专利名称：一种5’-核苷酸的制备方法
技术领域：
本发明涉及核苷磷酸化的方法，尤其是在悬浮反应液中加入催化剂，提高核苷5’ 位羟基磷酸化的选择性，抑制副产物的生成。
背景技术：
核苷酸在农业、食品和医药行业有着广泛的用途。尤其是在婴儿食品和医药领域 的应用中，有着不可替代的功能。在医药领域，临床实验表明，核苷酸参与人体代谢，促进内 脏器官改进和恢复，改善骨髓造血功能，可作为治疗癌症病毒的辅助药物，是一种非常重要 的医药原料。除在医药行业应用外，在精细化工及食品行业中核酸类物质也有重要作用。核 酸类物质作为化妆品的成分之一，有护肤、防皱等功效。核酸类物质用做植物营养添加剂， 使用后可以明显提高水稻、大豆等农作物的产量，最高增产可以达40%。用于动物的饲养 可以提高动物的增重率及饲料使用率，料耗明显降低。5"-核苷酸用途广泛，与人们的生 活息息相关，研究其不同的合成路径对医药，食品，农业等都有着非常重要的意义。目前核 苷酸制备生成方法有化学合成法、微生物发酵法、酶解法以及酶催化法，分别是从不同的 角度研究了核苷酸的合成，但也各有利弊。化学法，主要是以核苷为原料进行常规磷酸化反 应。当核苷如肌苷或鸟苷用三氯氧磷在磷酸三乙酯存在下磷酸化时，在得到所需的5’ -单 核苷酸的同时会产生2’位磷酸酯、3’位磷酸酯、二磷酸酯、嘌呤和其他副产物。这是因为核 苷磷酸化虽然主要发生在5’位羟基，但是2’位羟基和3’位羟基也同时进行了磷酸化，这 样就产生了 2’位磷酸酯、3’位磷酸酯杂质。并且还存在其他副反应。因为副反应多，杂质 多，所以提纯困难，纯度低，收率低(US3413282，1968)。微生物发酵法，主要是利用微生物菌 株的生物合成途径来生产核苷酸，副产物少，成本低，但此法的应用受到微生物特性的很大 限制。酶解法，酶解法生产核苷酸是历史最长、技术最成熟的生产方法，已成为制备各种天 然核苷酸的经典方法，但是此法由于反应器的膜易堵塞而且膜反应器维护费用高，故不适 用于大规模工业生产。酶催化方法，同时具有微生物法的产物单一，成本低的优点，又有化 学法的作用范围广泛的特点，正受到越来越多的重视。此法的不足之处在于对酶的筛选工 作量很大，同时酶的底物作用范围也有一定的限制。
发明内容
针对上述缺点，本发明要解决的技术问题是提供一种高纯度、高收率的5’ _核苷 酸的制备方法。为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是一种5’ -核苷酸的制备方法， 步骤为将核苷悬浮于由磷酸三低级烷酯组成的有机溶剂中，加入催化剂，然后将所得的悬 浮液与磷酸化试剂在_30°C -20°C的温度下接触使核苷进行磷酸化，得到5’ -核苷酸；所述 的核苷与催化剂的重量比是100 0.5-1.5。进一步在上述5’_核苷酸的制备方法中，所述的核苷是肌苷、鸟苷中的一种或两 种。所述的磷酸三低级烷酯是磷酸三甲酯、磷酸三乙酯中的一种或两种。所述的催化剂是
3四氮唑、间氯过氧化苯甲酸中的一种或两种。所述的磷酸化试剂是三聚磷酸钠STP、五氧化 二磷P2O5、磷酸H3PO4、三氯氧磷POCl3中的一种或几种，或者这些物质的全部。与现有的核苷酸的制备方法相比，本发明将核苷悬浮于由磷酸三低级烷酯组成的 有机溶剂中，加入催化剂，然后将所得的悬浮液与磷酸化试剂在_30°C _20°C的温度下接 触，以对所述的核苷进行磷酸化，由此得到5’ -核苷酸。本发明磷酸化反应周期短，只需要 3-5小时，而常规磷酸化反应需要5-7小时。本发明磷酸化反应收率高达到95% 98%，常 规磷酸化反应收率85% 90%。因此，本发明磷酸化反应副反应少，副产物少，容易纯化， 从而可以生产出高纯度、高收率的5’ -核苷酸。
