[0050] 实施例7
[0051] PacBio SMRT 测序
[0052] 将模板-聚合酶复合物转移到96孔板中，采用P6_C4Chemistry试剂盒，加上 测序试剂按照PacBio SMRT测序仪说明书进行测序操作。测序仪采用PacBio RS II 单分子实时测序系统，其SMRT Cell含有15,000个纳米级的零模波导孔（zero-mode waveguides, ZMWs)，每个ZMW都能够包含一个DNA聚合酶及一条DNA样品链进行单分子测 序，并实时检测插入碱基的荧光信号。
[0053] 实施例8
[0054] 结果分析
[0055] 产出的测序结果是一系列DNA读序（reads)，采用SMRT Portal软件通过识别序 列结果中的标签序列，建立各个标签对应样品测序结果的数据，同时过滤去除接头序列和 低质量数据。通过BWA(Burrows-Wheeler Aligner)将测序读序比对到参照序列上，采用 GATK进行SNVs和Indels提取，排除多态性变异后获得该样品PKDl基因突变信息。对比 对BAM文件应用Integrative Genomics Viewer(IGV)软件进行比对读序的可视化分析。 图3和图4为1例典型的PacBio SMRT测序检测结果。图3显示PKDl基因 PacBio SMRT 测序的覆盖深度和覆盖率，显示所有外显子平均覆盖深度达到200X，所有外显子覆盖率为 100%，富含高GC的1号外显子测序深度达到600X。图4显示PKDl基因 PacBio SMRT测 序的IGV视图，显示PKDl外显子1至外显子46间的区域，所有外显子和所测内含子覆盖率 达到100%，并显示高的测序深度，且每个片段测序深度均匀性好。
[0056] 通过本发明检测了 6例多囊肾患者，发现了 4例PKDl突变检测阳性患者，图5显示 这4例PKDl突变检测阳性结果，A为c. 7103T>A突变；B为c. 1615CXT突变；C为c. 8311G>A 突变；D为c. 10277_10278insGTGA突变。得到的PKDl基因突变结果与Sanger测序的结果 是一致的，说明本发明的方法是可行的。
【主权项】
1. 用于PCR特异性扩增检测PKDl基因突变的引物组，该组PCR引物共9对，分别如下： 用于扩增PKDl基因外显子1和内含子1的引物，其正向引物如SEQ ID NO: 1所示，反 向引物如SEQ ID NO:2所示； 用于扩增PKDl基因内含子1到外显子8的引物，其正向引物如SEQ ID NO: 3所示，反 向引物如SEQ ID NO:4所示； 用于扩增PKDl基因外显子7到外显子13的引物，其正向引物如SEQ ID NO: 5所示，反 向引物如SEQ ID NO:6所示； 用于扩增PKDl基因内含子12到外显子15的引物，其正向引物如SEQ ID NO: 7所示， 反向引物如SEQ ID NO:8所示； 用于扩增PKDl基因外显子15到内含子21的引物，其正向引物如SEQ ID NO:9所示， 反向引物如SEQ ID NO: 10所示； 用于扩增PKDl基因内含子21到内含子26的引物，其正向引物如SEQ ID NO: 11所示， 反向引物如SEQ ID NO: 12所示； 用于扩增PKDl基因内含子26到内含子34的引物，其正向引物如SEQ ID NO: 13所示， 反向引物如SEQ ID NO: 14所示； 用于扩增PKDl基因内含子34到内含子41的引物，其正向引物如SEQ ID NO: 15所示， 反向引物如SEQ ID NO: 16所示； 用于扩增PKDl基因内含子39到外显子46的引物，其正向引物如SEQ ID NO: 17所示， 反向引物如SEQ ID NO: 18所示。2. 用于PCR特异性扩增检测PKDl基因突变的试剂盒，包含权利要求1的引物组中的一 对或多对引物。3. 权利要求2的试剂盒，还包含以下一种或多种试剂： 用于从样品提取基因组DNA的试剂； 利用所述引物进行长片段PCR反应的试剂； 用于处理扩增产物以使得扩增产物能用于高通量测序技术中的试剂；优选其中所述利 用所述引物进行长片段PCR反应的试剂DNA聚合酶、缓冲液和dNTP混合物。4. 权利要求3的试剂盒，包含下述试剂： (1) PCR引物选自权利要求1的引物组中所包含的任何一对或多对引物； (2) IOXGeneAmp High Fidelity PCR 缓冲液； (3) IOmmol/LdNTP ； (4) 5mol/L 甜菜碱； (5) 5U/y 1聚合酶混合物。