-CotA转化枯草芽孢杆菌表达菌株WB600，筛选验证获得阳性转化子。
[0011] 在本发明的一种实施方式中，表达质粒PMA0911自身信号肽替换为wapA信号肽。
[0012] 本发明的第三个目的在于提供应用上述基因工程菌分泌生产漆酶的方法，主要包 括以下步骤：将重组菌用种子培养基活化后，以5-8%接种量菌液转入装液量50% -60%的 发酵罐中，通气量0. 8-1. Ovvm，搅拌转速300-400r/min，pH不作控制，37°C培养；发酵培养 基成分为玉米淀粉12_24g/L，蛋白胨8-12g/L，酵母抽提物9-15g/L，硫酸铜0. ImM。
[0013] 在本发明的一种实施方式中，将重组菌用种子培养基活化后，以5%接种量菌液转 入装液量I. 6L的3L发酵罐中，通气量I. Ovvm，搅拌转速400r/min，pH不作控制，37°C培养； 发酵培养基成分为玉米淀粉18g/L，蛋白胨10g/L，酵母抽提物12g/L，硫酸铜0. ImM。
[0014] 本发明还提供一种高效分泌表达短小芽孢杆菌漆酶的方法，以重组表达了短小芽 孢杆菌来源的漆酶基因的枯草芽孢杆菌为生产菌株，发酵生产漆酶。
[0015] 在本发明的一种实施方式中，将cotA基因与表达质粒pMA0911 (wapA)连接，构建 重组质粒pMA〇911-CotA，然后转化枯草芽孢杆菌表达菌株WB600,获得重组菌；发酵培养基 成分为玉米淀粉12_24g/L，蛋白胨8-12g/L，酵母抽提物9-15g/L，硫酸铜0. ImM ;于37°C通 风发酵。
[0016] 本发明相比现有技术的有益效果：本发明首次以枯草芽孢杆菌为表达宿主，实现 了细菌漆酶的高效分泌表达，重组漆酶的表达量约占上清液总蛋白量的70%，酶活力约 380U/mL。是国际上已有报道的最高表达水平。目前利用毕赤酵母表达系统异源分泌表达 地衣芽孢杆菌漆酶，实现最大表达量为227. 9U/mL，仅为本发明的60%。考虑细菌漆酶的附 加值，本发明表达水平已达到工业化生产要求。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 图1为构建的重组质粒pMA0911-CotA图谱。
[0018] 图2为B. subtilis WB600基因工程菌分泌表达短小芽孢杆菌漆酶的SDS-PAGE图 谱。泳道1为对照组，转化PMA0911空质粒的发酵上清液总蛋白电泳图；泳道2为实验组， 转化pMA0911-CotA重组质粒的发酵上清液总蛋白电泳图；泳道3为实验组上清液经过离子 交换层析纯化之后的短小芽孢杆菌漆酶蛋白电泳图；泳道M表示蛋白质分子量标准。箭头 所指示的条带为短小芽孢杆菌漆酶蛋白。
[0019] 图3为B. subtilis WB600基因工程菌分泌表达产短小芽孢杆菌漆酶的发酵培养 基条件优化实验。（a):玉米淀粉浓度的优化实验显示18g/L时漆酶产量最高；(b):蛋白胨 浓度的优化实验显示l〇g/L时漆酶产量最高；（c):酵母抽提物浓度的优化实验显示12g/L 时漆酶产量最高；(d):发酵温度的优化实验显示37°C时漆酶产量最高。
[0020] 图4为利用上述摸索出的最优发酵条件在3L发酵罐中（装液量I. 6L)进行发酵 生产短小芽孢杆菌漆酶。实验显示36h后结束发酵，漆酶产量最高。
【具体实施方式】
[0021] 在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常 理解的含义。
[0022] 下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发 明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
[0023] 在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
[0024] 实施例1重组质粒pMA0911_CotA的构建
[0025] 短小芽孢杆菌cotA基因的序列如SEQ ID NO. 1所示，设计引物Gpll : (5' -TCAG GAGAATTCATGAACCTAGAAAAATTTGT-3，）和 Gp22 : (5，-ACTGAGGGATCCTTACTGGATGATATCCATC G-3')，利用PCR将漆酶基因 cotA的DNA编码框5'和3'两侧分别引入EcoR I和BamH I II限制性酶切位点（下划线表示）；通过双酶切、分子连接等基因操作将漆酶基因插入到 表达质粒pMA〇911 (wapA)，构建重组质粒pMA0911_CotA(如图1所示）。
[0026] 实施例2 SDS-PAGE分析B. subtilis WB600基因工程菌分泌表达的短小芽孢杆菌 漆酶蛋白。
