一种基于dna水凝胶检测多个单核苷酸变异或单核苷酸多态性的方法
【专利摘要】本发明属于疾病检测，药物分析领域。本发明涉及检测目标核酸分子，尤其是多个单核苷酸变异或单核苷酸多态性（SNP）。本发明使用一种内部含有支链探针DNA的水凝胶作为检测材料。利用被检测DNA与探针DNA形成双链DNA时，单核苷酸错配的DNA（或含有多个单核苷酸变异的DNA）与完全互补的DNA之间的双链解旋温度（Tm）的差异，通过荧光染料鉴别SNP。本方法省略了各种处理和纯化步骤，具有高效，快速，结果肉眼可测等优点。
【专利说明】一种基于DNA水凝胶检测多个单核苷酸变异或单核苷酸多 态性的方法
【技术领域】：
[0001] 本发明属于疾病检测，药物分析领域。本发明涉及检测目标核酸分子，尤其是多个 单核苷酸变异或单核苷酸多态性（SNP)。
【背景技术】：
[0002] DNA水凝胶分为纯DNA水凝胶和DNA与人造高分子材料杂化的DNA水凝胶。本发 明是将DNA嵌入高分子水凝胶中，使其成为兼具DNA和水凝胶功能的智能型水凝胶，属于后 者。
[0003] 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP)是由于单个喊基核苷 酸改变而导致基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性。包括单碱基的转换、颠 换、以及单碱基的插入/缺失等。一般而言，SNP是指变异频率大于1 %的单核苷酸变异。 在人类基因组中大概每1000个碱基就有一个SNP，人类基因组上的SNP总量大概是3 X IO6 个。
[0004] 现在普遍认为SNP研宄是人类基因组计划走向应用的重要步骤。这主要是因为 SNP将提供一个强有力的工具，用于高危群体的发现、疾病相关基因的鉴定、药物的设计和 测试以及生物学的基础研宄等诸多科研和医疗领域。
[0005] 目前，检测SNPs的方法主要有以下几种：1、测序方法：常规测序， Pyrosequencing(焦磷酸测序），微测序（SNaPshot) ;2、基于杂交的方法：Taqman探针法， Microarray芯片法；3、引物延伸：MALDI-Tof，dHPLC(变性高效液相色谱技术）；4、以构象 为基础的方法：RFLP，SSCP，DGGE ;5、溶解曲线：HRM(高分辨率溶解曲线分析技术）。这些方 法都需要借助相应的仪器，操作繁琐，且费用昂贵。
[0006] SYBR Green I是一种结合于所有双链DNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的 染料。在游离状态下或含有单链DNA时，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA 结合后，荧光大大增强。除了 SYBR Green I外还有溴化乙锭（缩写EtBr，EB)，pico Green， GelRed和GelGreen等荧光染料可用于检测双链DNA。
【发明内容】
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[0007] 本发明提供了一种可在特定波长的光照下快速肉眼检测多个单核苷酸变异或SNP 的方法。本发明制备并使用一种内部含有支链探针DNA的水凝胶作为检测材料。本发明利 用被检测DNA与探针DNA形成双链DNA时，单核苷酸错配的DNA (或含有多个单核苷酸变异 的DNA)与完全互补的DNA之间的双链解旋温度（Tm)的差异，通过荧光染料鉴别SNP (或多 个单核苷酸变异）。
[0008] 本发明所提供的水凝胶的结构和形态如图1、2所示：
[0009] 其中：m、n、x 的比值为 1:10 ?50 :0· 00001 ?0· 001，优选为 1:20 ?30 :0· 00001 ? 0. 01，X的值是根据被检测DNA的量可调。
[0010] 本发明提供的基于DNA水凝胶检测多个单核苷酸变异或单核苷酸多态性的方法 包括以下步骤：