具体实施例方式本发明的主旨是将核苷悬浮于由磷酸三低级烷酯组成的有机溶剂中，加入催化 剂，然后将所得的悬浮液与磷酸化试剂在-30°C -20°C的温度下接触，以对所述的核苷进行 磷酸化，由此得到5’ -核苷酸。按照本发明，可以制得高纯度和高收率的5’ -核苷酸，缩短 了核苷磷酸化反应的时间，使在核苷酸纯化时杂质的去除更加容易，降低后处理难度。下面 结合实施例对本发明的内容作进一步详述，实施例中所提及的内容并非对本发明的限定， 制备过程中各个原材料的选择可因地制宜而对结果并无实质性影响。比较例1比较例采用背景技术US3413282，1968中的方法。在500ml三口瓶中投入IOOg肌苷，加入1400g磷酸三乙酯，搅拌降温到-10°C，缓 慢加入130g三氯氧磷，6小时后，取样检测，高效液相色谱目标产物峰保留时间与5’-肌苷 酸标准品保留时间一致，按照高效液相色谱法计算5’ -肌苷酸收率89. 5%。用高效液相色谱仪进行目标产物保留时间与标准品保留时间比较，鉴定目标产 物，以及目标产物高效液相色谱法定量分析的方法和条件如下(下面的比较例和实施例应 用相同的方法和条件)标准品5’ -肌苷酸、5’ -鸟苷酸(sigma公司)仪器高效液相色谱仪(Agilent 1200)柱BDS C184. 6mmx250mm流动相0. 5%磷酸二氢钾溶液流速1.2ml/秒比较例2在500ml三口瓶中投入IOOg鸟苷，加入1500g磷酸三乙酯，搅拌降温到-10°C，缓 慢加入140g三氯氧磷，6小时后，取样检测，高效液相色谱目标产物峰保留时间与5’-鸟苷 酸标准品保留时间一致，按照高效液相色谱法计算5’ -鸟苷酸收率86. 8%。实施例1在500ml三口瓶中投入IOOg肌苷，加入1400g磷酸三乙酯，搅拌，加入0. 5g四氮 唑和0. 5g间氯过氧化苯甲酸，降温到-10°C，缓慢加入130g三氯氧磷，3小时后，取样检测， 高效液相色谱目标产物峰保留时间与5’ -肌苷酸标准品保留时间一致，按照高效液相色谱 法计算5’ -肌苷酸收率97.2%。实施例2
在500ml三口瓶中投入IOOg鸟苷，加入1500g磷酸三乙酯，搅拌，加入0. 5g四氮 唑和0. 5g间氯过氧化苯甲酸，降温到-10°C，缓慢加入140g三氯氧磷，3小时后，取样检测， 高效液相色谱目标产物峰保留时间与5’ -鸟苷酸标准品保留时间一致，按照高效液相色谱 法计算5，-鸟苷酸收率96.8%。
权利要求
一种5’ 核苷酸的制备方法，步骤为将核苷悬浮于由磷酸三低级烷酯组成的有机溶剂中，加入催化剂，然后将所得的悬浮液与磷酸化试剂在 30℃ 20℃的温度下接触使核苷进行磷酸化，得到5’ 核苷酸；所述的核苷与催化剂的重量比是100∶0.5 1.5。
2.根据权利要求1所述的5’-核苷酸的制备方法，其特征在于所述的核苷是肌苷、鸟 苷中的一种或两种。
3.根据权利要求2所述的5’-核苷酸的制备方法，其特征在于所述的磷酸三低级烷 酯是磷酸三甲酯、磷酸三乙酯中的一种或两种。
4.根据权利要求3所述的5’-核苷酸的制备方法，其特征在于所述的催化剂是四氮 唑、间氯过氧化苯甲酸中的一种或两种。
5.根据权利要求4所述的5’-核苷酸的制备方法，其特征在于所述的磷酸化试剂是 三聚磷酸钠STP、五氧化二磷P2O5、磷酸H3PO4、三氯氧磷POCl3中的一种或几种，或者这些物 质的全部。
全文摘要
本发明公开了一种5’-核苷酸的制备方法，步骤为将核苷悬浮于由磷酸三低级烷酯组成的有机溶剂中，加入催化剂，然后将所得的悬浮液与磷酸化试剂在-30℃-20℃的温度下接触使核苷进行磷酸化，得到5’-核苷酸；所述的核苷与催化剂的重量比是100∶0.5-1.5。该方法可以制得高纯度和高收率的5’-核苷酸，缩短了核苷磷酸化反应的时间，使在核苷酸纯化时杂质的去除更加容易，降低后处理难度。
文档编号C07H1/02GK101921296SQ20101019992
公开日2010年12月22日 申请日期2010年6月10日 优先权日2010年6月10日
发明者任洪发, 宁异真, 林晓, 欧仁树, 王晓明, 王海波, 鲁立, 黄桂基 申请人:广东肇庆星湖生物科技股份有限公司