专利名称：一种依据荧光素酶基因的表现来检测二恶英类化合物的重组细胞株的制作方法
技术领域：
本发明主要是有关于带有一外源性荧光素酶基因(exogenousluciferase gene)的重组细胞株(recombinant cell line)，特别是经转染的小鼠肝癌细胞(transfected mouse hepatoma cell)Hepa1c1c7-M4P2与Hepa1c1c7-MP，其中该荧光素酶基因的上游处坐落有一当中含有可能为二恶英反应片段所特有的核苷酸序列“cacgc”与“gcgtg”的DNA片段。
背景技术：
由于文明过度的开发，许多有形或无形的污染因子一再地侵袭生活在文明世界的人类社会，而在种种污染因子中，二恶英(dioxins)被认为是现今对于人类和动物为最毒的化学品(chemicals)，而因此被称之为「世纪之毒」。在近二十多年来的研究中发现，二恶英不但会影响人体生育、造成发育障碍、破坏免疫系统以及干扰正常内分泌外，甚至还具有致癌性。然而，二恶英是一种不易分解的物质，它会持续地累积并存在于自然界与生物体内，而对于整个环境形成一严重的潜在危害。
特别地，由于二恶英在一般状态下，甚至在热、酸或碱的环境中都非常稳定，当其被微量释出到环境中并进入食物链后，会随着食物链的攀升而使浓度越来越高。而二恶英的化学结构与人体荷尔蒙的结构相似(E.L.Gregoraszczuk，Cad Saude Publica.，Mar-Apr，2002，18(2)453-62)，因此，当经由食物链而进入人体后，一方面会形成「假性荷尔蒙」而产生类似荷尔蒙的作用，另一方面会影响身体内的荷尔蒙含量，这二者皆会干扰人体原有的内分泌机制，并严重影响人体的新陈代谢与干扰荷尔蒙的平衡，导致身体机能受损。
此外，二恶英也被证实是强力的促癌剂(tumor promoter)，会引起动物致癌性，包括增加大白鼠肝癌、肺部肿瘤以及皮肤肿瘤的发生率。美国环保署(US-EPA)以及世界卫生组织(WHO)将二恶英归类为可能人类致癌物，而国际癌症中心(InternationalAgency for Research on Cancer，IARC)在1997年已将毒性最强的2，3，7，8-TCDD归类为“一级人类确定治癌物”(D.B.McGregoret al.(1998)，Environ Health Perspect.，Apr；106 Suppl2755-60)。因此，如何在最短的时间内使用一有效方法来检测出此环境污染因子，即成为相关研究人员的一重要研究方向。
二恶英(dioxins)是一群由一或两个氧原子与两个苯环连结而被形成的化合物的统称，且此类化合物是属于卤化芳族碳氢化合物(halogenated aromatic hydrocarbons，HAHs)当中的一类。二恶英可分成两个系列的共平面三环化合物，分别为(1)多氯二联苯二恶英(polychlorinated dibenzo-p-dioxins，PCDDs)，此类化合物具有一化学通式为C12H8-nO2Cln，其中n＝1～8；以及(2)多氯二联苯呋喃(polychlorinated dibenzofurans，PCDFs)，此类化合物具有一化学通式为C12H8-nOCln，其中n＝1～8。当苯环的八个取代位置上接上不同数目的氯原子后，PCDDs具有75种同分异构物(isomers)，而PCDFs具有135种同分异构物。在这210种的二恶英同分异构物中，以2，3，7，8-四氯二苯并-ρ-二恶英(2，3，7，8-tetrachloro-dibenzo-ρ-dioxin，2，3，7，8-TCDD)的毒性是最强的，因此又被称为“世纪之毒”。
PCDDs与PCDFs是几乎成平面结构的芳香族化合物，这两类化合物的物性与化性相似，同样具有非常稳定的有机分子结构，并且具有高熔点、高沸点以及不易分解的特性，因此在各种环境媒介(诸如空气、土壤、水以及食物)中都会有此等化合物的存在(W.Parzefall(2002)，Food Chem Toxicol.，40(8)1185-9)。以2，3，7，8-TCDD为例，其分子量为322，高温燃烧需要在850℃以上才会被破坏。就其挥发性而言，它在25℃下的蒸气压为7.4×10-10mmHg。另外，二恶英对水的溶解度为19.3ng/L，属亲脂性，且在平常状态下是非常稳定的。除了被暴露于异辛烷及紫外光时其化学性质会被改变之外，二恶英对于热、酸、碱的稳定性很高。
基于以上所提的特性，二恶英不论是在水中或是土壤中的挥发速度均很慢。以环境分解性来看，在模拟水生态试验中，在100种微生物中仅有5种可分解TCDD。因此，二恶英一旦在自然界产生后就很难被分解，并且会持续地在自然界中累积。
二恶英的计量单位通常以介质中含有多少毒性当量来表示。由于二恶英有75个同分异构物，每个异构物的毒性不一，而试验动物对它们的反应也有一广范围的变化，并且被暴露于环境中的二恶英类化合物通常是由许多种化合物所构成的混合物而非单一化合物。因此，关于二恶英的测定方式，许多学者提出所谓毒性等值数的观点，而根据芳香族碳氢化合物接受器(arylhydrocarbon receptor，简称AHR)对于各个单一化合物的感受程度，并依据该等化合物对于物质的相对毒性影响(relative toxicityinfluence)来订定出国际毒性当量因子(International ToxicityEquivalency Factor，I-TEF)，并将毒性最强的2，3，7，8-TCDD定为1，并成为世界卫生组织的欧洲环境健康中心(WHO EuropeanCenter for Environment & Health)暨国际化学安全计划(Interntional Programme on Chemical Safety，IPCS)共同提出的标准化毒性当量因子(S.H.Safe(1990)，Crit.Rev.Toxicol.，21(1)51-88)。
TEF值的使用是基于以下假设(1)假设所有二恶英类化合物都只经由AHR而造成毒性作用；(2)二恶英类化合物的毒性总和为各别化合物毒性相加成的结果；以及(3)只使用TEF来推测大部份的毒性作用。于是，2，3，7，8-TCDD的毒性当量的计算方式如下TEQ＝TEF×真实浓度(true concentration)在国际上，二恶英类化合物的毒性当量是以I-TEQ(International Toxic Equivalency)来表示，其中空气中的二恶英浓度可以ng-TEQ/Nm3来表示，而土壤中的二恶英浓度则以pg-TEQ/g来表示。若单纯只计算介质中所含有的二恶英数量，可以采用重量表示法，常用的有pg/g、ppt、ppb等。例如，pg/kg-bw是指每公斤体重含有多少pg的二恶英。世界卫生组织建议每人每日的二恶英容许摄取量为1～4pg/kg-bw，若以体重60公斤的成年人来说，每天最高的容许摄取量为240pg的二恶英。
在过去20年来，二恶英的化学检验方法已被发展得相当完善，这当中主要是利用气相层析(gas chromatography)加上电子捕获检测(electron capture detection)或是质谱仪(massspectrometry)，而分析步骤主要包含有样品的采集、萃取、净化、分离以及定量测定(C.Rappe(1991)，IARC Sci Publ.，1081-426；De Jong APJM and AKD.Liem(1993)，TrandsAnal Chem.，12115-124)。化学检测方法能精准地将二恶英的所有成分浓度予以分析出来，但是在整个检测过程中需要耗费许多时间和金钱成本，而不利于用在日常的例行性检验上。
而后，于本领域中发展出另一类以免疫化学方法为基础的酶联免疫吸附分析(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)(Zajicek JL，Application of enzyme-linkedimmunosorbent assay(ELISA) for measurement ofpolychlorinated biphenyls from hydrophobic solutionsextracts of fish and dialysates of semipermeable membranedevices.InVan Emon JM et al.，editors.Environmentalinnunochemical methods，chapter 26.American ChemicalSociety，1996，pp.307-325)。此种技术是根据抗体与其对应的抗原之间会存在有一极佳的专一性与亲和性，因此可利用针对二恶英化学结构的半抗原(hapten)来产生二恶英-专一性抗体(Y.Sugawara et al.(1998)，Anal Chem.，70(6)1092-1099)，或是能够专一性地辨识会与二恶英接合的AHR的抗体，并通过测定转化的AHR的程度来辨识外来二恶英的浓度(A.Poland et al.(1991)，Mol Pharmacol.，39(4)435)。然而，此类检测方法在实验操作上是相当复杂的。
近年有人以这种免疫分析法为基础而建立生物感应器(biosensor)技术(S.Bender et al.(1998)，Environ Sci Technol.，32788-797)，其中以抗体配合适当检测系统来构成免疫反应型生物感应器，并通过检测反应过程中的质量变化来定量样品中的抗原浓度。例如，经由化学键将抗体有效固定于一金电极表面上，存在于样品内的抗原和被固定的抗体产生亲合性结合，再经由光学(光纤及表面电浆共振)或振荡晶体(石英振荡晶体以及表面弹性波装置)等讯号转换系统来进行检测，由此，可有效定量样品中的抗原浓度。此外，也可通过在抗体上作处理，使其在和二恶英结合后能放出电化学讯号(electrochemical signal)，再由讯号来判读二恶英数量。但是，这方面的技术还不是非常成熟，目前也未被广泛利用。
为了研发出更快速且方便的检测方式，也随着人们日渐了解二恶英在生物体内的致毒机制，以生物反应为基础的生物检测方法(bioassays)逐渐受到重视。
当一生物体被暴露于含有二恶英的环境内时，它会产生许多生化、生理上的变化，而通过观察这些变化可以判断二恶英的存在。在二恶英的致毒机制中被最为广泛研究的是AHR传递路径(AHR pathway)(O.Hankinson(1995)，Annu Rev PharmacolToxicol.，35307-40)。
当二恶英进入细胞后，它会经由AHR传递路径中的一系列的讯息传递而进入至细胞核，最后会通过和AHR核转运蛋白(AHRnuclear translocator，ARNT)的结合而被带到DNA上的二恶英反应片段(dioxin response elements，DREs)处，进而调控基因作用。在这方面，细胞色素P4501A(cytochrome P450 1A，CYP1A)基因是一个著名的“活体内生物标记(in vivo biomarker)”，不管是在人类或老鼠的细胞中，CYP1A基因会经由AHR传递路径而被引发大量表现(M.Merchant et al.(1992)，Arch Biochem Biophys.，298(2)389-94；J.P.Vanden-Heuvel et al.(1993)，Carcinogenesis.，142003-2006；Denison MS，Withlock JP Jr.(1995)，Journal of Biological Chemistry，1995；270(31)18175-8)。