[0011] 1)制备DNA水凝胶：该水凝胶是以甲叉双丙烯酰胺（MBAAm)为交联剂，丙烯酰 胺（AAm)与甲基丙烯酰胺修饰探针DNA的共聚物为骨架的高分子水凝胶。其中甲基丙烯 酰胺修饰探针DNA是通过DNA合成仪将甲基丙烯酰胺单体（制备方法参见中国专利申请 2013107110031)接入到下述探针DNA序列末端制备而得的。该水凝胶性质参数同于常规的 分子生物学用的聚丙烯酰胺电泳凝胶，生物相容性好，凝胶内部呈中性，有助于提高检测灵 敏度和信噪比。
[0012] 具体的制备方案如下：在凝胶单体溶液中（AAm与MBAAm的物质的量之比为10? 50:1)，加入甲基丙烯酰胺修饰探针DNA，在引发剂过硫酸铵（APS)和N，N，N'，N'_四甲基乙 二胺（TEMED)的作用下，交联成含有探针DNA的AAm含量为4?25%的DNA水凝胶。
[0013] 2) DNA分子杂交：将步骤1)中制得的水凝胶分别加入到含有完全互补DNA的缓冲 液和被检测DNA缓冲液（含有多个单核苷酸变异或SNP)中进行分子杂交。根据所形成的 双链DNA的解链温度（Tm)的差异，使完全互补DNA与含有多个单核苷酸变异或SNP的DNA 在凝胶中的含量形成显著差异。
[0014] 3)荧光染料染色成像：将荧光染料（具体可为SYBR Green I，溴化乙锭， PicoGreen，GelRed和GelGreen等对双链DNA具有选择性的核酸检测染料）加入到步骤2) 中的缓冲液中进行染色。经特定波长的光照成像，实现SNP的肉眼鉴别。
[0015] 本发明所提供的多个单核苷酸变异或SNP的检测方法省略了各种处理和纯化步 骤，具有高效，快速，结果肉眼可测等优点。本发明提供的方法可检测C/C、A/A、G/G、G/T、G/ A、C/A、C/T、T/T SNP以及两个以上的单核苷酸错配的单链DNA。由于探针DNA固定在凝胶 内部，因此可实现传感信号在凝胶块儿内的富集，从而达到高检测灵敏度（被检测DNA小于 5纳克）。
【专利附图】
【附图说明】：
[0016] 图1为含有DNA的聚丙烯酰胺高分子及结构。
[0017] 图2为本发明的DNA水凝胶照片。
[0018] 图3为实施例2中水凝胶对C/C SNP及含有两个单核苷酸变异的被检测DNA的检 测结果（从左到右依次为1-6号管）。
[0019] 图4为实施例3中水凝胶对A/A SNP的检测结果（从左到右为1、2、3号管）。
[0020] 图5为实施例4中水凝胶对G/G SNP的检测结果（从左到右为1、2、3号管）。
[0021] 图6为实施例5中水凝胶对G/T SNP的检测结果（从左到右为1、2、3号管）。
[0022] 图7为实施例6中水凝胶对G/A SNP的检测结果（从左到右为1、2、3号管）。
[0023] 图8为实施例7中水凝胶对C/A SNP的检测结果（从左到右为1、2、3号管）。
[0024] 图9为实施例8中水凝胶对C/T SNP的检测结果（从左到右为1、2、3号管）。
[0025] 图10为实施例8中水凝胶对T/T SNP的检测结果（从左到右为1、2、3号管）。 具体实施方案：
[0026] 实施例1
[0027] DNA水凝胶的制备过程如下：
[0028] 1)25%凝胶单体的制备
[0029] 称取 2. 5g(0. 035mmol)AAm，0. 187g(0. 0012mmol)MBAAm，用灭菌水定容至 10. 0ml。
[0030] 2) 4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES)缓冲液的制备
[0031] 称取 0· 650g HEPES，0. 313g Na2HPO4 ·12Η20,0· 800g NaCl，加入 40. Oml 灭菌水，用 IM NaOH溶液调节pH 7. 0,定容至50. 0ml。
[0032] 3) DNA水凝胶的制备
[0033] 量取适量25 %的凝胶单体溶液，加入探针DNA溶液，震荡混匀。加入新鲜配制的 10 % APS水溶液，10 % TEMED溶液，室温下静置30min。将凝胶浸泡在HEPES缓冲液中3h X 3 次。（探针DNA的浓度可以根据具体情况作出相应的改变。）水凝胶性质参数同于常规的 分子生物学用的聚丙烯酰胺电泳凝胶。
[0034] 实施例2
[0035] C/C SNP及含有两个单核苷酸变异的被检测DNA的检测：
