专利名称：高表达量的脂肪酶基因及其分泌表达载体和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种高表达量的脂肪酶基因及其分泌表达载体和应用，属于遗传工程 领域。
背景技术：
脂肪酶(LipaseΕ. C. 3. 1. 1.3)是一类特殊的酯酶，全称 Triacylglycerol acylhydrolase，水解三酰甘油酯为脂肪酸、二酸甘油酯、单酸甘油酯及甘油，其天然底物一 般是不溶于水的长链脂肪酸酰基酯，特点是在油水界面起催化作用。全球脂肪酶市场高达 20亿美元，是继蛋白酶和淀粉酶之后的第三大类酶制剂。微生物是脂肪酶的一个重要来源， 具有比动植物脂肪酶更广的作用PH、作用温度，并适合于工业化大生产。其中大部分的根 霉脂肪酶都具有良好的1，3位置专一性，目前已有30多种根霉脂肪酶被开发成商品化酶制 剂，在油脂工业中广泛应用。米根霉脂肪酶具有良好的1，3位置专一性，可应用于油脂工业中，用于改良油脂 品质。国内外对米根霉脂肪酶的研究也比较透彻，其全基因序列已经在NCBI上公布。该 酶包括沈个氨基酸信号序列(presequsece)、97个氨基酸前导肽序列(prosequsence)和 269 个氨基酸成熟肽序列(mROL)所组成。Takahashi (S. Takahashi，2001，Function of prosequence for in vivo folding and secretion of active Rhizopus oryzae lipase in Saccharomyces cerevisiae, App 1 Microbiol Biotechnol, 55:454-462)等石if究了前序 列上相关区域的作用，表明前序列上的20号到57号残基对米根霉脂肪酶的分泌和折叠起 着十分重要的作用酶的分泌必需有前序列的20号到37号残基，而经折叠形成活性脂肪酶 必需有38号到57号残基。大肠杆菌、酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母均可成功表达米根霉脂 肪酶。米根霉脂肪酶在大肠杆菌中有很好的表达，但这些脂肪酶只能以无活性的形式表达， 还需要对重组酶进行复性处理才能形成有活性的脂肪酶。毕氏酵母表达系统具有表达量高、生产成本低、产物可以分泌到胞外和易于后续 修饰等优点，利用毕氏酵母表达的蛋白已有上百种。毕氏酵母近年来已成为倍受青睐的 外源蛋白表达系统。Minning (Minning S, Schmidt-Dammert C, Schmid R D. 1998， Functional expression of Rhizopus oryzae lipase in Pichia Pastoris:high~leYe1 production and some properties, Journal of Biotechnology, 66 (2-3) : 147-156. )
毕赤酵母中表达米根霉脂肪酶成熟肽(ROL)基因，以三油酸甘油酯为底物测得诱导48 h时 的发酵上清液酶活为110 U/mL，5 L发酵罐发酵后重组酶活达到原来的5倍。本研究室从 米根霉中克隆得到米根霉脂肪酶前导肽基因(ProROL，前导肽序列加上成熟肽序列)，构建 pPIC9k-ProR0L质粒，线性化后电转化毕赤酵母菌株GS115，得到阳性克隆摇瓶发酵94h，取 上清/7NPP法测定酶活约为10U/mL。由于毕赤酵母表达系统中，米根霉脂肪酶表达量和酶活 均较低的缺陷，限制了米根霉脂肪酶的商业应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种高表达量的脂肪酶基因，以克服毕赤酵母 菌株米根霉脂肪酶表达量和酶活均较低的缺陷。所用的重组载体pPIC9k-ProRCL为研究室构建，pPIC9k_ProR0L为自己构建。所述脂肪酶DNA序列如以下1)或2)所示；
1)DNA序列为SEQ ID NO 1所示核苷酸序列；
2)在严格条件下(Tm— 10 15°C)与(1)限定的DNA序列杂交且编码具有脂肪酶活 性的蛋白质的DNA分子。含有所述脂肪酶基因的表达载体。所述表达载体为分泌型载体，优选为pPICTk。含有所述脂肪酶基因或表达载体的转基因细胞系。含有所述脂肪酶基因或表达载体的基因工程菌。本发明要解决的另一个技术问题是提供一种应用所述脂肪酶基因生产脂肪酶的 方法。具体步骤如下
(1)合成脂肪酶基因；
(2)构建含有脂肪酶基因的表达载体；
(3)表达载体转化受体菌。所述表达载体为分泌型载体，优选为pPICTk。所述受体菌为大肠杆菌(五co7iBL21)或毕氏酵母。脂肪酶酶活测定方法