据报导，存在于许多不同细胞的基因中的DREs已被找出(Z.-W.Lai et al.(1996)，Chemico-Biological Interaction，10097-112)，而且在该等DREs中存在有一些特定的核苷酸序列(诸如cacgc或gcgtg)，它们在二恶英的辨识上扮演一重要角色(J.Corchero et al.(2001)，Pharmacogenetics.，111-6)。
在生物检测方法中，CALUX[化学品-活化的荧光素酶表现(chemical-activated luciferase expression)]分析法是近年来很受重视的一种方法，它的主要技术概念是在DREs的后面接上报告基因(reporter gene)。
1993年Hans Postlind建构了2个人类CYP1-荧光素酶质粒，他从人类的CYP1基因前面截取出启动子(promoter)与5′-侧翼序列(flanking sequence)片段，并予以分别放入至一带有荧光素酶(luciferase)的质粒中，再将建构好的重组型质粒送入至人类101L细胞中，之后加入不同浓度的TCDD来刺激被转染的细胞并测量荧光素酶的活性，藉此，二恶英的浓度可通过所检测到的荧光表现而被测定出(H.Postlind et al.(1993)，Toxicol Appl Pharmacol.，118(2)255-262)。
总括来说，在目前的二恶英检测方法中，以化学分析方法最为精准，但是缺点为操作过程复杂、检验时间长且所需的成本极高。至于以免疫化学方法为基础的酶联免疫吸收分析，它具有生物检测法的专一性以及灵敏度优点，但是在操作上还是相当繁琐。而以免疫分析法为基础所建立出的生物感应器，它在整个技术层面上还不够成熟而未被广泛利用。再就生物检测法而论，除了具有毒理上专一性之外，它比化学方法更为省时且成本低廉，并可灵敏地、专一性地检测出二恶英类化合物的TEQ，且适用于大量的环境样品的检测。因此，发展出一适用于生物检测法的重组细胞株来供二恶英类化合物的有效检测，已成为本领域中的相关研究人员所致力的研究方向。
发明内容
于是，在第一个方面，本发明提供一种用于克隆对于二恶英具反应性的DNA片段的引物对，其包括一正向引物(forwardprimer)与一反向引物(reverse primer)，该正向引物具有一如序列辨识编号1或序列辨识编号3所示的核苷酸序列，而该反向引物具有一如序列辨识编号2或序列辨识编号4所示的核苷酸序列正向引物15’-cagagagcacctgcaaaaca-3’(序列辨识编号1)反向引物1
5’-ggctacaaagggtgatgctt-3’(序列辨识编号2)正向引物25’-ctcgagagggcaggtgaaggtgttag-3’(序列辨识编号3)反向引物25’-aagcttaagtgaagagtgttctctagg-3’(序列辨识编号4)。
于是，当使用CYP1A1基因序列作为模板(template)并使用依据本发明的引物对来进行PCR反应时，可以得到一带有可能为二恶英反应片段(DREs)所特有的核苷酸序列(cacgc与gcgtg)的DNA片段。
上述DNA片段，其具有的核苷酸序列是下列之一(1)实质上对应于一通过使用CYP1A1基因序列作为模板以及使用根据上述引物对来进行PCR反应而被扩增出的DNA片段所具有的核苷酸序列；(2)实质上对应于一如序列辨识编号5所示的核苷酸序列；(3)实质上对应于一如序列辨识编号6所示的核苷酸序列；(4)实质上对应于一与(1)项中所述的DNA片段的核苷酸序列或(2)或(3)项中所述的核苷酸序列相互补的核苷酸序列。
该DNA片段接而可被并入至一个具有一报告基因(例如荧光素酶基因)的载体内。因此，在第二个方面，本发明提供一种重组载体，其具有一报告基因，以及一如上所述的DNA片段位于该报告基因的上游处；该报告基因是荧光素酶基因。
上述对应于一如序列辨识编号5所示的核苷酸序列的重组载体是重组载体M4P2。
上述对应于一如序列辨识编号6所示的核苷酸序列的重组载体是重组载体MP。
该重组载体进而可被用来转染一选定的宿主细胞。因此，在第三个方面，本发明提供一种重组细胞株，它是通过以一如上所述的重组载体来转染一宿主细胞而被形成者。
该被用来转染的宿主细胞是小鼠肝癌细胞Hepa-1C1C7。
该重组细胞株是以寄存编号PTA-6089被寄存于美国典型培养物保藏中心的小鼠肝癌转化细胞株Hepa1c1c7-MP或其次培养后代。
以寄存编号PTA-6090寄存于美国典型培养物保藏中心的小鼠肝癌转化细胞株Hepa1c1c7-M4P2或其次培养后代。
依据本发明的重组细胞株及其次培养后代可被应用于一种用于检测一环境样品中的二恶英类化合物的生物分析，其中一含有二恶英类化合物的样品被接触以培养中的该重组细胞株历时一段时间，而致使位在该重组细胞株内的该重组载体所具有的报告基因被表现，由此被生成的基因产物(例如荧光素酶)会产生一可检测的现象(例如发光强度)，该可检测的现象即可作为定性与定量二恶英类化合物的存在的指标。
下面结合附图及实施例来对本发明进行详细说明，所以本发明在上述以及其它目的与特征，可借由参照下文的描述、随文检附的权利要求书和伴随的图式而变得更为明显，附图中图1显示质粒yT&A克隆载体(2728bp)的架构，其中具有氨苄青霉素抗性基因(ampicillin resistance gene，AP)、T7启动子(T7promoter)、β-半乳糖苷酶基因(β-galactosidase gene，lacZ)以及多克隆位点(multiple cloning site，MCS)；图2显示pGL2-启动子载体(pGL2-promoter vector)(5790bp)的架构，其中具有氨苄青霉素抗性基因(Ampr)、SV40启动子、荧光素酶基因(luc)以及多克隆位点等；图3显示pGL3-基本载体(pGL3-basic vector)(4818bp)的架构，其中具有氨苄青霉素抗性基因(Ampr)、荧光素酶基因(luc+)以及多克隆位点等；图4显示一通过使用自小鼠巨噬细胞J774A.1分离与纯化出的染色体DNA(chromosomal DNA)来作为模板，并使用依据本发明的正向引物1与反向引物1来进行PCR反应所扩增出的PCR产物的核苷酸序列，其中该PCR产物全长为479bp，并且当中含有7个可能为二恶英反应片段(DREs)所特有的核苷酸序列cacga与gcgtg(被框起来的部分)；图5显示一通过使用自小鼠巨噬细胞J774A.1分离与纯化出的染色体D NA来作为模板，并使用依据本发明的正向引物2与反向引物2来进行PCR反应所扩增出的PCR产物的核苷酸序列，其中该PCR产物全长为1503bp，并且当中含有12个可能为二恶英反应片段(DREs)所特有的核苷酸序列cacga与gcgtg(被框起来的部分)；图6显示依据本发明的小鼠肝癌转化细胞株Hepa1c1c7-M4P2在以100pM的二恶英(2，3，7，8-TCDD)予以处理历时一段不同的时间(5、10、15与20小时)后所测得的光强度结果；图7显示依据本发明的小鼠肝癌转化细胞株Hepa1c1c7-MP在以100pM的二恶英(2，3，7，8-TCDD)予以处理历时一段不同的时间(5、10、15与20小时)后所测得的光强度结果；图8显示依据本发明的小鼠肝癌转化细胞株Hepa1c1c7-M4P2在以不同浓度的二恶英(2，3，7，8-TCDD)予以处理历时15小时后所测得的光强度结果；图9显示依据本发明的小鼠肝癌转化细胞株Hepa1c1c7-MP在以不同浓度的二恶英(2，3，7，8-TCDD)予以处理历时15小时后所测得的光强度结果；图10显示依据本发明的小鼠肝癌转化细胞株Hepa1c1c7-M4P2在以不同浓度的二恶英(2，3，7，8-TCDD)、两种浓度的标准样品S1与S2以及飞灰样品29予以处理历时15小时后所测得的光强度结果；以及图11显示依据本发明的小鼠肝癌转化细胞株Hepa1c1c7-MP在以不同浓度的二恶英(2，3，7，8-TCDD)、两种浓度的标准样品S1与S2以及飞灰样品29予以处理15小时后所测得的光强度结果。
小鼠肝癌转化细胞株Hepa1c1c7-MP与Hepa1c1c7-M4P2已于公元2004年6月18日被寄存于美国典型培养物保藏中心(ATCC，P.O.Box1549，Manassas，VA 20108，USA)，寄存编号分别为PTA-6089与PTA-6090。
具体实施例方式
先前的研究显示，当二恶英进入细胞后会和带有两个热休克蛋白90(heat shock protein 90，HSP90)的芳族烃受体(aromatichydrocarbon receptor，AHR)结合而形成复合物，而该复合物在进入细胞核之后会分离，并通过一连串的下游分子的作用后辗转传递至DNA上，并与DNA上所存在的二恶英反应片段(DRE)结合，而使得受该二恶英反应片段调控的基因被大量地表现，进而影响到整个生物体的生理系统。针对此传递路径的特色，申请人尝试构建含有二恶英反应片段(DRE)和报告基因的重组载体(recombinant vector)，并将所形成的重组载体送入一感受态的宿主细胞(competent cell)内，以建立出带有该重组载体的重组细胞株。
由此所得到的重组细胞株可被应用于一种用于检测一取自于自然环境的样品中的二恶英类化合物的生物分析。首先，使用不同浓度的二恶英标准品来处理该重组细胞株，以建立出一有关二恶英浓度相对于该重组细胞株所带有的重组载体上所具有的报告基因的表现能力之间的关联性。
而后，从一自然环境(例如土壤，水源，供食用的肉类、鱼类、蔬果等等，工厂或焚化炉的烟道、底灰、底泥等等)取得一可能含有二恶英类化合物(dioxin-like compounds)的原始样品(original sample)，并依照后文所描述的各种预处理(preliminarytreatment)来作适当处理，而得到一要被试验的待测样品(analyteunder test)。
之后，令该待测样品接触该重组细胞株历时一段时间，并测定该重组细胞株所带有的重组载体上所具有的报告基因的表现结果。将由此所得到的测定结果拿来与上面所建立出的二恶英浓度相对于该报告基因的表现能力之间的关联性作一比对，就可推算出该原始样品内所含有的二恶英数量。
依据本发明，CYP1A1基因是一适于作为寻找有用的二恶英反应片段(DRE)的来源，因此，申请人依据NCBI网址中所登录的寄存编号(accession number)AF210905[小家鼠(Mus musculus)CYP1A1基因，启动子区域与部分序列]当中所示的核苷酸序列以及寄存编号X01681[小家鼠(Mus musculus)CYP1A1基因]当中所示的核苷酸序列，而设计出针对小家鼠(Mus musculus)CYP1A1基因序列中的二恶英反应片段(DREs)的下面两组引物对(primer pairs)正向引物15’-cagagagcacctgcaaaaca-3’(序列辨识编号1)反向引物15’-ggctacaaagggtgatgctt-3’(序列辨识编号2)
