专利名称：一种用环介导恒温扩增法检测诺维梭菌的方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种用环介导恒温扩增法检测诺维梭菌的 方法，还涉及一种用环介导恒温扩增法检测诺维梭菌的试剂盒。
背景技术：
诺维梭菌，属于芽孢杆菌科厌氧芽孢梭菌属，菌体极长，粗细一致，两端钝圆；多数 情况下单在，有时成双或呈短链，易形成芽孢，位于菌体近端或中央；本菌严格厌氧，有微量 氧气存在即不生长。诺维梭菌能产生极强的外毒素，根据其毒素的差异，可分为A、B、C、D四种不同菌 型，不同菌型引发人和动物的疾病各不相同。A型菌又称第II恶性水肿杆菌或水肿梭菌，存 在于土壤、海洋沉积物、人和动物创伤及粪便，可引起人气性坏疽、动物恶性水肿以及绵羊 的大头病；B型菌曾称巨大杆菌，发现于人和动物的感染部位，此菌平时能以潜伏性芽孢的 形式存在于动物肝、脾等中，当肝组织因寄生虫游走或其他因素造成损伤时，芽孢即趁机发 育繁殖，产生强烈毒素而引起发病。主要引起绵羊的黑疫，也可感染山羊，牛、马；C型菌又 称水牛梭菌，可引起水牛骨髓的渐进性坏死与化脓；D型菌为溶血梭菌，为牛细菌性血红素 尿的病原，绵羊偶有发生。诺维梭菌引发的病害严重制约着畜牧业的发展，每年因感染诺维 梭菌而死亡的牲畜数量呈上升趋势，造成了不可估量的经济损失。此外，由于诺维梭菌具有 极强的传染性和侵染性，病死的牲畜以及地震伤、工伤等极易使病菌侵染人体，引发人气性 坏疽、恶性水肿等严重疾病，威胁着人们的生命安全。诺维梭菌病害发病快，且毫无征兆，对其引发的病害的有效控制关键在于预防。因 此，及早地检测诺维梭菌有助于预防诺维梭菌引起的病害发生。目前，诺维梭菌的鉴定主 要是分泌物直接涂片、动物实验、毒素检测、厌氧培养法和全自动细菌培养鉴定仪鉴定。直 接涂片法快速、经济，但容易与其他菌类混淆，特异性和灵敏性较低，而且对于恶性水肿疾 病无法准确诊断；厌氧培养法为目前诺维梭菌鉴定的金标准，但培养条件高、耗时长(约 18-7 )，往往错过最佳治疗时间，造成严重后果。不但如此，诺维梭菌的部分菌型分离极为 困难，这也使得厌氧培养法受到制约；全自动细菌培养鉴定仪鉴定同样需要对检测样品进 行厌氧培养，由此造成了检测时间长的缺点；动物实验及毒素检测检测时间也相对较长，因 此严重制约了该技术在临床的广泛开展，尤其是制约了在基层医疗单位、床旁检验及现场 紧急检测的应用。随着分子诊断技术的不断进步，一些新的核酸分析技术相继问世，环介导恒温扩 增技术就是其中之一。虽然环介导恒温扩增法具有高特异性、高灵敏度和扩增时间短的优 点，但使用时需自行设计引物，引物设计的准确与否关系到检测的特异性和灵敏度。此外， 环介导恒温扩增法没有配套的DNA快速提取方法，在标本的前处理上仍较繁杂，耗时较长。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用环介导恒温扩增法检测诺维梭菌的方法及其试剂盒，该检测方法及其试剂盒对诺维梭菌特异性高、灵敏度高，检测过程简单快速。本发明提供一种用环介导恒温扩增法检测诺维梭菌的方法，包括利用环介导恒温扩增技术，用如SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的上游内引物、如 SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的下游内引物、如SEQ ID NO :3所示核苷酸序列的上游外引物 和如SEQ ID NO :4所示核苷酸序列的下游外引物扩增样品DNA中的诺维梭菌a毒素基因， 检测扩增结果。环介导恒温扩增技术的基本原理是针对靶基因的4个区域设计2对特异引物(1 对内引物和1对外引物)，在恒温63-67 0C保温40-80min，利用高活性链置换DNA聚合酶 (Bst DNA聚合酶)，使得链置换DNA合成在不停地自我循环，从而产生大量茎环状扩增产 物。该技术的特点是①高特异性针对靶基因的4个区域设计4种特异引物，能同时非特 异性结合4个区域的干扰核酸极少；②恒温、简便在恒温条件下扩增，操作简便；③高灵敏 度在30-40min内可把靶序列扩增至IO9-IOici倍，其最低检测极限在10个拷贝/TEST左右。