9个大片段序列，分别为1、2、 3、4、5、6、7、8和9,引物序列和扩增产物大小如表1所示。采用GeneAmp High FidelityPCR System，设定反应条件在 Veriti 96-well Thermal Cycler PCR仪上进行 LR-PCRtjPCR 反应 总体积为5(^1，包括10\661^^1^出811?丨(161^7?0?缓冲液5 4 1，10臟〇1/1(1阶132 4 1， 10 4111〇1/1上、下游引物各14 1，5111〇1/1甜菜碱1(^1，01^0 2.5 4 1(对片段1扩增时使用 5 μ 1)，5U/ μ 1聚合酶混合物1 μ 1，20 μ g/ μ I DNA模板5 μ 1，超纯水补足至50 μ 1。PCR循 环参数：94°C变形3min，94°C IOsec, 68°C 5min，共35个循环，其中第2对和第3对引物退 火条件为 72°C5min，最后 72°C延伸 lOmin。PCR 反应在 Veriti 96-well Thermal Cycler PCR仪（美国ABI公司）上完成。 表1，扩增PKD1基因的LR-PCR引物
注：F为正向引物（上游引物），R为反向引物（下游引物）。表中的PCR引物序列依 次为：SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、 SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:10、SEQ ID N0:11、SEQ ID N0:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18。
[0037] LR-PCR完成后，取5 μ IPCR产物经0. 8 %的琼脂糖凝胶电泳检测。图I显示了 9个 扩增片段大小和理论值一致，并且目标条带很清晰，没有非特异性扩增，说明选择的LR-PCR 反应体系和条件合适。
[0038] 实施例3
[0039] 基于引物标签技术的LR-PCR扩增
[0040] 依据PacBio 的标签应用指南（Guidelines for Using PacBio Barcodes for SMRT Sequencing)，在上述表1的基础上设计非对称标签引物，标签序列参照PacBio提供的16 碱基标签（Barcode)序列，通过计算引物间相互作用和分析引物分子二级结构稳定性，设 计了 6套含Barcode的标签引物，每套9对引物。应用这6套含标签的引物，对6个DNA样 品分别进行LR-PCR扩增。对于片段1、2、3这三个扩增反应，因产量较少，采用多管扩增，其 它采用单管扩增。
[0041] 实施例4
[0042] PCR产物片段处理
[0043] 通过割胶纯化回收目标片段，琼脂糖凝胶电泳条件为60V，120min，胶浓度为 0.8%，采用琼脂糖凝胶回收试剂盒（天根生化科技公司）从凝胶中回收PCR产物，最后用 30 μ 1洗脱缓冲液洗脱DNA，采用Qubit 2. 0荧光光度计进行定量，6个基因组总共54个 LR-PCR扩增产物的浓度检测结果如下：
将纯化的54个PCR产物按等摩尔比进行混合，并采用AgencourtAMPure XP磁珠（美 国Beckman Coulter公司）浓缩富集，用Qubit 2. 0焚光光度计进行定量。
[0044] 实施例5
[0045] 文库构建
[0046] 文库构建采用PacBio DNA Template Prep Kit 2. 0进行制备，具体操作步骤如 下： I. DNA Damage修复反应 1) 将所需试剂置于冰上解冻 2) 于LoBind离心管中加入下列试剂：
3) 将混合体系吹打混匀 4) 快速离心机离心 5) 37°C孵育20min，然后置于4°C备用 2. 末端修复反应 反应体系如下：