正向引物25’-ctcgaggagggcaggtgaaggtgttag-3’(序列辨识编号3)反向引物25’-aagcttaagtgaagagtgttctctagg-3’(序列辨识编号4)于是，当以小家鼠(Mus musculus)CYP1A1基因序列作为模板(template)时，使用由正向引物1与反向引物1所构成的第一引物对(first primer pair)来进行聚合酶链式反应(PCR)，可以得到一为479bp的PCR产物(序列辨识编号5)(参见图4)，而使用由正向引物2与反向引物2所构成的第二引物对(second primer pair)来进行PCR，可以得到一为1503bp的PCR产物(序列辨识编号6)(参见图5)。这两个PCR产物被发现分别带有7与12个可能为二恶英反应片段所特有的核苷酸序列(cacgc与gcgtg)。于是，本发明使用这两个PCR产物来进一步构建所欲的重组载体。
依据本发明，可以于重组载体的克隆过程中使用中介细胞(intermediate cells)(例如，大肠杆菌细胞)来大量扩增上述两个PCR产物，而这当中所涉及到的实验方法与材料是熟悉此项技术人士参考本领域中所详知的教科书就可据以实施者。例如，参见，Sambrook J，Russell DW(2001) Molecular CloningaLaboratory Manual，3rd ed.Cold Spring Harbor LaboratoryPress，New York。
适用于插入上述任一PCR产物的载体包含一个供在适当的条件下筛选该载体的标记基因(marker gene)或报告基因(reportergene)。
可用于本发明的标记基因包括，例如，用于真核细胞培养物的二氢叶酸还原酶基因以及G418或新霉素(neomycin)抗性基因，以及用于大肠杆菌与其它细菌培养物的氨苄青霉素(ampicilin)、链霉素(streptomycine)、四环素(tetracycline)或康那霉素(kanamycine)抗性基因。
适用于本发明的载体可以含有其它表现控制要素，例如一转录起始位点(transcription starting site)、一转录终止位点(transcription termination site)、一核糖体结合位点(ribosomebinding site)、一RNA剪接位点(RNA splicing site)、一个聚腺苷酸化位点(polyadenylation site)以及一个转译终止位点(translation termination site)、多克隆位点(multiple cloningsite，MCS)。适用于本发明的载体还可包含另外的调控要素，例如转录/转译的增强子序列(enhancer sequences)等。适用于本发明的载体也可包含一编码分泌信号(secretion signal)的核酸序列。这些序列是熟悉此项技术者已知的。
在本发明的一个较佳具体例中，一带有荧光素酶基因(luclluc+)以作为报告基因的载体被使用，这包括，但不限于，pGL2-启动子载体与pGL3-基本载体。
在本发明的一个较佳具体例中，该479bp的PCR产物在经过使用中介细胞的增殖处理后被并入至pGL2-启动子载体内，而得到一重组载体M4P2。
在本发明的另一较佳具体例中，该载体1503bp的PCR产物在经过使用中介细胞的增殖处理后被并入至pGL3-基本载体内，而得到一重组载体MP。
上述两个重组载体进而可被转移至一感受态的宿主细胞内，以生成所欲的重组细胞株。在本发明的一个较佳具体例中，该感受态的宿主细胞是小鼠肝癌细胞Hepa-1C1C7。在以该重组载体M4P2与该重组载体MP来分别转染小鼠肝癌细胞Hepa-1C1C7后，得到小鼠肝癌转化细胞株Hepa1c1c7-M4P2以及小鼠肝癌转化细胞株Hepa1c1c7-MP。
小鼠肝癌转化细胞株Hepa1c1c7-MP与Hepa1c1c7-M4P2已先后于公元2004年5月7日与2004年5月14日被寄存于台湾的食品工业发展研究所的生物资源保存及研究中心(BCRC of FIRDI)(台湾300新竹市食品路331号)，寄存编号分别为BCRC 960207与BCRC 960208。此二细胞株也有依据布达佩斯条约的规定，于公元2004年6月18日被寄存于美国典型培养物保藏中心(ATCC，P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108，USA)，寄存编号分别为PTA-6089与PTA-6090。
申请人进一步确认上述细胞株对于二恶英的反应能力，其中使用2，3，7，8-TCDD作为测试化合物并变化测试浓度与反应时间后，而成功地建立出此二细胞株内所带有的重组载体上所具有的荧光素酶基因的表现能力相对于二恶英浓度的关联性。于是，依据本发明该重组细胞株可供应用于通过生物分析法(bioassay)来定性地或定量地检测存在于一从自然环境(例如土壤，水源，供食用的肉类、鱼类、蔬果等等，工厂或焚化炉的烟道、底灰、底泥等等)所收集到的样品内的二恶英类化合物。
本发明将就下面实施例来作进一步说明，但应了解的是，该实施例仅为例示说明用，而不应被解释为本发明实施上的限制。
实施例一般实验方法与材料本发明中所采用的实验方法以及用于DNA克隆(DNAcloning)的相关技术，是参考本领域中所详知的教科书SambrookJ，Russell DW(2001)Molecular Cloninga LaboratoryManual，3rd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，NewYork，例如使用限制酶的DNA剪切反应(DNA cleavage reactionby restriction enzymes)、使用T4 DNA黏接酶(ligase)的DNA黏接反应(DNA ligation with T4 DNA ligase)、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)、琼脂糖凝胶电泳法(agarose gelelectrophoresis)、硫酸十二酯钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)和质粒转化法(plasmid transformation)等，而这些技术都是熟悉此项技术人士可根据本身的专业素养来实施者。例如，于下面实施例中所使用的质粒转化法是以经氯化钙(CaCl2)处理的感受态细胞(calcium chloride-treated competent cell)来进行。
少量质粒(plasmid)的制备、大量质粒的制备以及DNA片段的纯化回收是分别使用Plasmid Miniprep Purification Kit(Bertec Enterprise Co.，Ltd.)、Plasmid Midiprep kit(VIOGENE)和Gel Elution Kit(VIOGENE)等商业化纯化试剂盒来进行。
I、实验材料1.二恶英[2，3，7，8-四氯二苯并-ρ-二恶英(2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-ρ-dioxin，2，3，7，8-TCDD)(购自WellingtonLaboratories，Inc.)溶液，原始浓度为10μg/ml，在实验之前使用二甲亚(DMSO)予以稀释成不同浓度备用；2.二恶英标准品[含17种二恶英/呋喃化合物(dioxin/furancompounds)2，3，7，8-TCDD、2，3，7，8-TCD F、1，2，3，7，8-PeCDD、1，2，3，7，8-PeCDF、2，3，4，7，8-PeCDF、1，2，3，4，7，8-HxCDD、1，2，3，6，7，8-HxCDD、1，2，3，7，8，9-HxCDD、1，2，3，4，7，8-HxCDF、1，2，3，6，7，8-HxCDF、1，2，3，7，8，9-HxCDF，2，3，4，6，7，8-HxCDF、1，2，3，4，6，7，8-HpCDD、1，2，3，4，6，7，8-HpCDF、1，2，3，4，7，8，9-HpCDF、OCDD、OCDF]是由正修科技大学超微量中心所提供；3.下列实验材料是购自波仕特生物科技股份有限公司(Protech Technology Enterprise Co.Ltd.)TBE缓冲液[TBEbuffer，Tris/硼酸盐(borate)/EDTA]、PBS缓冲液(PBS buffer，NaCl/KCl/Na2HPO4/KH2PO4，pH7.4)、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷酶(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)、酚/氯仿/异戊醇(phenol/chloroform/isoamyl alcohol)、5-溴-4-氯-3-吲哚-6-D-半乳糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galactoside，X-Gal)；4.下列实验材料是购益生生技开发股份有限公司(YeasternBiotech Co.，Ltd.)YEA DNA聚合酶(YEA DNA polymerase)，10倍缓冲液(10X buffer)；5.培养基最低必需培养基(Minimum essential medium，MEM)是购自BioWest；杜贝可氏改良的依格氏培养基(Dulbecco’sModified Eagles Medium，DMEM)是购自GibcoBRL；α-最低必需培养基(Alpha-minimum essential medium，α-MEM)是购自BioWest，LB肉汤培养基(LBBroth)是购自Athena EnzymeSystem Inc.；营养琼脂培养基(Nutrition Agar)是购自BectonDickson Inc.；胎牛血清Fetal Bovine serum(FBS)是购自Hyclone Inc.；以及马血清(horse serum，HS)是购自BioWest；6.细菌培养用抗生素氨苄青霉素(ampicillin)(A1593)是购自Sigma；青霉素-链霉素(penicillin-streptomycin)是购自Invitrogen Inc.；以及GENETICIN(G-418硫酸盐)是购自GibcoBRL；7.限制酶(restriction enzymes)KpnI与BglII是购自NewEngland Biolabs，Ltd.(NEB)，HindII是购自Promega，而XhoI是购自GibcoBRL；8.Luciferase Assay System(Cat#1500)是购自PromegaCooperation；pcDNA是购自Invitrogen Cooperation；GenePORTERTM2 Transfection Reagent是购自GST Inc.；SeaKem LE琼脂糖(agarose)是购自FMC Bioproducts Inc.；胰蛋白酶-EDTA(trypsin-EDTA)是购自GibcoBRL；二甲亚砜