5. 根据权利要求4的试剂盒，特征在于：在总体积为50 y 1的PCR反应体系中含有下 述组分：每种PCR引物各Iy 1，引物的浓度为10 ymol/L;10XGeneAmp High Fidelity PCR 缓冲液5 4 1，10_〇1/1(1阶132 111，10 11111〇1/1上、反向引物各1111，5111〇1/1甜菜碱10 111， DMSO 2. 5 y I (对片段1扩增时使用5 y I)，5U/ y 1聚合酶混合物I y I，20 y g/ y I DNA模板 5 u 1 〇6. 权利要求1-5所述的PCR引物组或试剂盒在检测PKDl基因突变中的用途。7. -种用于非诊断目的的体外检测PKDl基因突变的方法，包括以下步骤： (1) 采集受检者标本，如外周血，提取基因组DNA ; (2) 应用基因组DNA作为模板，使用权利要求1的引物组，在适于扩增目的核酸的条件 下，采用长链PCR技术对PKDl进行靶向扩增，其中每一对标签引物由正向标签引物和反向 标签引物构成，其中正向标签引物和反向标签引物所包含的标签可以相同或者不同；同一 DNA样品所用每对标签引物（共9对）使用相同的标签，不同DNA样品所用标签引物中的标 签彼此不同，以区分不同DNA样品的扩增产物； (3) 对扩增的9个长片段产物，进行纯化回收； (4) 将纯化的9个PCR产物进行混合，得到1个受检者的PCR产物文库； (5) 将多个受检者的PCR产物文库进行等量混合直接构建单一 SMRTBell文库，在SMRT Cell上进行PacBio SMRT测序，获得长片段PCR产物的序列； (6) 基于标签序列区分不同的基因组DNA样品，采用SMRT Portal软件通过识别序列结 果中的标签序列，建立各个标签对应DNA样品测序结果的数据，通过生物信息学分析将单 个样品测序获得的DNA序列片段比对到参考PKDl基因上，进行SNVs和Indels提取，排除 多态性变异获得该标本PKDl基因突变信息。8. 权利要求7所述的检测PKDl基因突变的方法，特征在于：包括下述步骤： (1)从受检标本中提取基因组DNA ; ⑵应用基因组DNA作为模板，选取靶基因并设计9对PCR标签引物，采用LR-PCR技术 对靶基因进行靶向扩增，PCR反应体系包含0. 5M甜菜碱，PCR反应条件采用2步法PCR ; (3) 对扩增的9个长片段产物，进行纯化回收； (4) 将纯化的9个PCR产物进行混合，并进行定量，得到1个受检DNA样品（对应1个 受检者）的PCR产物文库； (5) 对不同的受检者基因组DNA样品采用各自标签的PCR标签引物进行扩增，得到每个 受检DNA样品各自的PCR产物文库； (6) 将多个受检者的PCR文库进行等量混合直接建单一 SMRTBell文库，在SMRT Cell 进行PacBio SMRT测序； (7) 基于标签序列区分不同的基因组DNA样品，采用SMRT Portal软件通过识别序列结 果中的标签序列，建立各个标签对应样品测序结果的数据，通过生物信息学分析将单个样 品测序获得的DNA序列片段比对到参考靶基因上，进行SNVs和Indels提取，排除多态性变 异获得该标本靶基因突变信息。9. 权利要求1-5所述的PCR引物组或试剂盒在常染色体显性多囊肾病基因诊断中的用 途。
【专利摘要】本发明涉及一种检测PKD1基因突变方法，所述方法利用PKD1基因的序列信息设计9对PCR 标签引物，应用长链PCR技术靶向扩增PKD1基因， 同时在扩增产物加上标签，PCR产物纯化、混合后直接建单一SMRTBell文库，应用PacBio RSⅡ测序仪进行测序，通过生物信息学分析获得PKD1 基因突变信息。有益效果为通过设计了一组简化的引物，结合标签引物技术，实现了对多个DNA 样品PCR产物的分别标记，扩增的PCR产物不需要打断可以直接建库，建库不需要再进行PCR，使多个样本混合成一个文库通过PacBio RSⅡ测序文库构建环节同时处理，大大简化了实验操作。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN104975081
【申请号】CN201510292672
【发明人】马定远, 许争峰, 胡平
【申请人】南京市妇幼保健院
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2015年6月1日