本发明所述方法依据环介导恒温扩增技术的基本原理，采用诺维梭菌a毒素基因 为靶基因，针对其4个区域设计2对特异引物，即上游内引物、下游内引物、上游外引物和下 游外引物，由于诺维梭菌a毒素基因序列为诺维梭菌四种菌型所共有，所以能够保证从种 的水平上检测不同来源的诺维梭菌菌株的可靠性。诺维梭菌a毒素基因序列来源于美国 NCBI 基因数据库(Clostridium novyi gene for alpha—toxin ;GenBank :Ζ48636· 1)，4 种 特异引物经美国NCBI基因数据库BLAST检索，满足特异性的要求。在本发明所述扩增之前还包括对样品DNA进行快速提取，具体步骤为样品与DNA快速提取液充分混勻，加热至沸腾并维持3min，离心或过滤，所得上清 液或滤液为包含样品DNA的溶液，所述DNA快速提取液包含0. 025-0. 075mol/L的NaOH、 0. 5-1. 5%的Triton X-100和5-15%的A1203。样品DNA利用本发明所述DNA快速提取液， 通过上述提取方法可在5-lOmin完成对诺维梭菌DNA的提取，并且Al2O3作为阳离子吸附剂 能够去除干扰DNA提取的阳离子，确保提取的DNA能满足后续扩增要求。在检测扩增结果方面，可以采用琼脂糖凝胶电泳技术检测目的条带，但琼脂糖凝 胶电泳技术所需时间较长，不利于诺维梭菌的快速检测。故本发明采用散射比浊法，通过检 测仪器检测扩增后溶液的浊度变化来判断。作为更优选地方案，本发明采用显色液与扩增 产物作用发生颜色变化进行检测，所述显色液包含钙黄绿素和MnCl2。样品DNA未扩增时， 钙黄绿素与锰离子结合，显淡褐色(阴性)；随着样品DNA的大量扩增，同时产生焦磷酸根 离子，焦磷酸根离子与锰离子结合，使钙黄绿素游离，显黄绿色(阳性)。这样，无需借助仪 器即可通过肉眼判别检测结果。在提供本发明所述方法的同时，本发明还提供一种用环介导恒温扩增法检测诺维 梭菌的试剂盒，所述试剂盒包括如SEQ ID NO 1所示核苷酸序列的上游内引物、如SEQ ID NO 2所示核苷酸序列 的下游内引物、如SEQ ID NO :3所示核苷酸序列的上游外引物和如SEQ ID NO :4所示核苷 酸序列的下游外引物。其中，上游内引物浓度为4-12 μ mol/L,下游内引物浓度为4-12 μ mol/L,上游外 引物浓度为0. 5-1. 5ymol/L，下游外引物浓度为0. 5-1. 5 μ mol/L。作为优选，上游内引物 浓度为8 μ mol/L,下游内引物浓度为8 μ mol/L,上游外引物浓度为1 μ mol/L,下游外引物浓度为ι μ mol/Lo作为优选方案，所述试剂盒还包括DNA快速提取液，所述DNA快速提取液包含 0. 025-0. 075mol/L 的 Na0H、0. 5-1. 5% 的 Triton X-100 和 5-15% 的 Al2O3,优选地，所述DNA 快速提取液包含0. 05mol/L的NaOH, 1. 0 %的TritonX-IOO和10 %的Al2O3，利用DNA快速 提取液可实现样品DNA的快速提取。作为进一步的优选方案，所述试剂盒还包括恒温扩增液，所述恒温扩增液包含 20mmol/L ρΗ8· 8 的 Tris-HCl、10mmol/L 的 KCl、10mmol/L 的(NH4)2SO4、2mmol/L 的 MgS04、 0.1%的 Triton X-100、40mmol/L 的 dNTP、320U/mL 的 Bst DNA 聚合酶。其中，所述 dNTP 中 dTTP、dATP、dGTP、dCTP 的摩尔浓度比为 1 1 1 1。更优选地方案，所述试剂盒还包含显色液，所述显色液为1. 5-2. 5mmol/L钙黄绿 素和2-4mmol/L MnCl2，优选地，钙黄绿素浓度为2mmol/L，MnCl2浓度为3mmol/L。本发明所 述显色液与扩增诺维梭菌a毒素基因时产生的副产物焦磷酸镁反应，未反应时钙黄绿素与 锰离子结合，溶液呈淡褐色，当焦磷酸根离子与锰离子结合时，使钙黄绿素游离，扩增后溶 液可由淡褐色转变为黄绿色，实现肉眼判别诺维梭菌检测结果。经由上述的技术方案可知，本发明所述用环介导恒温扩增法检测诺维梭菌的方法 及其试剂盒对诺维梭菌特异性高、灵敏度高，不需要特殊仪器，简单快速。