脂肪酶水解对硝基苯酚棕榈酸酯0ΝΡΡ)产生对硝基苯酚和棕榈酸，对硝基苯酚在水溶 液中显黄色，在410 nm有最大的光吸收，通过测定对硝基苯酚在410 nm处的光吸收可测得 脂肪酶的活力。酶活的定义为一定反应条件下每分钟产生1 ymol对硝基苯酚的酶量为 一个脂肪酶水解酶活国际单位。本发明克服了米根霉脂肪酶表达水平(酶活)一直较低的缺陷，摇瓶发酵酶活最高 可达123. 4U/mL,比原始重组菌提高了约11倍，7L罐发酵酶活约为7062. 5U/mL,比摇瓶发酵 提高了约56. 2倍。具体实施式
以下通过实施例来进一步阐明本发明，下列实施例用于说明目的而非用于限制本发明 范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，基本上都按照常见的分子克隆手册所述 的条件进行操作。材料和试剂
所用限制性内切酶，T4 DNA连接酶，pMD19-T simple载体，PCR试剂，DNA Marker等 均购于TaKaRa宝生物公司；大肠杆菌感受态细胞DH5 α购自天根生物公司；引物，质粒提 取试剂盒，PCR产物纯化试剂盒均购于上海生工生物工程公司；电转仪购自Bio-Rad公司； YPD、BMGY, BMMY以及YPD-G418均按照hvitrogen公司操作手册配制；其他试剂均为国内 或国外购买的分析纯试剂。实施例1 :pPIC9k-ProR0L载体构建提取米根霉全基因组序列。设计引物进行PCR反应，得到米根霉脂肪酶前导肽和信号 肽基因编码序列(ProROL)。引物序列如下
ROL proFl 5'-GCGGAATTCGTTCCTGTTTCTGGTAAATCTGG-3' ROL proRl 5' -ATAGCGGCCGCTTACAAACAGCTTCCTTCG-3'
扩增序列与PMD19-T simple连接，热激法转化大肠感受态细胞。阳性菌株扩增培养， 同时扩培PPirak大肠菌株。二者提取质粒，用EcoR I和Not I双酶切，目的片段T4 DNA连 接酶连接过夜，转化大肠感受态细胞。挑选阳性菌株提取质粒即可得到重组pPICTk-ProROL 质粒。实施例2 重叠延伸PCR获得高表达量的脂肪酶基因及电转化
培养重组大肠菌株提取质粒PPirak-ProRCL (王乐乐，喻晓蔚，徐岩，华根霉_zoPus chinensis )前导肽脂肪酶基因的克隆及其在PicAia /^astoril5中的表达，高技术通讯， (2009), 19 (10) :105)和pPIC9k_ProR0L，以二者为模板进行PCR反应。引物如下 ROL-Mature F
5' -TCCTGCTACGTCCACTGCCCCCAGCTCTGATGGTGGTAAGG-3' ProROL R: 5 AATTCCAGTGCGGCCGCTTACAAACAGCTTCCTTCG -3， ProRCL F: 5 TCAAGATCCCTAGGGTTCCTGTTGGTCATAAAGGTTC -3’ RCL-PRO R 5 GCTGGGGGCAGTGGACGTAGCAGGAATAGG-3’
以pPICTk-ProRCL质粒为模板，以RCL-PRO R和ProRCL F为引物PCR得到华根霉脂肪 酶前导肽序列RCL-Pro ；以pPIC9k-ProR0L为模板，以ROL-Mature F和ProROL R为引物， PCR得到米根霉脂肪酶的成熟肽序列mROL ；再以RCL-Pro和mROL为模板不加引物进行PCR 反应，重叠延伸5个循环，然后再加入ftx)RCL F和ftx)R0L R引物循环25次得到高表达量的 脂肪酶基因ftx)AR0L序列，序列如SEQ ID No. 1所示。所述高表达量的脂肪酶基因ftx)AR0L 序列或者为第310位核苷酸a突变为t、第478位核苷酸t突变为C、第479位核苷酸a突 变为c、第480位核苷酸c突变为a的核苷酸序列，如SEQ ID No. 2所示。将ftx)AR0L序列与pMD19_T simple (Takara, D104C)载体相连接，热激法转化大 肠杆菌感受态细胞，同时培养含有PPIC-Qk载体的重组大肠杆菌菌种。二者提取质粒分别 用Avr II和Not I双酶切，胶回收目的产物，T4 DNA连接酶连接过夜后转化大肠杆菌感受 态细胞。阳性菌株扩培后提取质粒，用Ml I单酶切为线性，总量为5-10 μ g进行电转。电 转仪设置为电压1500 V，电容25 PF，电阻200 Ω。实施例3 重组子筛选及分子验证