[0027] 在卡那霉素浓度为50μ g/mL的LB培养基中接种基因菌单克隆，37°C、100r/min 培养过夜。随后将100 μ L过夜培养的菌液接种于IOOmL(含50 μ g/mL卡那霉素与0. ImM 硫酸铜）的发酵培养基中，37°C、200r/min摇床培养24h，随后取出发酵液，8000r/min离心 IOmin得到上清液，即为粗酶液。进一步利用离子交换层析法对粗酶液进行分离纯化。取粗 酶液和纯化后的酶液进行12 %的SDS-PAGE蛋白电泳（如图2所示）。上述相关方法均采 用常规操作步骤。
[0028] 实施例3发酵培养基条件的优化。
[0029] 对发酵培养基中的玉米淀粉、蛋白胨及酵母抽提物浓度进行优化实验，并对发酵 最佳温度进行研究，如图3所示，玉米淀粉浓度为18g/L时漆酶产量最高，达到280U/mL ;蛋 白胨浓度为l〇g/L、酵母抽提物浓度为12g/L、发酵温度37°C时，漆酶产量可进一步提高到 340U/mL 左右。
[0030] 实施例4利用摸索出的最优发酵条件进行3L发酵罐规模的短小芽孢杆菌漆酶发 酵生产。
[0031] 重组菌用种子培养基活化后，菌液转入（5%接种量）3L发酵罐，装液量I. 6L，发 酵培养基成分为玉米淀粉18g/L，蛋白胨10g/L，酵母抽提物12g/L，硫酸铜0. ImM。通气量 I. Ovvm，搅拌转速400r/min，pH不作控制，37°C培养36h后发酵结束，此时发酵液中漆酶产 量最高，如图4所示，约380U/mL。SDS-PAGE分析发酵上清液总蛋白显示明显特异表达条带， 条带分子量与预期大小分子量?65kD -致。在此条件下，重组漆酶的表达量约占上清液总 蛋白量的70%，全为可溶性活性状态。
[0032] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【权利要求】
1. 一种高效分泌表达短小芽孢杆菌漆酶的基因工程菌，其特征在于，是将短小芽孢杆 菌漆酶基因cotA以pMA0911为表达载体，以枯草芽孢杆菌为宿主构建得到的基因工程菌， 所述枯草芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌WB400、WB600或WB800中的一种。
2. 根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述漆酶基因cotA的序列如SEQ IDN0. 1 所示。
3. 根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌是 B.subtilisffB600〇
4. 一种构建权利要求1-3任一所述基因工程菌的方法，其特征在于，主要包括以下步 骤：（1)PCR扩增或化学合成cotA基因序列，（2)将cotA基因与表达质粒pMA0911连接，构 建重组质粒pMA〇911-CotA ; (3)将pMA0911-CotA转化枯草芽孢杆菌，筛选验证获得阳性转 化子。
5. 权利要求1-3任一所述基因工程菌在分泌生产漆酶中的应用方法。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：将重组菌用种子培养 基活化后，以5-8%接种量菌液转入装液量50% -60%的发酵罐中，通气量0.8-1. Ovvm，搅 拌转速300-400r/min，pH不作控制，37°C培养；发酵培养基成分为玉米淀粉12-24g/L，蛋白 胨8-12g/L，酵母抽提物9-15g/L，硫酸铜0. ImM。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将重组菌用种子培养基活化后，以5 %接 种量菌液转入装液量1. 6L的3L发酵罐中，通气量1. Ovvm，搅拌转速400r/min，pH不作控 制，37°C培养；发酵培养基成分为玉米淀粉18g/L，蛋白胨10g/L，酵母抽提物12g/L，硫酸铜 0? ImM。
8. -种高效分泌表达短小芽孢杆菌漆酶的方法，其特征在于，以重组表达了短小芽孢 杆菌来源的漆酶基因的枯草芽孢杆菌为生产菌株，发酵生产漆酶。
9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，将cotA基因与表达质粒pMA0911连接，构 建重组质粒pMA〇911-CotA，然后转化枯草芽孢杆菌表达菌株WB600,获得重组菌；发酵培养 基成分为玉米淀粉12_24g/L，蛋白胨8-12g/L，酵母抽提物9-15g/L，硫酸铜0. ImM ;于37°C 通风发酵。
【文档编号】C12N1/21GK104388370SQ201410712849
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月27日 优先权日:2014年11月27日
【发明者】管政兵, 廖祥儒, 蔡宇杰, 水燕, 宋晨萌 申请人:江南大学