具体实施例方式本发明公开了一种用环介导恒温扩增法检测诺维梭菌的方法及其试剂盒，本领域 技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替 换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述 方法及试剂盒已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精 神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技 术。依照本发明，所述用环介导恒温扩增法检测诺维梭菌的方法包括利用环介导恒温扩增技术，用如SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的上游内引物、如 SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的下游内引物、如SEQ ID NO :3所示核苷酸序列的上游外引物 和如SEQ ID NO :4所示核苷酸序列的下游外引物扩增样品DNA中的诺维梭菌a毒素基因， 检测扩增结果。其中，所述扩增之前还包括对样品DNA进行快速提取，具体步骤为样品与DNA快速提取液充分混勻，加热至沸腾并维持3min，离心或过滤，所得上清 液或滤液为包含样品DNA的溶液，所述DNA快速提取液包含0. 025-0. 075mol/L的NaOH、 0. 5-1. 5%的 Triton X-100 和 5-15%的 A1203。本发明采用散射比浊法，通过检测仪器检测扩增后溶液的浊度变化来判断。作为 更优选地方案，本发明采用显色液与扩增副产物作用发生颜色变化进行检测，所述显色液 包含钙黄绿素和MnCl2。本发明还提供一种用环介导恒温扩增法检测诺维梭菌的试剂盒，所述试剂盒包 括如SEQ ID NO 1所示核苷酸序列的上游内引物、如SEQ ID NO 2所示核苷酸序列的下游内引物、如SEQ ID NO :3所示核苷酸序列的上游外引物和如SEQ ID NO :4所示核苷 酸序列的下游外引物。其中，上游内引物浓度为4-12 μ mol/L,下游内引物浓度为4-12 μ mol/L,上游外 引物浓度为0. 5-1. 5ymol/L，下游外引物浓度为0. 5-1. 5 μ mol/L。作为优选，上游内引物 浓度为8 μ mol/L,下游内引物浓度为8 μ mol/L,上游外引物浓度为1 μ mol/L,下游外引物 浓度为ι μ mol/L。作为优选方案，所述试剂盒还包括DNA快速提取液，所述DNA快速提取液包含 0. 025-0. 075mol/L 的 Na0H、0. 5-1. 5% 的 Triton X-100 和 5-15% 的 Al2O3,优选地，所述DNA 快速提取液包含0. 05mol/L的NaOH, 1. 0 %的TritonX-100和10 %的Al2O3，利用DNA快速 提取液可实现样品DNA的快速提取。作为进一步的优选方案，所述试剂盒还包括恒温扩增液，所述恒温扩增液包含 20mmol/L ρΗ8· 8 的 Tris-HCl、10mmol/L 的 KCl、10mmol/L 的(NH4)2SO4、2mmol/L 的 MgS04、 0. 的 Triton X-100、40mmol/L 的 dNTP、320U/mL 的 Bst DNA 聚合酶。更优选地方案，所述试剂盒还包含显色液，所述显色液为1. 5-2. 5mmol/L钙黄绿 素和2-4mmol/L MnCl2，优选地，钙黄绿素浓度为2mmol/L，MnCl2浓度为3mmol/L。本发明采用诺维梭菌标准菌株进行可行性实验，用散射比浊法检测扩增结果为阳 性，用显色液检测结果为黄绿色，表明本发明所述方法及其试剂盒能够适用于诺维梭菌的 检测。本发明所述方法及其试剂盒特异性实验结果显示，用散射比浊法检测诺维梭菌标 准菌株，结果均呈阳性，而其余干扰菌株均呈阴性；用显色液检测诺维梭菌标准菌株，结果 均呈黄绿色，而其余干扰菌株均呈淡褐色。表明本发明所述试剂盒及其检测方法能够对诺 维梭菌进行特异性扩增，对厌氧培养中常见的干扰菌及普通培养中常见的干扰菌均无扩 增，有较好的特异性。本发明所述方法及其试剂盒灵敏度实验结果显示，诺维梭菌标准菌株最低检测浓 度为lxlOtFU/uL，表明本发明所述试剂盒及其检测方法具有很高的灵敏度。本发明所述方法及其试剂盒符合度实验结果显示，取自患者和病畜的样品通过本 发明所述方法及其试剂盒检测的结果与通过细菌全自动仪检测的结果基本一致，表明了本 发明所述试剂盒及其检测方法具有较高的准确性，可以替代细菌全自动仪进行检测。下面结合实施例，进一步阐述本发明。实施例1 利用本发明所述试剂盒检测诺维梭菌