(DMSO)与溴化乙锭(EtBr，E8751)是购自Sigma；1Kb DNA梯(DNA Ladder)与装填染料缓冲液(loading dye buffer)是购自Biolabs Inc.；9.下列实验材料是购自益生生技开发股份有限公司(Yeastern Biotech Co.，Ltd.)大肠杆菌菌株JM109(E.colistrain JM 109)，它的培养与储存方式是根据供货商的产品说明书；yT&A Cloning Vector Kit，包含有yT&A克隆载体、接合缓冲液A(ligation buffer A)、接合缓冲液B、T4DNA连接酶(ligase)，其中yT&A克隆载体(2728bp)的架构如图1所示，并具有氨苄青霉素抗性基因(ampicillin resistance gene，AP)、T7启动子(T7promoter)、β-半乳糖苷酶基因(β-galactosidase gene，lacZ)以及多克隆位点(multiple cloning site，MCS)；10.下列载体是购自Promega CooperationpGL2-启动子载体(pGL2-promoter vector)(5790bp)的架构如图2所示，并具有氨苄青霉素抗性基因(Ampr)、SV40启动子、荧光素酶基因(luc)以及多克隆位点等；以及pGL3-基本载体(pGL3-basicvector)(4818bp)的架构如图3所示，并具有氨苄青霉素抗性基因(Ampr)、荧光素酶基因(luc+)以及多克隆位点等；II、细胞株与培养条件被用来进行转染作用的宿主细胞是小鼠肝癌细胞(mousehepatoma cell)Hepa-1C1C7以及小鼠巨噬细胞(mousemacrophage cell)J774A.1，它们皆是购自台湾的食品工业发展研究所(Food Industry Research and Development Institute，FIRDI)的生物资源保存及研究中心(Biosource Collection andResearch Center，BCRC)(台湾300新竹市食品路331号)，寄存编号为BCRC 60104与BCRC60140，并各自依据下面所述方式来作继代培养(subculture)
1.Hepa-1C1C7细胞将细胞混合以添加有10％胎牛血清(FCS)的不含核苷酸的α-MEM(nucleotide-free Alpha minimum essential mediumsupplemented with 10％FCS)，并将所形成的细胞悬浮液加入至培养皿内，并在培养条件被设定为37℃与5％CO2的培养箱中进行培养。当培养皿底部的面积有80至90％被培养的细胞所覆盖时，移除培养液并以3至5ml的PBS缓冲液(pH 7.4)清洗细胞，继而加入1ml的胰蛋白酶-EDTA以使细胞自培养皿的底部脱离。之后，加入新鲜的培养液来中和胰蛋白酶活性并以移液管(pipette)反复冲吸培养液以打散细胞，然后将所形成的细胞悬浮液分配至培养皿(直径10cm)中，并在培养条件被设定为37℃、5％CO2的培养箱中进行培养。
2.J774A.1细胞将细胞加入至含有4mM L-谷氨酰胺(L-glutamine)并被调整至含有1.5g/L的碳酸钠以及4.5g/L的葡萄糖且添加有10％胎牛血清的杜贝可氏改良的依格氏培养基(DMEM)中，并将所形成的细胞悬浮液加入至培养皿内，并在培养条件被设定为37℃与5％CO2的培养箱中进行培养。当培养皿底部的面积有80至90％被培养的细胞所覆盖时，移除培养液并以3至5ml的PBS缓冲液(pH7.4)清洗细胞，然后以刮刀轻轻划过培养皿的底部以使细胞自培养皿的底部脱离。之后，加入新鲜的培养液并以移液管(pipette)反复冲吸培养液以打散细胞，然后将所形成的细胞悬浮液分配至培养皿(直径10cm)中，并在培养条件被设定为37℃、5％CO2的培养箱中进行培养。
III、源自不同自然来源的含有二恶英的样品的前处理(Preliminary treatments of dioxin-containing samples fromdifferent natural sources)
1.环境样品的前处理环境样品主要是取自于下列来源的样品土壤(soil)，水源，工厂或焚化炉的烟道、飞灰、底灰以及底泥等。
(1)萃取步骤(extraction step)称取一适量的样品并予以放入至一已清洗过的圆筒滤纸(Thimble Filter)(Toyo Roshi Kaisha，Ltd.)内，然后将圆筒滤纸放入索氏萃取器回流管(soxhlet)中，接着予以加入2g的无水硫酸钠，并另外取150ml的甲苯置于一个250ml的平底烧瓶中，并对样品进行回流式萃取处理(extraction treatment with refluxing)历时24小时。之后，利用减压浓缩将甲苯萃取液浓缩至大约1ml以供后续处理。
(2)酸洗步骤(acid-wash step)将步骤(1)所得到的甲苯萃取物加入至一个具有一铁氟龙内榇瓶盖的24ml样品瓶中，继而加入7ml的正己烷(n-hexane)并振荡该样品瓶历时大约5秒，然后加入4ml的浓硫酸(98％)予以酸洗并剧烈振荡该样品瓶历时大约20秒。之后，进行离心(2000rpm，2分钟)以产生分层并收集硫酸酸层，而正己烷层则再以硫酸予以酸洗直到硫酸酸层变为白色(不超过3次酸洗)。将正己烷层收集于一个50ml样品瓶中。各硫酸酸层再以7ml的正己烷逐一萃取两次。将所有的正己烷层收集于该50ml样品瓶中，并予以减压浓缩至大约1ml以供后续处理。
(3)使用多层硅胶管柱的净化步骤(purification step using amulti-layered silica gel column)于一个多层硅胶管柱(直径0.5cm，长20cm)的尖形底部装填以玻璃棉(glass wool)，继而依序地填入0.5g硅胶(silica gel)、0.5g硝酸银硅胶(AgNO3-silica gel)、0.5g硅胶、0.5g氢氧化钠硅胶(NaOH-silica gel)、0.5g硅胶、5g硫酸硅胶(sulfuric acid-silicagel)、0.5g硅胶及0.5g无水硫酸钠(anhydrcus sodium sulfate)，并于充填(packing)时以玻璃棒予以压实。以30ml正己烷预洗(pre-wash)充填好的管柱并丢弃洗液。
将步骤(2)中所得的1ml酸洗产物移入至预洗过的多层硅胶管柱中，待酸洗产物全部进入至管柱内后，以1ml的正己烷来清洗含有酸洗产物的样品瓶共计3次，并将正己烷洗液再移入至该管柱中。接着，以5ml的正己烷来洗脱(eluting)管柱共计两次，继而以120ml的正己烷洗脱管柱，并将洗脱物(eluate)收集至一个300ml的锥形瓶中。以氮气吹扫(nitrogen purge)将所收集的洗脱物(eluate)吹至近干。至此所得到的净化产物里面含有二恶英化合物(dioxin compounds)、非平面型多氯联苯化合物(non-planarpolychlorinated biphenyl compounds)以及平面型多氯联苯化合物(planar polychlorinated biphenyl compounds)。
若欲分析该净化产物里面所含上述三类化合物的总浓度，可将该净化产物溶于DMSO内，并使用将于后文中所描述的生物分析方法来进行此等化合物的总浓度检测。
而若欲分析该净化产物里面所含二恶英化合物、非平面型多氯联苯化合物以及平面型多氯联苯化合物的各别浓度，该净化产物须再进行下面使用酸性氧化铝管柱与活性碳管柱净化步骤，俾以将二恶英化合物、非平面型多氯联苯化合物以及平面型多氯联苯化合物予以分开，而后再以将于后文中所描述的生物分析方法来进行浓度分析。
(4)使用酸性氧化铝管柱的净化步骤于一酸性氧化铝管柱(acid aluminum oxide column)(直径0.5cm，长20cm)的尖形底部填入玻璃棉，之后依序地填入1g硅胶、6g酸性氧化铝、1g硅胶以及1g无水硫酸钠。以20ml正己烷来预洗已充填好的管柱并丢弃洗液。
从步骤(3)中的多层硅胶管柱被洗脱出的洗脱物在被氮气吹扫至成为1ml后，予以移入预洗过的酸性氧化铝管柱中，然后以5ml的正己烷进行洗脱共计两次，继而以90ml的正己烷洗脱管柱，并将洗脱物(eluate)收集至一个150ml的锥形瓶中。至此所得到的洗脱物里面含有非平面型多氯联苯化合物。
若分析该洗脱物所含有的非平面型多氯联苯化合物的浓度，可将该洗脱物以氮气吹扫至近干，然后予以溶于DMSO内，并使用将于后文中所描述的生物分析方法来进行化合物的浓度分析。
在完成正己烷洗脱后，酸性氧化铝管柱再以20ml的二氯甲烷/正己烷(methylene chloride/n-hexane)(20/80，v/v)进行洗脱，并将洗脱物收集于一个50ml的样品瓶中，缓慢地以氮气吹扫至近干，至此所得到的洗脱物里面含有二恶英化合物与平面型多氯联苯化合物的混合物。将该洗脱物溶于1ml正己烷并装于一样品瓶内，以便进行下面的活性碳管柱净化步骤。
(5)使用活性碳管柱的净化步骤于一活性碳/硅藻土(activated carbon/celite)管柱(直径0.5cm，长20cm)的尖形底部填入玻璃棉，之后依序地填入0.5g硅胶、0.5g活性碳/硅藻土(18/82，v/v)以及0.5g硅胶，于充填时以玻璃棒予以压实。之后，充填好的管柱依序地以各为5ml的甲醇(methanol)、甲苯(toluene)、二氯甲烷/甲醇/甲苯(75/20/5，v/v/v)、环己烷/二氯甲烷(cyclohexane/methylenechloride)(50/50，v/v)以及正己烷予以预洗并将洗液丢弃。
将上述步骤(4)中从经过二氯甲烷/正己烷洗脱后所得到的1ml正己烷溶液移入至该活性碳/硅藻土管柱中，待该正己烷溶液全部进入至管柱内后，以1ml的正己烷来清洗样品瓶共计3次，并将正己烷洗液再移入至该管柱中。
接着，以2ml的环己烷/二氯甲烷(50/50，v/v)洗脱该活性碳/硅藻土管柱共计4次，再以1ml的二氯甲烷/甲醇/甲苯(75/20/5，v/v/v)洗脱管柱共计两次，所有的洗脱物被合并于一个50ml的样品瓶中，至此所得到的洗脱物含有平面型多氯联苯化合物。
若欲分析该平面型多氯联苯化合物的浓度，以氮气吹扫将所收集的洗脱物液吹到近干，然后溶于DMSO内，并使用将于后文中所描述的生物分析方法来进行化合物的浓度分析。
在完成上述洗脱后，该活性碳/硅藻土管柱再以35ml的甲苯予以洗脱，而洗脱物被收集于一个150ml的锥形瓶内，至此步骤所得到的洗脱物含有二恶英类化合物。
