专利名称：一种产α-酮戊二酸酵母工程菌及其构建方法
技术领域：
本发明涉及一种a-酮戊二酸酵母工程菌及其构建方法，尤其是一种通过过量表 达ATP-柠檬酸裂解酶基因以生产a_酮戊二酸的工程菌，属于遗传工程领域。
背景技术：
a-酮戊二酸(a-ketoglutarate，a-KG)，又称a_胶酮酸，2_氧代戊二酸或a_羰基 戊二酸。分子式为C5H6O5,相对分子量为146. 1，a-KG为白色或类白色的结晶或结晶性粉 末，无色，易溶于水。a-KG在微生物细胞的代谢中起着重要的作用，是三羧酸循环(TCA)的 重要中间产物之一，在生物体内参与氨基酸、蛋白质、维生素的合成以及能量代谢。a-KG在 食品、医药、有机合成、化妆品和饲料等工业中都有着广泛应用。辅因子工程所涉及到的辅因子主要有ATP/ADP/AMP、NADH/NAD+、NADPH/NADP+、辅 酶A及其衍生物、维生素和微量元素。目前研究主要集中在调节ATP/ADP/AMP、NADH/NAD+、 NADPH/NADP+和辅酶A及其衍生物等辅因子在细胞内的形式和含量对代谢途径及代谢流量 的影响。然而，对辅酶A如何影响工业微生物中碳代谢和碳代谢流流向分布的研究则鲜有 报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种产a_酮戊二酸酵母工程菌。所述工程菌过量表达ATP-柠檬酸裂解酶基因。所述ATP-柠檬酸裂解酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。所述ATP-柠檬酸裂解酶基因克隆于载体PINA1269。本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种产a_酮戊二酸酵母工程菌的构建 方法。为解决上述技术问题，本发明的具体方案为
1)根据小鼠ATP-柠檬酸裂解酶基因序列设计引物克隆χα基因；
2)利用h-FusionPCR技术将^a基因与载体连接得到重组表达载体；
3)将得到的重组表达载体转化解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)后得到酵母工程菌。以下是本发明技术方案的详细描述。目的基因χα扩增与表达质粒的构建
以带有χα基因的质粒为模板，PCR扩增得到χα目的片段(大小约为3500bP)。利用 In-Fusion PCR技术将Ja基因与经Rnl I和BamH I酶切后的质粒pINA1269连接，得到 Ja基因表达载体PINA1269-ACL。构建好的重组质粒经酶切分析，并进行DNA测序。基因 测序结果与预期一致，表明重组质粒构建正确。解脂耶氏酵母^ferroria lipolytica) WSH-Z06 Δ 菌株的构建
本发明的出发菌株ferroria lipolytica WSH-Z06是由本实验的周海岩等人在2007年筛选出来的，现保藏与中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC N0:M20714，专 利号为 CN 101215529Ao根据NCBI网站上Z Iipolytica的LEU2基因序列，设计两对引物(Li，L2和 Rl, R2)分别扩增^万似基因上下游约IOOObp的片段。另外，以pUG66质粒为模板，PCR扩增 两端带有序列的基因片段(大小约为1000 bp)，利用三个片段之间的同源序列进 行融合PCR后与pMD18-T simple vector (Takara)连接，得到重组质粒。重组质粒转化大 肠杆菌JM109，挑取能在平板上生长的菌落以Ll和R2为引物进行菌落PCR鉴定，得到 大约为3000bp大小的条带。菌落PCR验证正确的转化子提取质粒，以质粒上的通用引物进 行测序，测序结果与预期一致，表明融合片段构建正确。质粒经BamH I酶切，胶回收大小约 为3000bp的片段，得到Z^Z/J 基因敲除框，醋酸锂法转化Z Iipolytica WSH-Z06感受态细 胞。将能在kocin平板上生长的菌落，提取全基因组作为模板，Ll和R2为引物PCR扩增得 到约3000bp大小的片段，表明该转化子为亮氨酸营养缺陷型菌株。将质粒PUB4-CRE醋酸 锂法转化亮氨酸营养缺陷型菌株，挑取能在Hyg平板上生长的菌落，分别连续点种与YPD、 YPD+Hyg和YPD+kocin平板上。由于pUB4_CRE质粒表达的CRE能通过Cre-IoxV系统将