电转后加入ImL山梨醇溶液，30°C复苏Ih后涂布G418浓度为0. 25mg/mL的YPD平板， 长出的单菌落接种YPD液体培养基扩培后提取基因组。以基因组为模板，以ftx)RCL F和 ProROL R为引物进行PCR反应，得到1092bp条带的即确定为阳性菌株。实施例4 阳性菌株H102摇瓶发酵
参考hvitrogen公司操作手册，挑取阳性菌株单菌落接种至25mL BMGY培养基中， 280C，220rpm摇床培养至OD6tltl为2_6时转接至IOOmL BMMY培养基中，相同条件培养，每 24h添加ImL甲醇诱导，每隔一定时间取样测酶活，诱导94h后酶活达到最高，达到123. 4U/ml。实施例5 阳性菌株H102 7L罐发酵
将重组菌H102接种于BMGY培养基中培养12-16 h，然后接种于7升发酵罐中，经过甘油生长相、甘油流加相和甲醇诱导相，甲醇诱导表达84 h之后测定脂肪酶酶活力。最高酶 活达到7062. 5U/ml，是摇瓶发酵的56. 2倍。
序列表 <110>江南大学
<120>高表达量的脂肪酶基因及其分泌表达载体和应用 <160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1092
<212> DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>根据基因序列设计，用于高效表达。
<400> 1
gttcctgttgctggtcataaaggttcagtcaaggcaactaatggcactgacttccaactc60cctcctctcatctctagccgttgtactcctccttcccatcctgaaaccacaggtgatccc120gatgccgaagcttactatattaacaagagcgttcaatggtaccaagctcacggtggcaac180tacactgctcttatcaagcgtgatactgaaaccgtcggtggtatgaccttggatttgccc240gagaaccctcctcctattcctgccacgtccactgctcccagctctgatggtggtaaggtt300gttgctgctactactgctcaaattcaagagttcaccaagtatgctggtatcgctgccact360gcctactgtcgttctgttgtccctggtaacaagtgggactgtgtccaatgtcaaaagtgg420gttcctgatggcaagatcatcactacctttacctccttgctttccgacacaaatggtcca480gtcttgagaagtgataaacaaaagaccatttatcttgttttccgtggtaccaactccttc540agaagtgccatcactgatattgtcttcaacttttccgactacaagcctgtcaagggcgcc600aaggttcatgctggtttcctttcctcttatgagcaagttgtcaatgactatttccctgtc660gtccaagaacaactgaccgccaaccctacttacaaggtcatcgtcaccggtcactcactc720ggtggtgcacaagctttgcttgccggtatggatctctaccaacgtgaaccaagactgtct780cccaagaatttgagcatcttcactgttggtggtcctcgtgttggtaaccccacctttgct840tactatgttgaatctaccggtattcctttccaacgtaccgttcacaagagagatatcgtt900cctcacgttcctcctcaatccttcggattccttcatcccggtgttgaatcttggattaag960tctggtacctccaacgttcaaatctgtacttctgaaattgaaaccaaggattgcagtaac1020tctatcgttcctttcacctctctccttgatcacttgagttactttgatatcaacgaagga1080agctgtttgtaa1092
<210> 2 <211> 1092 <212> DNA <213>人工合成序列<220>
<223>根据基因序列设计，用于高效表达。
<400> 2