若欲单独分析二恶英化合物，以氮气吹扫将所收集的将该甲苯洗脱物吹到近干，然后溶于DMSO内，并使用将于后文中所描述的生物分析方法来进行二恶英类化合物的浓度分析。
2.植物样品的前处理(1)植物样品的萃取称取一适量的样品并予以放入至一个250ml的棕色血清瓶中，接着加入50ml正己烷、50ml二氯甲烷、25ml的37.5％HCl以及25ml的超纯水，并摇晃振荡该棕色血清瓶历时24小时。之后，将所形成的混合物倒入至一分液漏斗中，并以50ml的正己烷清洗该棕色血清瓶共计两次，而洗液也予以倒入至该分液漏斗中。该分液漏斗被静置，由此而形成一有机上层(organic upper layer)与一水性下层(aqueous lower layer)。收集该有机上层，并以50ml的正己烷清洗该水性下层共计两次，然后将两次的正己烷洗液与该有机上层合并，并将所形成的有机混合物减压浓缩成为大约1ml的浓缩物。
之后，该1ml的浓缩物可依照上述“环境样品的前处理”中的(2)酸洗步骤、(3)使用多层硅胶管柱的净化步骤、(4)使用酸性氧化铝管柱的净化步骤以及(5)使用活性碳管柱的净化步骤来作进一步的处理。
3.含脂样品的前处理(1)含脂样品的萃取含脂样品主要是指取自于下列来源的样品肉类、饲料、血液以及乳品等。
称取一适量的样品并放入至一个250ml棕色瓶中，加入150ml二氯甲烷并摇晃振荡该棕色瓶历时24小时。之后。将二氯甲烷萃取液倒入一烧瓶中，并以50ml的二氯甲烷清洗该棕色瓶共计两次，并将洗液全部倒入至该烧瓶中，然后将所形成的混合物减压浓缩成大约1ml的浓缩物。
(2)油含量百分比的测定(detection of oil content％)将上述萃取步骤(1)中所得到的1ml浓缩物通入至一个含有0.5g硅胶的管柱(直径0.5cm，长20cm)内，以50ml的二氯甲烷来洗脱该管柱，并将所收集的洗脱物浓缩至干，即得到一油脂。将该油脂所秤得的重量除以该含脂样品的重量即可算出该含脂样品的油含量百分比。
(3)酸洗步骤将上述步骤(2)中所得到的油脂加入至一个具有一铁氟龙内榇瓶盖的50ml的样品瓶中，继而加入10ml的正己烷并振荡该样品瓶历时大约5秒，然后加入7ml的浓硫酸(98％)予以酸洗并剧烈振荡该样品瓶历时大约20秒。之后进行离心(2000rpm，2分钟)，藉此而得到一正己烷层与一硫酸层。收集硫酸酸层，而正己烷层则再以硫酸予以酸洗直到硫酸酸层变为白色(不超过3次酸洗)。将正己烷层收集于一个50ml样品瓶中。各硫酸酸层分别再以7ml的正己烷予以萃取两次。将所有的正己烷层收集于该50ml样品瓶中，并予以减压浓缩成为大约1ml的浓缩物以供后续处理。
(4)使用酸性硅胶管柱的净化步骤(purification step usingan acid silica gel column)于一个酸性硅胶管柱(直径0.5cm，长20cm)的尖底部装填以玻璃棉，继而依序地填入20g硅胶、100g硫酸硅胶、20g硅胶以及10g无水硫酸钠，并于充填时以玻璃棒予以压实。以50ml正己烷来预洗充填好的管柱并丢弃洗液。
将上述酸洗步骤(3)中所得到的1ml浓缩物移入至经预洗过的该酸性硅胶管柱中，待该浓缩物全部进入至管柱内后，以1ml的正己烷来清洗该50ml的样品瓶共计3次，并将正己烷洗液全部加入至该酸性硅胶管柱中。接着，以5ml的正己烷来洗脱管柱共计两次，继而以500ml的正己烷洗脱管柱，并将洗脱物收集于一个1000ml的锥形瓶内。以氮气吹扫将所收集的洗脱物吹至近干。
之后，由此所得到的残余物可依照上述“环境样品的前处理”中的(3)使用多层硅胶管柱的净化步骤、(4)使用酸性氧化铝管柱的净化步骤以及(5)使用活性碳管柱的净化步骤来作进一步的处理。
实施例1.构建含有二恶英反应片段的重组载体M4P2与MP(Construction of recombinant plasmids M4P2 and MPcontaining dioxin-response elements)根据NCBI网址中所登录的寄存编号(accession number)AF210905[小家鼠(Mus musculus)CYP1A1基因，启动子区域与部分序列]当中所示的核苷酸序列以及寄存编号X01681[小家鼠(Mus musculus)CYP1A1基因]当中所示的核苷酸序列，并利用软件Primer3 Version而设计出针对小家鼠(Mus musculus)CYP1A1基因序列中的二恶英反应片段(DREs)的下面两组引物对(primer pairs)，其中该等引物的核苷酸序列是委托波仕特生物科技股份有限公司来合成正向引物(forward primer)15’-cagagagcacctgcaaaaca-3’(序列辨识编号1)
反向引物(reverse primer)15’-ggctacaaagggtgatgctt-3’(序列辨识编号2)正向引物25’-ctcgaggagggcaggtgaaggtgttag-3’(序列辨识编号3)反向引物25’-aagcttaagtgaagagtgttctctagg-3’(序列辨识编号4)其中正向引物2与反向引物2分别被设计成具有限制酶XhoI和HindII的切割位点(如底线所标示者)。
因此，当以小家鼠(Mus musculus)CYP1A1基因序列作为模板(template)，使用由正向引物1与反向引物1所构成的第一引物对(first primer pair)来进行聚合酶链式反应(PCR)，可以得到一为479bp的PCR产物(序列辨识编号5)(参见图4)，而使用由正向引物2与反向引物2所构成的第二引物对(second primer pair)来进行PCR，可以得到一为1503bp的PCR产物(序列辨识编号6)(参见图5)。这两个PCR产物带有可能为二恶英反应片段所特有的核苷酸序列(cacgc与gcgtg)，而于下面的实验中被用来构建重组载体M4P2与MP。
(A)重组载体M4P2的构建依据上面“一般实验方法”一节中所述的方法，自小鼠巨噬细胞J774A.1分离与纯化出染色体DNA(chromosomal DNA)来作为模板，并使用由正向引物1与反向引物1所构成的第一引物对来进行PCR反应，而扩增出一为479bp的PCR产物，其中该PCR产物的核苷酸序列对应于NCBI网址中所登录的寄存编号AF210905的核苷酸残基210-688，并且当中含有7个可能为二恶英反应片段(DREs)所特有的核苷酸序列cacga与gcgtg(参见图4中被框起来的部分)。
使用yT&A克隆载体试剂盒(yT&A Cloning Vector Kit，Yeastern Biotech Co.，Ltd.)而将该被扩增出的479bp PCR产物克隆至yT&A克隆载体(2728bp，其架构如图1所示)内，继而依照上面“一般实验方法”一节中所述的质粒转化法将所形成的重组载体转染至大肠杆菌JM109细胞(Yeastern Biotech Co.，Ltd)中，并利用含有氨苄青霉素的固态培养皿来筛选由被转染的大肠杆菌细胞(transformed E.coli cells)所长出的抗-氨苄青霉素菌落(ampicillin-resistant colonies)。
之后，使用Plasmid Miniprep Purification Kit(BertecEnterprise Co.，Ltd.)而从筛选出的重组型氨苄青霉素抗性大肠杆菌菌落来纯化出质粒以作为模板，并使用该第一引物对来进行PCR反应，并以琼脂糖凝胶电泳法(agarose gel electrophoresis)来作分析，由此，一含有一所具核苷酸序列大体上是对应于该479bpPCR产物所具者的DNA片段的重组型yT&A克隆载体被筛选出。
依照上面“一般实验方法”一节中所述，使用限制酶KpnI/BglII来切割该被筛选出的重组型yT&A克隆载体，而得到一个KpnI-BglII DNA片段(0.5Kb)。
之后，将该KpnI-BglII DNA片段并入至以KpnI/BglII切开的pGL2-启动子载体[5790bp，其架构如图2所示，其中具有荧光素酶基因(luc)](Promega Cooperation)内，而得到一含有一所具核苷酸序列大体上是对应于该479bp PCR产物所具者的DNA片段的重组载体M4P2，其中被并入的KpnI-BglII DNA片段坐落在pGL2-启动子载体的荧光素酶基因(luc)的上游处。
依照上面“一般实验方法”一节中所述的质粒转化法，该重组载体M4P2通过被转染至大肠杆菌菌株JM109中而被大量地复制。之后，依照前面所述的操作方式来抽取重组载体M4P2并进行PCR反应，俾以确认该重组载体M4P2中是否含有一对应于该479bpPCR产物的DNA片段，而该重组载体M4P2也被定序以作进一步的确认。
经确认的重组载体M4P2通过被转染至大肠杆菌菌株JM109内而被大量地复制，继而用Plasmid Midiprep Purification Kit予以纯化，然后将被纯化的重组载体M4P2储存于-20℃下备用。
(B)重组载体MP的构建依据上面“一般实验方法”一节中所述的方法，自小鼠巨噬细胞J774A.1分离与纯化出染色体DNA(chromosomal DNA)来作为模板，并使用由正向引物2与反向引物2所构成的第二引物对来进行PCR反应，而扩增出一为1503bp的PCR产物，其中该PCR产物的核苷酸序列是大体上对应于NCBI网址中所登录的寄存编号AF210905的核苷酸残基108-1557加上寄存编号X01681的核苷酸残基22-63，并且当中含有12个可能为二恶英反应片段(DREs)所特有的核苷酸序列cacga与gcgtg(参见图5中被框起的部分)。
使用yT&A克隆载体试剂盒(yT&A Cloning Vector Kit，Yeastern Biotech Co.，Ltd.)而将该被扩增出的1503bp PCR产物克隆至yT&A克隆载体内，继而依照上面“一般实验方法”一节中所述的质粒转化法将所形成的重组载体转染至大肠杆菌JM109细胞中，并利用含有氨苄青霉素的固态培养皿来筛选由被转染的大肠杆菌细胞所长出的抗-氨苄青霉素菌落。
使用Plasmid Miniprep Purification Kit(BertecEnterprise Co.，Ltd.)而从筛选出的重组型氨苄青霉素抗性大肠杆菌菌落来纯化出质粒以作为模板，并使用该第二引物对来进行PCR反应，并以琼脂糖凝胶电泳法(agarose gel electrophoresis)来作分析，由此，一含有一所具核苷酸序列是大体上对应于该1503bp PCR产物所具者的DNA片段的重组型yT&A克隆载体被筛选出。
依照上面“一般实验方法”一节中所述，使用限制酶HindIII/XhoI来切割该被筛选出的重组型yT&A克隆载体，而得到一个HindIII-XhoI DNA片段(大约1.5Kb)。之后，将该HindIII-XhoI DNA片段次克隆至以限制酶HindIII/XhoI切开的pGL3-基本载体[4818bp，其架构如图3所示，其中具有荧光素酶基因(luc+)](Promega Cooperation)内，而得到一含有一所具核苷酸序列是大体上对应于该1503bp PCR产物所具者的DNA片段的重组载体MP，其中该HindIII-XhoI DNA片段坐落在pGL3-基本载体的荧光素酶基因(luc+)的上游处。