[0036] 取六小块实施例1中制备的DNA水凝胶，编号1，2, 3, 4, 5, 6。用HEPES缓冲液浸泡 0. 5h，吸出缓冲液。1号管中加入20. 0 μ I HEPES缓冲液，2-6号管中各加入18. 0 μ I HEPES 缓冲液，然后分别加入 2. 0 μ 1 的 10. 0 μ M 的 F-DNA，Ml-DNA，M2-DNA，M3-DNA，SCR-DNA (F-DNA 为与探针DNA形成的双链部分完全互补的序列；Ml-DNA为与探针DNA形成的双链部分中含 有一个C/C单核苷酸错配的序列；M2-DNA为与探针DNA形成的双链部分中含有两个单核 苷酸错配的序列；M3-DNA为与探针DNA形成的双链部分中含有三个单核苷酸错配的序列； SCR-DNA为与探针DNA不相关的随机序列）。孵育0. 5h后，吸出液体，用HEPES缓冲液浸泡 洗涤3次。吸出缓冲液，各加入18 μ I HEPES缓冲液和2 μ ISYBR 250 X，375nm紫外灯下观 察。可以明显看到含有与探针DNA完全互补的序列F-DNA的2号管中的凝胶的荧光强度明 显大于不含F-DNA序列的凝胶的荧光强度。结果如图3所示。
[0037] 实施例3
[0038] A/A SNP 的检测：
[0039] 取3小块上述制备的DNA水凝胶，编号1，2, 3。用HEPES缓冲液浸泡0. 5h，吸出缓 冲液。1号管中加入20. Oyl HEPES缓冲液，2、3号管中各加入18μ1 HEPES缓冲液，然后 分别加入2. 0 μ 1的10. 0 μ M的F-DNA和A/A-DNA (F-DNA为与探针DNA形成的双链部分完 全互补的序列；A/A-DNA为与探针DNA形成的双链部分中含有一个Α/Α单核苷酸错配的序 列）。0. 5h后，吸出液体，用HEPES缓冲浸泡lOmin。吸出缓冲液，各加入18. 0 μ I HEPES缓 冲液和2. Ομ? SYBR 250 X，375nm紫外灯下观察。可以明显看到含有与探针DNA完全互补 的序列F-DNA的2号管中的凝胶的荧光强度明显大于含A/A错配DNA序列的凝胶的荧光强 度。结果如图4所不。
[0040] 实施例4
[0041] G/GSNP 的检测：
[0042] 取3小块上述制备的DNA水凝胶，编号1，2, 3。用HEPES缓冲液浸泡0. 5h，吸出缓 冲液。1号管中加入20. 0 μ I HEPES缓冲液，2、3号管中各加入18. 0 μ IHEPES缓冲液，然后 分别加入2. 0 μ 1的10. 0 μ M的F-DNA和G/G-DNA (F-DNA为与探针DNA形成的双链部分完 全互补的序列；G/G-DNA为与探针DNA形成的双链部分中含有一个G/G单核苷酸错配的序 列）。0. 5h后，吸出液体，用HEPES缓冲浸泡10。吸出缓冲液，各加入18. O μ I HEPES缓冲 液和2. Ομ? SYBR 250 X，375nm紫外灯下观察。可以明显看到含有与探针DNA完全互补的 序列F-DNA的2号管中的凝胶的荧光强度明显大于含G/G错配DNA序列的凝胶的荧光强度。 结果如图5所不。
[0043] 实施例5 [0044] G/T SNP 的检测：
[0045] 取3小块上述制备的DNA水凝胶，编号1，2, 3。用HEPES缓冲液浸泡0. 5h，吸出缓 冲液。1号管中加入20. 0 μ I HEPES缓冲液，2、3号管中各加入18. 0 μ IHEPES缓冲液，然后 分别加入2. 0 μ 1的10. 0 μ M的F-DNA和G/T-DNA (F-DNA为与探针DNA形成的双链部分完 全互补的序列；G/T-DNA为与探针DNA形成的双链部分中含有一个G/T单核苷酸错配的序 列）。0. 5h后，吸出液体，用HEPES缓冲浸泡lOmin。吸出缓冲液，各加入18 μ I HEI3ES缓 冲液和2. Ομ? SYBR 250 X，375nm紫外灯下观察。可以明显看到含有与探针DNA完全互补 的序列F-DNA的2号管中的凝胶的荧光强度明显大于含G/T错配DNA序列的凝胶的荧光强 度。结果如图6所不。
[0046] 实施例6
[0047] G/A SNP 的检测：