gttcctgttgctggtcataaaggttcagtcaaggcaactaatggcactgacttccaactc60cctcctctcatctctagccgttgtactcctccttcccatcctgaaaccacaggtgatccc120gatgccgaagcttactatattaacaagagcgttcaatggtaccaagctcacggtggcaac180tacactgctcttatcaagcgtgatactgaaaccgtcggtggtatgaccttggatttgccc240gagaaccctcctcctattcctgccacgtccactgctcccagctctgatggtggtaaggtt300gttgctgcttctactgctcaaattcaagagttcaccaagtatgctggtatcgctgccact360gcctactgtcgttctgttgtccctggtaacaagtgggactgtgtccaatgtcaaaagtgg420gttcctgatggcaagatcatcactacctttacctccttgctttccgacacaaatggtcca480gtcttgagaagtgataaacaaaagaccatttatcttgttttccgtggtaccaactccttc540agaagtgccatcactgatattgtcttcaacttttccgactacaagcctgtcaagggcgcc600aaggttcatgctggtttcctttcctcttatgagcaagttgtcaatgactatttccctgtc660gtccaagaacaactgaccgccaaccctacttacaaggtcatcgtcaccggtcactcactc720ggtggtgcacaagctttgcttgccggtatggatctctaccaacgtgaaccaagactgtct780cccaagaatttgagcatcttcactgttggtggtcctcgtgttggtaaccccacctttgct840tactatgttgaatctaccggtattcctttccaacgtaccgttcacaagagagatatcgtt900cctcacgttcctcctcaatccttcggattccttcatcccggtgttgaatcttggattaag960tctggtacctccaacgttcaaatctgtacttctgaaattgaaaccaaggattgcagtaac1020tctatcgttcctttcacctctctccttgatcacttgagttactttgatatcaacgaagga1080agctgtttgtaa1092
<210> 3 <211> 41 <212> DNA
<213>人工合成序列 <220>
<223>根据基因序列设计，用于基因扩增。 <400> 3
tcctgctacg tccactgccc ccagctctga tggtggtaag g41
<210> 4 <211> 36 <212> DNA
<213>人工合成序列 <220>
<223>根据基因序列设计，用于基因扩增。<400> 权利要求
1.一种高表达量的脂肪酶基因，其DNA序列如以下1)或2)所示1)DNA序列为SEQ ID NO 1所示核苷酸序列；2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码具有脂肪酶活性的蛋白质的DNA分
2.含有权利要求1所述脂肪酶基因的表达载体。
3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为分泌型载体。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于优选为pPIC9k。
5.含有权利要求1所述脂肪酶基因的转基因细胞系。
6.含有权利要求2所述表达载体的转基因细胞系。
7.含有权利要求1所述脂肪酶基因的基因工程菌。
8.含有权利要求2所述表达载体的基因工程菌。
9.权利要求1所述脂肪酶基因在酶制剂生产中的应用。
10.权利要求2所述表达载体在酶制剂生产中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种高表达量的脂肪酶基因及其分泌表达载体，属于遗传工程领域。所述脂肪酶基因DNA序列为SEQIDNO.1或在严格条件下与SEQIDNO.1限定的DNA序列杂交且编码具有脂肪酶活性的蛋白质的DNA分子。本发明还公开了一种应用所述脂肪酶基因生产脂肪酶的方法，构建的工程菌克服了该酶表达量及酶活一直不高的缺陷，摇瓶发酵酶活最高可达123.4U/mL，比出发重组菌提高了约11倍，7L罐发酵甲醇诱导84h酶活约为7062.5U/mL，比摇瓶发酵提高了约56.2倍，具有广阔的应用前景。
文档编号C12N15/55GK102080092SQ20101057862
公开日2011年6月1日 申请日期2010年12月8日 优先权日2010年12月8日
发明者喻晓蔚, 徐岩, 郭勇亮 申请人:江南大学