1、试剂盒本发明所述检测诺维梭菌的试剂盒包括上游内引物具有如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列；下游内引物具有如SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列；上游外引物具有如SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列；下游外引物具有如SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列；2、检测方法向反应管加入包含2 μ L样品DNA的反应液，再加入上游内引物、下游内引物、上游 外引物和下游外引物，4种引物浓度分别为8 μ mol/L、8 μ mol/L、1 μ mol/L和1 μ mol/L,混勻，放置于LA320C检测仪器反应孔上，65°C恒温扩增60min。根据反应管中反应液浊度变 化，检测结果。3、本发明所述方法可行性分析将诺维梭菌标准菌株ATCC19402提取的DNA，采用上述检测方法进行检测，同时设 置阴性对照。诺维梭菌标准菌株购自于上海天呈医流有限公司，阴性对照为生理盐水。检测结果显示，诺维梭菌标准菌株检测结果呈阳性，阴性对照检测结果呈阴性，表 明本发明试剂盒及其检测方法适用于诺维梭菌的检测。实施例2 利用本发明所述试剂盒检测诺维梭菌1、试剂盒本发明所述检测诺维梭菌的试剂盒包括上游内引物具有如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列；下游内引物具有如SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列；上游外引物具有如SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列；下游外引物具有如SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列；DNA 快速提取液0. 025mol/L 的 Na0H、0. 5%的 Triton X-100 禾Π 5%的 Α1203。2、检测方法步骤1 待测样品置于无菌咽拭子中，咽拭子管中加入1. OmL DNA快速提取液，混 勻，弃去棉签，用酒精灯加热咽拭子管至沸腾，维持:3min ；步骤2 离心机4000转/分离心5min，取上清至1. 5mL EP管中，即为待检模板DNA ； 如无离心条件，可用2mL无菌注射器抽取咽拭子管液体，通过0. 2um针头式滤菌器，滤过液 排放至1. 5mL EP管中，即为样品DNA0步骤3 向反应管加入包含2μ L样品DNA的反应液，再加入上游内引物、下游内 引物、上游外引物和下游外引物，4种引物浓度分别为4 μ mol/L、4 μ mol/L、0. 5 μ mol/L和 0. 5 μ mol/L,混勻，放置于LA320C检测仪器反应孔上，65°C恒温扩增60min。根据反应管中 反应液浊度变化，检测结果。3、本发明所述方法可行性分析取诺维梭菌标准菌株ATCC19402培养的单个菌落，采用上述检测方法进行检测， 同时设置阴性对照。诺维梭菌标准菌株购自于上海天呈医流有限公司，阴性对照为生理盐 水。检测结果显示，诺维梭菌标准菌株检测结果呈阳性，阴性对照检测结果呈阴性，表 明本发明试剂盒及其检测方法适用于诺维梭菌的检测。实施例3 利用本发明所述试剂盒检测诺维梭菌
1、试剂盒
本发明所述检测诺维梭菌的试剂盒包括
上游内引物具有如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列；
下游内引物具有如SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列；
上游外引物具有如SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列；