依照上面“一般实验方法”一节中所述的质粒转化法，该重组载体MP通过被转染至大肠杆菌菌株JM109中而被大量地复制。之后，依照前面所述的操作方式来抽取重组载体MP并进行PCR反应，以确认该重组载体MP中是否含有一对应于该1503bp PCR产物的DNA片段，而该重组载体MP也被定序以作进一步的确认。
经确认的重组载体MP通过被转染至大肠杆菌菌株JM109内而被大量地复制，继而用Plasmid Midiprep Purification Kit予以纯化，然后将被纯化的重组载体MP储存于-20℃下备用。
实施例2.使用重组载体M4P2与MP来转染小鼠肝癌细胞Hepa-1C1C7(Transfection of mouse hepatoma cellsHepa-1C1C7 with recombinant vectors M4P2 and MP)Hepa-1C1C7细胞株可依照下列制备程序A或制备程序B而被重组载体MP或M4P2所转染，其中Hepa-1C1C7细胞株的培养方式是依照上面“细胞株与培养条件”一节中所述的操作程序来进行。
制备程序A1.将172μl的基本DMEM与28μl的GenePORTERTM2Transfection Reagent(GST Inc.)混合均匀以形成一第一溶液，另将200μl的New DNA diluent B(GST Inc.)与8μg的DNA[其中所选用的重组载体的DNA以及pcDNA(InvitrogenCooperation)各为4μg]混合均匀以形成一第二溶液，并让该第一与第二溶液分别静置历时5分钟；之后，将此二溶液均匀混合，然后让由此所形成的混合物静置历时20分钟；2.将2×107细胞/ml的Hepa-1C1C7细胞加入至一个10cm2的培养皿内，并于一设定为37℃、5％CO2的恒温培养箱中进行培养历时大约18-20小时，而使得培养皿底部的面积有70％～80％被细胞所覆盖；之后，移除培养基并以1X PBS清洗细胞共计2次，然后加入5ml的新鲜基本DMEM培养基；3.将步骤1中所准备好的混合物加入至培养皿内，并于37℃、5％CO2的恒温培养箱中进行培育历时大约4小时；之后，将适量培养基(DMEM+20％FBS)加入至培养皿内，并继续培养历时20小时；4.移除培养基，以1X PBS清洗细胞共计2次并移除洗液，然后加入1ml的胰蛋白酶-EDTA来处理细胞历时不超过5分钟，接着加入9ml的培养基(DMEM+10％FBS)，然后将所形成的细胞悬浮物(the resultant cell suspension)分配到6-孔培养盘内继续培养；5.以培养基(DMEM+10％FBS)将步骤4所培养出的细胞稀释成具一细胞浓度为1个细胞/100μl，然后接种至96-孔培养盘(100μl/孔)内培养过夜；6.于显微镜下筛选96-孔培养盘内的每个孔内是否只有一个细胞，并将该细胞移到6-孔培养盘中继续培养，以建立被转染的细胞的个别纯株(individual clones of transfected cells)；以及7.就步骤4至6中所培养的细胞，可通过下面实施例3中所描述的二恶英诱导法(dioxin induction)来检测细胞是否会有表现荧光素酶基因的能力，俾以确认由此所建立的细胞株确实带有所选用的重组载体M4P2或MP。
制备程序B1.依照制备程序A中所述的步骤1来制备一第一混合物，但是使用8μg的pcDNA(Invitrogen Cooperation)来制备该第二溶液；接下来的步骤2至3同于上述制备程序A中所述的步骤2至3，然后继续进行下列步骤4.移除培养基并加入含有GENETICIN的培养基[90％基本DMEM+10％FBS，添加有G-418]来进行培育历时1周；5.依照制备程序A中所述的步骤1来制备一第二混合物，但是使用8μg的所选用的重组载体DNA来制备该第二溶液；6.对于通过步骤4的GENETICIN筛选的细胞，使用步骤5所制备的第二混合物来重复制备程序A中所述的步骤2至3，俾使细胞被所选用的重组载体M4P2或MP所转染；以及7.重复制备程序A中所述的步骤4至7。
申请人使用实施例1中所建立的两个重组载体M4P2以及MP来转染Hepa-1C1C7细胞，而得到两个经转染的小鼠肝癌细胞株，也即Hepa1c1c7-MP与Hepa1c1c7-M4P2。此二细胞株已分别于公元2004年5月7日与2004年5月14日被寄存于台湾的食品工业发展研究所的生物资源保存及研究中心(BCRC of FIRDI)，寄存编号分别为BCRC 960207与BCRC 960208。此二细胞株也有依据布达佩斯条约的规定，于公元2004年6月18日被寄存于美国典型培养物保藏中心(ATCC，P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108，USA)，寄存编号分别为PTA-6089与PTA-6090。
实施例3.建立二恶英浓度相对于荧光素酶所引发的光强度的关联性(Establishment of the correlation of dioxinconcentration vs.the light intensity caused by luciferase)
A.经转染的细胞内的荧光素酶基因在二恶英刺激后的表现(Expression of luciferase gene in transfected cells after thestimulation of dioxin)将经转染的细胞(4×105细胞/孔)置放于24孔-培养盘内，并于每孔加入1ml的培养基(DMEM+10％FCS)，然后将培养盘放在37℃、5％CO2的恒温培养箱中并静置2个小时以使细胞贴附。
以DMSO将浓度为10μg/ml的二恶英(2，3，7，8-TCDD)储备溶液(stock solution)作10倍连续稀释(10-fold serial dilution)，对各个稀释液分别取3.22μl并加入至培养盘的各孔内，俾使各实验组的二恶英最终浓度分别为10nM、1nM、100pM、50pM、10pM、1pM与0.1pM，且每一实验组作4个重复。正常对照组(normal control)是不作任何处理的细胞，而溶剂对照组(solve ntcontrol)是使用3.22μl DMSO予以处理的细胞。
在以二恶英来处理经转染的细胞历时一预定的时间(5hrs、10hrs、15hrs与20hrs)后，移除培养基并于每孔内加入150μl的1X细胞溶解溶液(cell lysis solution)(内含于Luciferase AssaySystem(Cat#1500)，Promega Cooperation)，然后轻轻摇晃培养盘历时15-20分钟以使细胞被完全溶解。之后，将位于每孔内的溶液移至一微量离心管(microtube)中，并于4℃下以12000rpm来离心历时2分钟，由此所得到的上清液(supernatant)就是以二恶英处理过的转染细胞溶胞产物(lysate of dioxin-treatedtransfected cell)。
将各组所得到的溶胞产物各取100μl并加入至不透明的96孔-培养盘(non-transparent 96-well plate)的各孔内，继而加入50μl的荧光素(luciferin)(内含于Luciferase Assay System，(Cat#1500)，Promega Cooperation)，最后使用Beckman coulterDU640B spectrophotometer[设定值为PMT1100，读取长度(read length)0.5，以及Gain1～100]来自动检测20秒内的光强度(lightintensity)。所得到的实验结果通过统计分析法予以分析绘图，并检视当中是否存在有统计显著性(statistic significance)。
B.结果图6与图7分别显示依据本发明的小鼠肝癌转化细胞株Hepa1c1c7-M4P2与Hepa1c1c7-MP在以100pM的二恶英(2，3，7，8-TCDD)予以处理5、10、15与20小时之后所测得的光强度结果，其中在检测Hepa1c1c7-M4P2的光强度时的检测敏感度被设定为100，而在检测Hepa1c1c7-MP时则予以设定为10。
由结果显示，小鼠肝癌转化细胞株Hepa1c1c7-M4P2在以100pM的二恶英(2，3，7，8-TCDD)予以处理15小时后会有最稳定以及最佳的光强度结果(图6)，而且正常组与DMSO组的背景值也非常低。但是经二恶英处理20小时之后，小鼠肝癌转化细胞株Hepa1c1c7-M4P2的反应显著地下跌。
至于小鼠肝癌转化细胞株Hepa1c1c7-MP，它在以二恶英处理20小时之后会有最稳定以及最佳的光强度结果(图7)，而在以二恶英予以处理15小时之后也会产生足够明显的反应，且光强度读取值非常高而需要将荧光分析仪的敏感度降到10才能全部读取。
根据这些实验结果，在接下来的实验中即将二恶英处理时间皆设定为15小时。
图8与图9分别显示依据本发明的小鼠肝癌转化细胞株Hepa1c1c7-M4P2与Hepa1c1c7-MP在以不同浓度(0.1pM、1pM、5pM、10pM、50pM、100pM以及1000pM)的二恶英(2，3，7，8-TCDD)予以处理15小时之后所测得的光强度结果，其中在检测Hepa1c1c7-M4P2的光强度时的检测敏感度被设定为10，而在检测Hepa1c1c7-MP时则予以设定为1。
参见图8，当使用依据本发明的小鼠肝癌转化细胞株Hepa1c1c7-M4P2来检测二恶英(2，3，7，8-TCDD)时，相对于对照组的光强度结果，仅使用5pM的2，3，7，8-TCDD来处理该细胞就可以观察到明显的光强度的变化。
而如图9所示，当使用依据本发明的小鼠肝癌转化细胞株Hepa1c1c7-MP来检测二恶英(2，3，7，8-TCDD)时，也可在5pM的2，3，7，8-TCDD处理下观察到明显的光强度的变化，并且要比Hepa1c1c7-M4P2更为明显。此外，相对于对照组的光强度结果，二恶英浓度和所测得的光强度之间呈现一非常清楚的正向关系。
总结，依据本发明的小鼠肝癌转化细胞株Hepa1c1c7-M4P2与Hepa1c1c7-MP的二恶英检测极限都是5pM。而当考虑到对照组的光强度(作为背景值)时，小鼠肝癌转化细胞株Hepa1c1c7-MP所产生的光强度差异较大，因此，就小鼠肝癌细胞Hepa-1C1C7而言，重组载体MP可能会是一较佳的转化载体。
实施例4.飞灰样品的二恶英含量的检测A.二恶英标准品的制备(Preparation of dioxinstandards)于一适当容器内，使用DMSO将下面表1中所列的17种二恶英/呋喃化合物(dioxin/furanc ompounds)依照各个化合物的毒性系数的比例而配制成总浓度为0.5ng-TEQ以及0.1ng-TEQ。之后，以氮气吹至近干，然后以128.8μl DMSO以回溶(redissolve)。
表1.二恶英标准品的配制