基因从酵母基因组上剪除，而pUB4-CRE质粒本身不稳定，在转接若干代后会自动消除。 因此，转接后能在YPD平板上生长，而不能在YPD+Hyg和YPD+kocin平板上生长的菌落即 为不带拟e抗性的亮氨酸营养缺陷型菌株K lipolytica WSH-Z06 Kleu2。过量表达Ja的Z lipolytica酵母工程菌的筛选
将重组质粒PINA1269-ACL经Not I酶切，纯化后，醋酸锂法转化Z lipolytica WSH-Z06 Δh^ 感受态细胞。将能在MM平板上生长的菌落，在MM平板上连续转接三代，得 到遗传稳定的酵母工程子。挑取阳性酵母工程子若干提基因组，利用引物ACL-F和ACL-R进 行PCR验证，得到大约3500bp的片段，表明Ja基因已成功整合到Z lipolytica WSH-Z06 基因组中。所得酵母工程菌命名为Z lipolytica ACL。该菌在以甘油为碳源的培 养基上生长时，ACL酶活为3. 56 U/mg protein，是出发菌株的7. 5倍。微生物菌株的种子培养与发酵
种子培养基(g/L):葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，磷酸二氢钾1 g，七水硫酸镁0.5 g，琼 脂20 g(斜面用)，pH 5. 5，自来水定容至1 L。发酵培养基(g/L)甘油100 g，硫酸铵3 g，磷酸二氢钾3 g，七水硫酸镁1.2 g， 氯化钠0.5 g/L，磷酸氢二钾0.1 g，盐酸硫胺0.2 mg，碳酸钙20 g(摇瓶时添加)，自来水 定容至IL0种子培养基和发酵培养基的灭菌温度为115-121 15 min。维生素等热敏性材 料配制后0. 22 mm膜过滤除菌，接种前加入。将实验菌株接种到种子培养基中，500 ml摇瓶装液50 1111，于观1，200 rpm条件 下培养20-24 h0按10%的接种量将培养好的种子接入发酵培养基，28°C，200 rpm条件下培养144 h。细胞干重的测定10 mL容量瓶中，加2 mL盐酸溶解菌悬液中的碳酸钙，加入去离 子水定容至10 mL，摇勻，用UV 7500型可见分光光度计，于570 nm处比色测OD值，用细胞
干重标准曲线算得细胞干重。
甘油、丙酮酸和a-KG浓度的测定高效液相色谱(HPLC)
仪器=Agilent 1100高效液相色谱仪(配紫外可见检测器、示差折光检测器和工作站)， 色谱条件
色谱柱Aminex HPX-87H ion exchange column 流动相5mM H2SO4 流速:0. 6 mL/min 柱温35 V 进样量5 μ L
紫外检测器波长210 nm (检测丙酮酸和a_KG) 示差折光检测器检测甘油
样品制备500 μ L发酵液在10000 rpm下离心10 min，取上清液移入1. 5 mL离心管 中测甘油、丙酮酸和a-KG的含量。取100 μ L上清液移入5 mL容量瓶中，超纯水定容至 刻度线，经0.45 ym滤膜过滤，滤液供液相色谱分析。本发明通过过量表达ATP-柠檬酸裂解酶基因，改变胞内辅因子之一一乙酰辅酶A 的存在形式和浓度，提供了一种辅因子调控碳代谢流实现酮戊二酸(a-KG)过量积累的 方法。与出发菌株相比本发明提供的基因工程菌能以甘油为唯一碳源，在胞内积累0.89 mM/ g DCff的乙酰辅酶A，ACL活性提高了 7. 5倍(3. 56 U/mg protein)；在发酵144 h后， a_酮戊二酸产量达到45. 3 g/L，是出发菌株的1. 倍；丙酮酸产量降低到17. 2 g/L，是出 发菌株的68. 8%，具有广阔的应用前景。
具体实施例方式实施例1解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica) WSH-Z06 Δ hi/2菌株的构建与 鉴定