下游外引物具有如SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列；
DNA 快速提取液0. 075mol/L 的 NaOH、l. 5%的 Triton X-100 禾Π 15%的 Al2O
恒温扩增液20mmol/LρΗ8· 8 的 Tris-HCl、10mmol/L 的 KCl、10mmol/L 的 (NH4) 2S04、2mmol/L 的 MgS04、0. 的 Triton X-100、40mmol/L 的 dNTP、320U/mL 的 Bst DNA
聚合酶。2、检测方法步骤1 待测样品置于无菌咽拭子中，咽拭子管中加入l.OmL DNA快速提取液，混 勻，弃去棉签，用酒精灯加热咽拭子管至沸腾，维持:3min ；步骤2 离心机4000转/分离心5min，取上清至1. 5mL EP管中，即为待检模板DNA ； 如无离心条件，可用2mL无菌注射器抽取咽拭子管液体，通过0. 2um针头式滤菌器，滤过液 排放至1. 5mL EP管中，即为样品DNA0步骤3 向反应管加入2 μ L样品DNA、12. 5 μ L恒温扩增液和10. 5 μ L重蒸水，再 加入上游内引物、下游内引物、上游外引物和下游外引物，4种引物浓度分别为12ymol/L、 12 μ mol/L、1· 5 μ mol/L和1· 5 μ mol/L,混勻，放置于LA320C检测仪器反应孔上，65°C恒温 扩增60min。根据反应管中反应液浊度变化，检测结果。3、本发明所述方法可行性分析取诺维梭菌标准菌株ATCC19402培养的单个菌落，采用上述检测方法进行检测， 同时设置阴性对照。诺维梭菌标准菌株购自于上海天呈医流有限公司，阴性对照为生理盐 水。检测结果显示，诺维梭菌标准菌株检测结果呈阳性，阴性对照检测结果呈阴性，表 明本发明试剂盒及其检测方法适用于诺维梭菌的检测。实施例4 利用本发明所述试剂盒检测诺维梭菌1、试剂盒本发明所述检测诺维梭菌的试剂盒包括上游内引物具有如SEQ ID NO=I所示的核苷酸序列；下游内引物具有如SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列；上游外引物具有如SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列；下游外引物具有如SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列；DNA 快速提取液0. 05mol/L 的 NaOH、1 % 的 Triton X-100 禾Π 10% 的 Al2O3 ；恒温扩增液20mmol/LρΗ8· 8 的 Tris-HCl、10mmol/L 的 KCl、10mmol/L 的 (NH4) 2S04、2mmol/L 的 MgS04、0. 的 Triton X-100、40mmol/L 的 dNTP、320U/mL 的 Bst DNA 聚合酶、2mmol/L钙黄绿素和3mmol/L MnCl202、检测方法步骤1 待测样品置于无菌咽拭子中，咽拭子管中加入1.0ml DNA快速提取液，混 勻，弃去棉签，用酒精灯加热咽拭子管至沸腾，维持:3min ；步骤2 离心机4000转/分离心5min，取上清至1. 5mL EP管中，即为待检模板DNA ； 如无离心条件，可用2mL无菌注射器抽取咽拭子管液体，通过0. 2um针头式滤菌器，滤过液 排放至1. 5mL EP管中，即为样品DNA0步骤3 向反应管加入2 μ L样品DNA、12. 5 μ L恒温扩增液和10. 5 μ L重蒸水，再 加入上游内引物、下游内引物、上游外引物和下游外引物，4种引物浓度分别为8 μ mol/L、 8 μ mol/L、1 μ mol/L和1 μ mol/L,混勻，放置于LA320C检测仪器反应孔上，65°C恒温扩增60min。根据反应管中反应液颜色变化，检测结果。3、本发明所述方法可行性分析取诺维梭菌标准菌株ATCC19402培养的单个菌落，采用上述检测方法进行检测， 同时设置阴性对照。诺维梭菌标准菌株购自于上海天呈医流有限公司，阴性对照为生理盐 水。检测结果显示，诺维梭菌标准菌株检测结果为反应液颜色呈黄绿色，阴性对照检 测结果为反应液颜色呈淡褐色，表明本发明试剂盒及其检测方法适用于诺维梭菌的检测。实施例5 本发明所述方法及其试剂盒特异性分析分别取诺维梭菌标准菌株、干扰菌标准菌株的菌液0. 5mL,菌液稀释至105CFU/uL， 采用实施例1至实施例4所述方法和试剂盒进行检测，标准菌株均购自于上海天呈医流有 限公司。分析结果参见表1。表1特异性分析检测结果