B.二恶英检测将2g的飞灰样品(由正修科技大学超微量中心提供)置于一烧杯中，并依照前面“环境样品的前处理”中所述的步骤来进行前处理，而得到一被回溶于DMSO内的飞灰样品29溶液。
依据实施例3中所述，取各为3.22μl的经10倍连续稀释的二恶英(2，3，7，8-TCDD)来处理细胞，并使二恶英于细胞培养液中的最终浓度分别为10nM、1nM、100pM、50pM、10pM、1pM、0.1pM。每一实验组作3个重复。正常对照组是不作任何处理的细胞，而溶剂对照组是使用3.22μl DMSO予以处理的细胞。
上述所得到的飞灰样品溶液29以及于步骤(A)中所配置的两种不同浓度的标准样品S1与S2也各取3.22μl来处理细胞，藉此，该飞灰样品溶液与该二标准样品S1与S2的浓度被稀释40倍。
在细胞经二恶英处理历时15小时之后，依照实施例3中所述方式来检测光强度，其中光强度检测敏感度皆设定为1。
C.结果
表2显示要作为分析样品用的对照标准品的二恶英(2，3，7，8-TCDD)浓度与数量的关系表。因此，在估算该飞灰样品溶液与该二标准样品S1与S2所含有的二恶英类化合物的含量时，即依照各样品所测得的光强度来与标准品的光强度比对，并依照表2中所示的二恶英浓度与数量的关系表来换算出飞灰样品溶液与该二标准样品S1与S2所含有的二恶英数量。
表2.二恶英浓度与数量的关系表
图10与图11分别显示依据本发明的小鼠肝癌转化细胞株Hepa1c1c7-M4P2与Hepa1c1c7-MP在以不同浓度(0.1pM、1pM、10pM、50pM、100pM、1nM以及10nM)的二恶英(2，3，7，8-TCDD)以及该飞灰样品溶液与该二标准样品S1与S2予以处理15小时之后所测得的光强度结果。
如图10所示，当以小鼠肝癌转化细胞株Hepa1c1c7-M4P2来作二恶英含量检测时，二恶英浓度和光强度呈现一明显的正向关系。依据图10所示，被稀释40倍的标准样品S1的光强度为6980，而依据表2中所示的二恶英浓度标准来推算，可知标准样品S1的二恶英质量应落在3.22～16.1pg-2，3，7，8-TCDD之间。至于被稀释40倍的标准样品S2，其光强度为13184，因此推算其所含二恶英质量应落在32.2～322pg-2，3，7，8-TCDD之间。稀释40倍的飞灰样品29的荧光读值为4718，其所含二恶英数量应落在0.322～3.22pg-2，3，7，8-TCDD之间。
由于图10显示二恶英浓度和光强度呈现一明显的正向关系，当以二恶英质量作为横轴以及所测得的光强度作为纵轴时，可以得到一线性关系图，而标准样品S1与S2与飞灰样品29所含二恶英数量可根据该线性关系图而被更精确地估算出，于是得到下面结果标准样品S17.44pg-2，3，7，8-TCDD；标准样品S2104.83pg-2，3，7，8-TCDD；以及飞灰样品292.15pg-2，3，7，8-TCDD。
之后，将上述所得数值分别乘以40，则标准样品S1所含二恶英数量297.65pg-2，3，7，8-TCDD，标准样品S2所含二恶英数量为4193.35pg-2，3，7，8-TCDD，而该飞灰样品29所含二恶英数量为85.89pg-2，3，7，8-TCDD。
同样地，图11显示以小鼠肝癌转化细胞株Hepa1c1c7-MP来作二恶英含量检测时，二恶英浓度和光强度也呈现一明显的正向关系。被稀释40倍的该二标准样品S1与S2以及该飞灰样品29所所测得的光强度分别为18650、33998与20523，依据表2的二恶英浓度与数量的关系表来推算，该二标准样品S1与S2以及该飞灰样品29所含二恶英质量应分别落在3.22～16.1pg-2，3，7，8-TCDD、16.1～32.2pg-2，3，7，8-TCDD以及3.22～16.1pg-2，3，7，8-TCDD的范围内。
由于图11显示二恶英浓度和光强度呈现一明显的正向关系，当以二恶英质量作为横轴以及所测得的光强度作为纵轴时，可以得到一线性关系图，而标准样品S1与S2与飞灰样品29所含二恶英数量可根据该线性关系图而被更精确地估算出，于是得到下面结果标准样品S14.81pg-2，3，7，8-TCDD；标准样品S217.65pg-2，3，7，8-TCDD；以及飞灰样品296.24pg-2，3，7，8-TCDD。
之后，将上述所得数值分别乘以40，则标准样品S1所含二恶英数量192.36pg-2，3，7，8-TCDD，标准样品S2所含二恶英数量为705.97pg-2，3，7，8-TCDD，而该飞灰样品29所含二恶英数量为249.536pg-2，3，7，8-TCDD。
总结，当以小鼠肝癌转化细胞株Hepa1c1c7-M4P2来作检测时，对照作为标准品的二恶英(2，3，7，8-TCDD)的检测结果，化学分析浓度被定义为0.1ng-TEQ的标准样品S1的生物检测结果相当于297.65pg-2，3，7，8-TCDD，而化学分析浓度被定义为0.5ng-TEQ的标准样品S2的生物检测结果则相当于4193.35pg-2，3，7，8-TCDD。而当以小鼠肝癌转化细胞株Hepa1c1c7-MP来作检测时，化学分析浓度被定义为0.1ng-TEQ的标准样品S1的生物检验结果相当于192.363pg-2，3，7，8-TCDD，而化学分析浓度被定义为0.5ng-TEQ的标准样品S2的生物检验结果则是705.97pg-2，3，7，8-TCDD。
由上面的数值来看，生物检测结果都会比化学分析结果为高，就小鼠肝癌转化细胞株Hepa1c1c7-M4P2而言，0.1ng-TEQ的标准样品S1的生物检测浓度与化学分析浓度的比值是3.0，而0.5ng-TEQ的标准样品S2的比值则为8.4。我们推测，这可能是化学分析时二恶英含量在接下的纯化步骤中会有所损耗，而导致TEQ值偏低。另外，也有可能是由于生物检测方法对于各种二恶英化合物的TEF值与传统的TEF值不同。因此，接下来可以使用小鼠肝癌转化细胞株Hepa1c1c7-M4P2来分别针对17种不同的二恶英化合物进行荧光素酶活性分析，以建立出一套完整的用于检测二恶英类化合物的生物分析检测系统(bioassay detection system)。
而就小鼠肝癌转化细胞株Hepa1c1c7-MP而言，0.1ng-TEQ的标准样品S1的生物检测浓度与化学分析浓度的比值是1.9，而0.5ng-TEQ的标准样品S2的比值是1.4。因此，小鼠肝癌转化细胞株Hepa1c1c7-MP看来要比小鼠肝癌转化细胞株Hepa1c1c7-M4P2具有更佳的检测精准度。
另一方面，当飞灰样品29分别以小鼠肝癌转化细胞株Hepa1c1c7-M4P2与Hepa1c1c7-MP来作检验时，所得到的生物检测结果分别相当于85.89pg-2，3，7，8-TCDD与249.536pg-2，3，7，8-TCDD。而该飞灰样品当以传统化学质谱仪来作分析时所得到的结果为76pg-TEQ。若将飞灰样品29所得到的生物检测结果与化学分析结果作一比较，使用小鼠肝癌转化细胞株Hepa1c1c7-M4P2与Hepa1c1c7-MP所产生的比值分别是1.1与3.3。由此看来，生物检测数值会大于化学分析值，而这极有可能是因为生物检测方法的TEF值与传统的TEF值不同，而有需要另外定义出一套适用于生物分析检测的TEF值系统。此外，化学分析步骤中所损耗的二恶英量也会导致测量结果TEQ值偏低。
基于小鼠肝癌转化细胞株Hepa1c1c7-MP的检测精准度似乎较小鼠肝癌转化细胞株Hepa1c1c7-M4P2为优，下面的实施例使用小鼠肝癌转化细胞株Hepa1c1c7-MP来分析取自于自然环境中的生物样品。
实施例5.检测鱼肉样品的二恶英含量取3g鱼肉，依照上述“含脂样品的前处理”中所述所述的步骤来进行前处理，其中在油含量百分比的测定步骤中得到1.97g的油脂，因此推算出3g鱼肉的油含量百分比为65.7％。该1.97g的油脂接而被进行“含脂样品的前处理”中所述的酸洗步骤、使用酸性硅胶管柱的净化步骤以及“环境样品的前处理”中所述的使用多层硅胶管柱的净化步骤而得到一洗脱物，并以氮气吹扫将所收集的洗脱物吹至近干，最后予以回溶于644μl的DMSO内，而得到一鱼肉样品溶液。
依照实施例3中所述的方式，取出3.22μl的该鱼肉样品溶液来处理细胞，并检测被处理的细胞所产生的光强度变化。依照实施例4中所述的实验方式以及表2中所显示的二恶英(2，3，7，8-TCDD)浓度与数量的关系表，该鱼肉样品溶液被估算出具有一二恶英浓度为7.5pM。而再经换算后，该鱼肉样品溶液被估算为具有0.96pg-2，3，7，8-TCDD。
由上述结果可得到鱼肉样品内的二恶英含量为0.32pg/g-鱼肉(或者为0.49pg/g-油脂)。
此外，由于检测是利用2，3，7，8-TCDD作为标准品，而2，3，7，8-TCDD的毒性当量值(TEQ)被设定为1.00，该鱼肉样品的二恶英含量也可被表示为0.32pg-TEQ/g-鱼肉(或为0.49pg-TEQ/g-油脂)。
实施例6.检测鱼饲料样品的二恶英含量参照实施例5所述相同方式，取100g鱼饲料来进行二恶英含量的检测，其中100g鱼饲料被测得含有7.84g油脂，因此，该鱼饲料样品的油含量百分比为7.84％。之后，取1g的油脂来进行“含脂样品的前处理”中所述的酸洗步骤、使用酸性硅胶管柱的净化步骤以及“环境样品的前处理”中所述的使用多层硅胶管柱的净化步骤而得到一洗脱物，并以氮气吹扫将所收集的洗脱物吹至近干，最后予以回溶于644μl的DMSO内，而得到一鱼饲料样品溶液。
依照实施例3中所述的方式，取出3.22μl的该鱼饲料样品溶液来处理细胞，并检测被处理的细胞所产生的光强度变化。依照实施例4中所述的实验方式以及表2中所显示的二恶英(2，3，7，8-TCDD)浓度与数量的关系表，该鱼饲料样品溶液被估算出具有一二恶英浓度为25 pM。而再经换算后，该鱼饲料样品溶液被估算为具有一二恶英含量为3.22pg-2，3，7，8-TCDD。
由上述结果可得到100g鱼饲料内的二恶英含量为0.25pg/g-鱼饲料(或者为3.22pg/g-油脂)。
此外，由于检测是利用2，3，7，8-TCDD作为标准品，而2，3，7，8-TCDD的毒性当量值(TEQ)被设定为1.00，该鱼饲料样品的二恶英含量也可被表示为0.25pg-TEQ/g-鱼饲料(或为3.22pg-TEQ/g-油脂)。
于本说明书中被引述的所有文献数据与专利案以其整体被并入本案作为参考数据。若有所冲突时，本案的详细说明(包含界定在内)将占上风。
虽然本发明已参考上述特定的具体例被描述，明显地在不背离本发明的范围和精神的下可作出很多的修改和变化。因此意欲的是，本发明仅受如随文检附的权利要求书中所示者的限制。
序列表<110>正修科技大学<120>一种依据荧光素酶基因的表现来检测二恶英类化合物的重组细胞株<130>PE-26749<160>6<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>20<212>DNA<213>人工<220>
<223>用于小家鼠(Mus musculus)CYP1A1基因合成的正向引物1<400>1cagagagcac ctgcaaaaca20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工<220>