[0048] 取3小块上述制备的DNA水凝胶，编号1，2, 3。用HEPES缓冲液浸泡0. 5h，吸出缓 冲液。1号管中加入20. 0 μ I HEPES缓冲液，2、3号管中各加入18. 0 μ IHEPES缓冲液，然后 分别加入2. 0 μ 1的10. 0 μ M的F-DNA和G/A-DNA (F-DNA为与探针DNA形成的双链部分完 全互补的序列；G/A-DNA为与探针DNA形成的双链部分中含有一个G/A单核苷酸错配的序 列）。0. 5h后，吸出液体，用HEPES缓冲浸泡lOmin。吸出缓冲液，各加入18 μ I HEI3ES缓 冲液和2. Ομ? SYBR 250 X，375nm紫外灯下观察。可以明显看到含有与探针DNA完全互补 的序列F-DNA的2号管中的凝胶的荧光强度明显大于含G/A错配DNA序列的凝胶的荧光强 度。结果如图7所不。
[0049] 实施例7
[0050] C/A SNP 的检测：
[0051] 取3小块上述制备的DNA水凝胶，编号1，2, 3。用HEPES缓冲液浸泡0. 5h，吸出缓 冲液。1号管中加入20. 0 μ I HEPES缓冲液，2、3号管中各加入18. 0 μ IHEPES缓冲液，然后 分别加入2. 0 μ 1的10. 0 μ M的F-DNA和C/A-DNA (F-DNA为与探针DNA形成的双链部分完 全互补的序列；C/A-DNA为与探针DNA形成的双链部分中含有一个C/A单核苷酸错配的序 列）。0. 5h后，吸出液体，用HEPES缓冲浸泡10。吸出缓冲液，各加入18. 0 μ I HEPES缓冲 液和2. Ομ? SYBR 250 X，375nm紫外灯下观察。可以明显看到含有与探针DNA完全互补的 序列F-DNA的2号管中的凝胶的荧光强度明显大于含C/A错配DNA序列的凝胶的荧光强度。 结果如图8所不。
[0052] 实施例8
[0053] C/T SNP 的检测：
[0054] 取3小块上述制备的DNA水凝胶，编号1，2, 3。用HEPES缓冲液浸泡0. 5h，吸出缓 冲液。1号管中加入20. 0 μ I HEPES缓冲液，2、3号管中各加入18. 0 μ IHEPES缓冲液，然后 分别加入2. 0 μ 1的10 μ M的F-DNA和C/T-DNA (F-DNA为与探针DNA形成的双链部分完全互 补的序列；C/T-DNA为与探针DNA形成的双链部分中含有一个C/T单核苷酸错配的序列）。 0. 5h后，吸出液体，用HEPES缓冲浸泡lOmin。吸出缓冲液，各加入18. O μ I HEPES缓冲液 和2. Ομ? SYBR 250 X，375nm紫外灯下观察。可以明显看到含有与探针DNA完全互补的序 列F-DNA的2号管中的凝胶的荧光强度明显大于含C/T错配DNA序列的凝胶的荧光强度。 结果如图9所不。
[0055] 实施例9
[0056] T/T SNP 的检测：
[0057] 取3小块上述制备的DNA水凝胶，编号1，2, 3。用HEPES缓冲液浸泡0. 5h，吸出缓 冲液。1号管中加入20. 0 μ I HEPES缓冲液，2、3号管中各加入18. 0 μ IHEPES缓冲液，然后 分别加入2. 0 μ 1的10 μ M的F-DNA和T/T-DNA (F-DNA为与探针DNA形成的双链部分完全互 补的序列；T/T-DNA为与探针DNA形成的双链部分中含有一个Τ/Τ单核苷酸错配的序列）。 0. 5h后，吸出液体，用HEPES缓冲浸泡lOmin。吸出缓冲液，各加入18. 0 μ I HEPES缓冲液 和2. Ομ? SYBR 250 X，375nm紫外灯下观察。可以明显看到含有与探针DNA完全互补的序 列F-DNA的2号管中的凝胶的荧光强度明显大于含T/T错配DNA序列的凝胶的荧光强度。 结果如图10所不。
[0058] 本发明所用到的DNA序列如下所示：
[0059] 探针 DNA: TTT TTT TTA GGC ACA AAC ACG CA (5, -3'）
[0060] F-DNA:GAG GTG CGT GTT TGT GCC T (5, -3,）
[0061] Ml-DNA:GAG GTG CGT βΤΤ TGT GCC T (5, -3,）
[0062] M2-DNA:GAG GTG CGT CTT TCT GCC T (5 ? -3?)