权利要求
1.一种用环介导恒温扩增法检测诺维梭菌的方法，其特征在于，包括利用环介导恒温扩增技术，用如SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的上游内引物、如SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的下游内引物、如SEQ ID NO :3所示核苷酸序列的上游外引物和 如SEQ ID NO 4所示核苷酸序列的下游外引物扩增样品DNA中的诺维梭菌a毒素基因，检 测扩增结果。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述扩增之前还包括对样品DNA进行快速提 取，具体步骤为样品与DNA快速提取液充分混勻，加热至沸腾并维持3min，离心或过滤，所得上清 液或滤液为包含样品DNA的溶液，所述DNA快速提取液包含0. 025-0. 075mol/L的NaOH、 0. 5-1. 5%的 Triton X-100 和 5-15%的 A1203。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述检测为通过钙黄绿素和MnCl2与扩增副 产物焦磷酸镁作用发生颜色变化检测。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述检测为用散射比浊法检测。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述环介导恒温扩增技术运行条件为恒温 63-67 °C 保温 40-80min。
6.一种用环介导恒温扩增法检测诺维梭菌的试剂盒，其特征在于，包括如SEQ ID NO 1所示核苷酸序列的上游内引物、如SEQ ID NO 2所示核苷酸序列的下 游内引物、如SEQ ID NO :3所示核苷酸序列的上游外引物和如SEQ ID NO :4所示核苷酸序 列的下游外引物。
7.根据权利要求6所述试剂盒，其特征在于，还包括DNA快速提取液，所述DNA快速提 取液包含 0. 025-0. 075mol/L 的 NaOH,0. 5-1. 5%的 Triton X-100 和 5-15%的 Al2O3-
8.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于，所述DNA快速提取液包含0.05mol/L的 NaOH、l. 0%的 Triton X-100 禾Π 10%的 Α1203。
9.根据权利要求6所述试剂盒，其特征在于，还包括恒温扩增液，所述恒温扩增液包含 20mmol/L ρΗ8· 8 的 Tris-HClU0mmol/L 的 KClU0mmol/L 的(NH4)2SO4、2mmol/L 的 MgSO4,0.的 Triton X-100、40mmol/L 的 dNTP、320U/mL 的 Bst DNA 聚合酶。
10.根据权利要求9所述试剂盒，其特征在于，还包括显色液，所述显色液为1.5-2. 5mmol/L 钙黄绿素和 2_4mmol/L MnCl2。
全文摘要
本发明涉及分子生物学领域，具体公开了一种用环介导恒温扩增法检测诺维梭菌的方法及其试剂盒。该方法利用环介导恒温扩增技术，用如SEQ ID NO1-4所示核苷酸序列的上游内引物、下游内引物、上游外引物和下游外引物扩增样品DNA中的诺维梭菌a毒素基因，检测扩增结果。本发明所述试剂盒包括上游内引物、下游内引物、上游外引物和下游外引物，还包括DNA快速提取液和恒温扩增液。本发明所述用环介导恒温扩增法检测诺维梭菌的方法及其试剂盒对诺维梭菌特异性高、灵敏度高，检测过程简单快速。
文档编号C12Q1/68GK102140505SQ201010578338
公开日2011年8月3日 申请日期2010年12月8日 优先权日2010年12月8日
发明者王左, 蒋栋能, 蒲晓允, 项贵明 申请人:中国人民解放军第三军医大学第二附属医院