1) 将混合体系吹打混匀 2) 快速离心机离心 3) 37°C孵育20min，然后置于4°C备用 3. DNA纯化 1) 向上一步所得反应液中加入0. 45x的AgencourtAMPurePB磁珠 2) 充分混合磁珠和DNA混合溶液 3) 快速离心Is收集磁珠 4) 在VWR涡旋仪上2000rpm震荡lOmin，室温 5) 快速离心Is收集磁珠 6) 将离心管放在磁力架上收集磁珠，至溶液彻底澄清 7) 在磁力架上小心吸出上清液转移至另一离心管中，注意不要碰到磁珠 8) 用新鲜配制的70 %酒精清洗磁珠 9) 重复步骤8) 10) 弃掉酒精，干燥磁珠 11) 检查离心管内是否有残留液滴，若有则重复步骤10) 12) 从磁力架上取下离心管，空气干燥30-60s 13) 洗脱DNA a, 用 30 μ I Elution Buffer 洗脱 DNA b, 2000rpm震荡Imin彻底重悬磁珠 c，瞬离并将离心管重新置于磁力架上 d，弃掉磁珠 14) 运用Qubit 2. 0检测DNA浓度 15) 运用Bioanalyzer进行定性和定量分析 16) 经打断处理后的DNA可以4°C保存24h，或-20°C保存更长时间 4. 连接接头（adapter) 通过此步骤，将平末端发夹连接到修复片段末端，反应体系如下：
1) 将混合体系吹打混匀 2) 快速离心机离心 3) 25°〇孵育1511^11 4) 65°C孵育lOmin，灭活连接酶，4°C保存备用 5. 加入核酸外切酶，孵育 加入核酸外切酶以去除未连接的片段产物，反应体系如下：
1) 快速离心机离心 2) 37°〇孵育111，4°〇保存备用 6.纯化SMRTBell模板 纯化第一次： 1) 向核酸外切酶处理过的连接反应液中加入〇. 45x的AMPure PB珠子 2) 充分混合磁珠和DNA混合溶液 3) 快速离心Is收集磁珠 4) 在VWR涡旋仪上2000rpm震荡lOmin，室温 5) 快速离心Is收集磁珠 6) 将离心管放在磁力架上收集磁珠，至溶液彻底澄清 7) 在磁力架上小心吸出上清液转移至另一离心管中，注意不要碰到磁珠 8) 用新鲜配制的70 %酒精清洗磁珠 9) 重复步骤8) 10) 弃掉酒精，干燥磁珠 11) 检查离心管内是否有残留液滴，若有则重复步骤10) 12) 从磁力架上取下离心管，空气干燥30-60s 13) 用 50 μ I Elution Buffer 洗脱 DNA，混合均勾后 2000rpm 离心 Imin a, 2000rpm震荡Imin彻底重悬磁珠 b，瞬离并将离心管重新置于磁力架上 c,弃掉磁珠 14) 洗脱后的DNA进入下一步纯化 纯化第二次： 1) 向上一步所得反应液中加入22. 5 μ 1 0. 45x的AMPure I3B珠子 2) 充分混合磁珠和DNA混合溶液 3) 快速离心Is收集磁珠 4) 在VWR涡旋仪上2000rpm震荡lOmin，室温 5) 快速离心Is收集磁珠 6) 将离心管放在磁力架上收集磁珠，至溶液彻底澄清 7) 在磁力架上小心吸出上清液转移至另一离心管中，注意不要碰到磁珠 8) 用新鲜配制的70 %酒精清洗磁珠 9) 重复步骤8) 10) 弃掉酒精，干燥磁珠 11) 检查离心管内是否有残留液滴，若有则重复步骤10) 12) 从磁力架上取下离心管，空气干燥30-60s 13) 用 100 μ I Elution Buffer 洗脱 DNA，混合均勾后 2000rpm 离心 Imin 14) Qubit 2.0 检测 DNA 浓度 纯化第三次： 1) 向上一步所得反应液中加入45 μ 1 0. 45x的AMPure PB珠子 2) 充分混合磁珠和DNA混合溶液 3) 快速离心Is收集磁珠 4) 在VWR涡旋仪上2000rpm震荡lOmin，室温 5) 快速离心Is收集磁珠 6) 将离心管放在磁力架上收集磁珠，至溶液彻底澄清 7) 在磁力架上小心吸出上清液转移至另一离心管中，注意不要碰到磁珠 8) 用新鲜配制的70 %酒精清洗磁珠 9) 重复步骤8) 10) 弃掉酒精，干燥磁珠 11) 检查离心管内是否有残留液滴，若有则重复步骤10) 12) 从磁力架上取下离心管，空气干燥30-60s 13) 用 10μ1 Elution Buffer 洗脱 DNA，混合均勾后 2000rpm 离心 Imin 14) Qubit 2.0 检测 DNA 浓度 15) 运用BioAnalyzer进行定性和定量分析，图2为文库质检图，显示片段大小的分布， SMRTBell文库质检合格。
[0047] 实施例6
[0048] 引物退火和聚合酶结合
[0049] 米用DNA/Polymerase Binding Kit 2. 0进行SMRTBell模板的引物退火和聚合酶 结合。引物80°C预处理后与模板混合，20°C孵育30min后4°C保存。聚合酶结合到SMRTBell 模板反应条件为30°C孵育30min。