根据NCBI网站上Z lipolytica的^万似基因序列(GenBank M27209. 1)，设计两对引 物(Li，L2和Rl，R2，见表1)分别扩增Z^Z/J 基因上下游约IOOObp的片段。另外，以pUG66 质粒为模板，Ble-F和Ble-R为引物(见表1)，PCR扩增两端带有hrf序列的基因片段， 利用三个片段之间的同源序列进行融合PCR后与pMD18-T simple vector连接，得到重组 质粒。重组质粒转化大肠杆菌JM109，挑取能在Amp平板上生长的菌落以Ll和R2为引物进 行菌落PCR鉴定，得到大约为3000bp大小的条带。菌落PCR验证正确的转化子提取质粒，以 质粒上的通用引物进行测序，测序结果与预期一致，表明融合片段构建正确。质粒经BamHI 酶切，胶回收大小约为3000bp的片段，得到Z^Z/J 基因敲除框，醋酸锂法转化Z lipolytica WSH-Z06感受态细胞。将能在Ble平板上生长的菌落，提取全基因组作为模板，Ll和R2为 引物PCR扩增得到约3000bp大小的片段，表明该转化子为亮氨酸营养缺陷型菌株。将质粒 PUB4-CRE醋酸锂法转化亮氨酸营养缺陷型菌株，挑取能在Hyg平板上生长的菌落，分别连 续点种与YPD、YPD+Hyg和YPD+Ble平板上。由于pUB4_CRE质粒表达的CRE能通过CreWozP 系统将基因从酵母基因组上剪除，而PUB4-CRE质粒本身不稳定，在转接若干代后会自 动消除。因此，转接后能在YPD平板上生长，而不能在YPD+Hyg和YPD+Ble平板上生长的菌 落即为不带拟e抗性的亮氨酸营养缺陷型菌株K lipolytica WSH-Z06 Kleu2。其中YPD培养基(g/L)
葡萄糖20 g, Tryptone 20 g, Yeast extract 10 g，固体培养基添加20 g琼脂。Hyg 抗性平板(g/L)
YPD+100mg潮霉素，固体培养基添加20 g琼脂。kocin 抗性平板(g/L)
YPD+100mg博莱霉素，固体培养基添加20 g琼脂。质粒pUB4-CRE由法国农业生物技术中心的Catherine Madzak教授所赠(Fickers et al. , 2003)，质粒 pUG66 本实验保藏(GenBank: AF298794. 1)。Fickers, P. , Le Dall, Μ. T. , Gaillardin, C. , Thonart, P. , and Nicaud, J. Μ. (2003). New disruption cassettes for rapid gene disruption and marker rescue in the yeast Yarrowia lipolytica. J Microbiol Methods 55’ 727—737.
权利要求
1.一种产a-酮戊二酸酵母工程菌，其特征在于所述工程菌过量表达ATP-柠檬酸裂解 酶基因。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于所述ATP-柠檬酸裂解酶基因核苷酸 序列如SEQ ID NO. 1所示。
3.根据权利要求1所述的酵母工程菌，其特征在于所述ATP-柠檬酸裂解酶基因克隆于 载体 PINA1269。
4.权利要求1所述酵母工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤 根据小鼠ATP-柠檬酸裂解酶基因序列设计引物克隆χα基因；利用h-Fusion PCR技术将^a基因与载体连接得到重组表达载体；将得到的重组表达载体转化解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)后得到酵母工程菌。
5.权利要求1所述酵母工程菌应用于酮戊二酸的生产。
全文摘要
本发明公开了一种产a-酮戊二酸酵母工程菌及其构建方法，属于遗传工程领域。本发明采用分子手段，将来源于小鼠中编码ATP-柠檬酸裂解酶ACL基因过量表达于发酵法生产a-酮戊二酸的菌株Yarrowia lipolytica WSH-Z06中，获得了一株ATP-柠檬酸裂解酶活性提高的酵母工程菌Y.lipolytica ACL。与出发菌株相比本发明提供的基因工程菌能以甘油为唯一碳源，在胞内积累0.89mM/g DCW的乙酰辅酶A，ACL活性提高了7.5倍(3.56U/mg protein)；a-酮戊二酸产量达到45.3g/L，是出发菌株的1.29倍；丙酮酸产量降低到17.2g/L，是出发菌株的68.8%，具有广阔的应用前景。
文档编号C12N15/60GK102071154SQ20101057859
公开日2011年5月25日 申请日期2010年12月8日 优先权日2010年12月8日
发明者周景文, 堵国成, 殷晓霞, 陈坚 申请人:江南大学