[0063] M3-DNA:GAG GTG CCT CTT TCT GCC T (5 ? -3?)
[0064] SCR-DNA:TAT ACC GCT GCT AGC GGA G (5, -3,）
[0065] A/A-DNA:GAG GTG CGT GAT TGT GCC T (5, -3,）
[0066] G/G-DNA:GAG GTG ￡GT GTT TGT GCC T (5, -3,）
[0067] G/T-DNA:GAG GTG IGT GTT TGT GCC T (5, -3' ）
[0068] G/A-DNA:GAG GTG AGT GTT TGT GCC T (5, -3,）
[0069] C/A-DNA:GAG GTG CGT ATT TGT GCC T (5, -3,）
[0070] C/T-DNA:GAG GTG CIT GTT TGT GCC T (5, -3,）
[0071] T/T-DNA:CTC AGT TTG TGC CTI A AAA (5, -3,）
[0072] 粗体表示互补配对序列，下划线表示错配碱基。
[0073] 结论：本发明可以简便、快速地检测出C/C、A/A、G/G、G/T、G/A、C/A、C/T、T/T SNP 以及两个以上的单核苷酸错配的单链DNA。
【权利要求】
1. DNA水凝胶检测单核苷酸变异或单核苷酸多态性中的应用，其特征在于，所述DNA水 凝胶的结构如下：
其中 m、n、x 的比值为 1:10 ?50 :0? OOOOl ?0? 001。
2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的DNA水凝胶是以甲叉双丙烯酰胺为交 联剂，丙烯酰胺与甲基丙烯酰胺修饰探针DNA的共聚物为骨架的高分子水凝胶。
3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的甲基丙烯酰胺修饰探针DNA是通过 DNA合成仪将甲基丙烯酰胺单体接入到下述探针DNA序列末端制备而得的。
4. 如权利要求2或3所述的应用，其特征在于，在凝胶单体溶液中，加入甲基丙烯酰胺 修饰探针DNA，在引发剂过硫酸铵和N，N，N'，N' -四甲基乙二胺的作用下，交联成含有探针 DNA的丙烯酰胺含量为4?25 %的DNA水凝胶。
5. 如权利要求4所述的应用，其特征在于，丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺=10?50: 1，优 选为：20?30:1。
6. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的单核苷酸变异是指C/C、A/A、G/G、G/ T、G/A、C/A、C/T、T/T SNP以及两个以上的单核苷酸错配。
7. 如权利要求1-6任何一项所述的应用，其特征在于，包括如下步骤： (1) 制备DNA水凝胶； (2) DNA分子杂交和控温洗涤； (3) 荧光染料染色成像。
8. 如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的DNA分子杂交为：将步骤1)中制得 的水凝胶分别加入到含有完全互补DNA的缓冲液和被检测的含有多个单核苷酸变异或SNP DNA缓冲液中，在特定温度下进行分子杂交和洗涤。
9. 如权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤（3)中，将荧光染料加入到步骤2)中 的缓冲液中进行染，经特定波长的光照成像，实现SNP的肉眼鉴别；所述的荧光染料为SYBR Green I，溴化乙锭，PicoGreen，GelRed或GelGreen等可选择性结合双链核酸的核酸检测 染料。
【文档编号】C12Q1/68GK104498601SQ201410757718
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月10日 优先权日:2014年12月10日
【发明者】刘明哲, 张红利, 蒋刚锋, 汪伊月 申请人:沈阳药科大学