<223>用于小家鼠(Mus musculus)CYP1A1基因合成的反向引物1<400>2ggctacaaag ggtgatgctt20<210>3<211>27<212>DNA<213>人工<220>
<223>用于小家鼠(Mus musculus)CYP1A1基因合成的正向引物2<400>3ctcgaggagg gcaggtgaag gtgttag 27<210>4<211>27<212>DNA<213>人工<220>
<223>用于小家鼠(Mus musculus)CYP1A1基因合成的反向引物2<400>4aagcttaagt gaagagtgtt ctctagg 27<210>5<211>479<212>DNA<213>人工<220>
<223>正向引物1与反向引物1扩增的PCR产物<400>5cagagagcac ctgcaaaaca gccagctagg cgtgccgggt ggtgctgcgt gtcctgccac 60taaaaatgtg gacacacgct gttcaggcct ttgctctcag gcagaagccg agcatcgcac 120gcaaacccgg ccctttgcac cgctggcgct gtcttgtcgc gcccttgcaa agcatagact 180atttctatct cttaaacccc accccaacgc cccaggagag ctggcccttt aagagcctca 240cccacggttc ccctccccca gctagcgtga cagcactggg acccgcgccc ggttgtgagt 300tgggtagctg ggtggctgcg cgggcctcca ggctcttctc acgcaactcc ggggcacctt 360gtccccagcc aggtggggcg gagacaggca gcccgacctc tgcccccaga ggatggagca 420ggcttacgca cgctagcctc aggaacctgt gtgcgtgcca agcatcaccc tttgtagcc 479<210>6
<211>1503<212>DNA<213>人工<220>
<223>正向引物2与反向引物2扩增的PCR产物<400>6ctcgaggagg gcaggtgaag gtgttagtta ggaacaggtt gagttagaca cgccaagttc60agatgttctt cttacactaa tctcactctg ggagcaccct tcagggccag agagcacctg120caaaacagcc agctaggcgt gccgggtggt gctgcgtgtc ctgccactaa aaatgtggac180acacgctgtt caggcctttg ctctcaggca gaagccgagc atcgcacgca aacccggccc240tttgcaccgc tggcgctgtc ttgtcgcgcc cttgcaaagc atagactatt tctatctctt300aaaccccacc ccaacgcccc aggagagctg gccctttaag agcctcaccc acggttcccc360tcccccagct agcgtgacag cactgggacc cgcgcccggt tgtgagttgg gtagctgggt420ggctgcgcgg gcctccaggc tcttctcacg caactccggg gcaccttgtc cccagccagg480tggggcggag acaggcagcc cgacctctgc ccccagagga tggagcaggc ttacgcacgc540tagcctcagg aacctgtgtg cgtgccaagc atcacccttt gtagccccag accccctcct600gctgtctcgc gtggatcctt cctccaccct ttcctccacc atacttagat agctctgcac660ccgccgcccg acttctctgt gttgcctgct tcagtatgta tgcacaacac tagcaagccc720cgggagccta cagggagctg caagcgggga ctcccgggct tgcagcttgc ctaaggtgac780ccttagaggt gagatctgca agcctgccat ccatccccac cctctagatg aagcagcgcg840aacttcggcc gatacccaat ttgtggggca cagagtcagt ccaatggcgc cactggcctt900cctgtcctgt gacctctggg ctggggtcgt tgcgcttctc acgcgagctt ggactcagta960atccagggaa gcaaagtcac cacccagctg ttctccctct accagccttt cccgggcacc1020cattggcttg tagtaggcaa gaggatctta cacactgaat gtttcagggg tgcaaaaata1080gtgaaaagga atccctatga cccggaatgg aggccccagt acttactttt taggttaccc1140cagaattttt cctcaaaccc ctccctcagt gggattatgc actgtccatg gagcaccttg1200aaagtgtggg gggtggtgac cccaaccttt attctttttc ttttcttatg tttttttgtg1260
cctgtaccta catcaggtat ccggtatggc ttcttgccta tctcccccct cccccctgcc1320tagagcactc cctaaggctg tccctccctc ggtcccacca ctgggctcag ataaggaggc1380gtggccaaca gacacagagt cctataaagg tggtggtgcc ttcaccctaa ccctgaaggt1440ggtagttctt ggagcttccc cgatcctccc tagggtccta gagaacactc ttcacttaag1500ctt 150权利要求
1.一种用于克隆对于二恶英具反应性的DNA片段的引物对，其特征在于该引物包括一正向引物与一反向引物，该正向引物具有一如序列辨识编号1或序列辨识编号3所示的核苷酸序列，而该反向引物具有一如序列辨识编号2或序列辨识编号4所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1的引物对，其特征在于该正向引物具有一如序列辨识编号1所示的核苷酸序列，而该反向引物具有一如序列辨识编号2所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1的引物对，其特征在于该正向引物具有一如序列辨识编号3所示的核苷酸序列，而该反向引物具有一如序列辨识编号4所示的核苷酸序列。
4.一DNA片段，其具有一核苷酸序列，其特征在于该核苷酸序列是下列之一(1)实质上对应于一通过使用CYP1A1基因序列作为模板以及使用根据权利要求1的引物对来进行PCR反应而被扩增出的DNA片段所具有的核苷酸序列；(2)实质上对应于一如序列辨识编号5所示的核苷酸序列；(3)实质上对应于一如序列辨识编号6所示的核苷酸序列；(4)实质上对应于一与(1)项中所述的DNA片段的核苷酸序列或(2)或(3)项中所述的核苷酸序列相互补的核苷酸序列。
5.根据权利要求4的DNA片段，其特征在于该DNA片段具有一核苷酸序列是实质上对应于一如序列辨识编号5所示的核苷酸序列。
6.根据权利要求4的DNA片段，其特征在于该DNA片段具有一核苷酸序列是实质上对应于一如序列辨识编号6所示的核苷酸序列。
7.一种重组载体，其特征在于该重组载体具有一报告基因，以及一如权利要求4的DNA片段位于该报告基因的上游处。
8.根据权利要求7的重组载体，其特征在于该报告基因是荧光素酶基因。
9.根据权利要求7的重组载体，其特征在于该DNA片段具有一核苷酸序列是实质上对应于一如序列辨识编号5所示的核苷酸序列。
10.根据权利要求9的重组载体，其特征在于该重组载体是重组载体M4P2。
11.根据权利要求7的重组载体，其特征在于该DNA片段具有一核苷酸序列是实质上对应于一如序列辨识编号6所示的核苷酸序列。
12.根据权利要求11的重组载体，其特征在于该重组载体是重组载体MP。
13.一种重组细胞株，其特征在于该重组细胞株是通过以一如权利要求7至12项中任一项的重组载体来转染一宿主细胞而被形成的。
14.根据权利要求13的重组细胞株，其特征在于该被用来转染的宿主细胞是小鼠肝癌细胞Hepa-1C1C7。
15.根据权利要求14的重组细胞株，其特征在于该重组细胞株是以寄存编号PTA-6089被寄存于美国典型培养物保藏中心的小鼠肝癌转化细胞株Hepa1C1C7-MP或其次培养后代。
16.根据权利要求14的重组细胞株，其特征在于该重组细胞株是以寄存编号PTA-6090寄存于美国典型培养物保藏中心的小鼠肝癌转化细胞株Hepa1c1c7-M4P2或其次培养后代。
17.一种用于检测一环境样品中的二恶英类化合物的生物分析，其特征在于该生物分析是利用一如权利要求13至16项中任一项的重组细胞株来接触一含有二恶英类化合物的样品，而致使位在该重组细胞株内的该重组载体所具有的报告基因被表现，由此被生成的基因产物会产生一可检测的现象，而该可检测的现象被作为定性与定量二恶英类化合物的存在的指标。
18.根据权利要求17的生物分析，其特征在于该重组载体上所具有的报告基因是荧光素酶基因，而该可检测的现象是由荧光素酶与荧光素反应后所产生的光强度。
19.根据权利要求17的生物分析，其特征在于该重组细胞株是以PTA-6089被寄存于美国典型培养物保藏中心的小鼠肝癌转化细胞株Hepa1c1c7-MP或其次培养后代。
20.根据权利要求17的生物分析，其特征在于该重组细胞株是以寄存编号PTA-6090寄存于美国典型培养物保藏中心的小鼠肝癌转化细胞株Hepa1c1c7-M4P2或其次培养后代。
全文摘要
本发明涉及带有一外源性荧光酶基因的重组细胞株，特别是经转染的小鼠肝癌细胞株Hepalclc7－M4P2与Hepalclc7－MP，其中该发光酶基因的上游处坐落有一当中含有可能为二恶英反应片段所特有的核苷酸序列“cacgc”与“gcgtg”的DNA片段，该DNA片段是依据小家鼠(Mus musculus)CYP1 A1基因的启动子区域以及结构基因的部分前端序列而被设计出。于是，该重组细胞株及其次培养后代可供应用于通过生物分析法来检测存在于一从自然环境(例如土壤，水源，供食用的肉类、鱼类、蔬果等等，工厂或焚化炉的烟道、底灰、底泥等等)所收集到的样品内的二恶英类化合物。
文档编号C12Q1/00GK1749403SQ20041007441
公开日2006年3月22日 申请日期2004年9月15日 优先权日2004年9月15日
发明者李伟山, 李心予, 张简国平, 黄怡玮, 卢冠妤 申请人:正修科技大学