靶核酸的检测方法
【专利摘要】本说明书的公开内容提供一种可实现高效的探针杂交的靶核酸的检测方法。因此，使用包含与靶核酸预先关联的检测用探针互补的标记序列和识别靶核酸中第1碱基序列的第1识别序列、在所述标记序列和所述第1识别序列之间具有可抑制或停止DNA聚合酶反应的连接部位的第1引物、和包含识别所述靶核酸中的第2碱基序列的第2识别序列的第2引物，扩增靶核酸，使其扩增片段和检测用探针可进行杂交地接触，检测杂交产物。
【专利说明】靶核酸的检测方法
【技术领域】
[0001]本说明书涉及一种检测靶核酸的技术。
【背景技术】
[0002]—直以来，作为用于生物个体的基因分析或调查生物样本中病毒或细菌等的存在的方法，提出了全面地检测、鉴定、进一步定量核酸序列的方法。在该分析等中，通常，预先制备与靶向的核酸序列关联的探针等，利用该探针等与根据核酸扩增法从生物样本扩增的DNA片段的杂交，用结合在探针或DNA片段上的标记物质检测靶核酸等。
[0003]例如，记载了在根据核酸扩增法扩增的DNA片段的两端上以包括可以结合特定物质的碱基序列的方式设计引物，利用这种特定物质来检测DNA片段的方法(专利文献I)。
[0004]另外，开发了专门检测单核苷酸多态性(SNP)的阵列(例如专利文献2、3，非专利文献I)。该方法中，预先制备具有人工碱基序列的检测用探针，设计了可以扩增DNA片段的样本制备步骤，该DNA片段具有结合于该人工碱基序列上的碱基序列。
[0005]此外，公开了使用阵列目视从细菌中提取出的DNA来检测结核菌的药剂感受性的方法(非专利文献2)。
[0006]PCR等核酸扩增法通常扩增作为目标的双链部分。因此，核酸扩增产物也呈双链。通过使双链热变性形成单链，使单链的一部分与寡核苷酸等探针杂交，检测是否为目标扩增产物。
[0007]但是通过热变性使单链和探针杂交，有时会降低杂交效率。
·[0008]现有技术文献:
[0009]专利文献
[0010]专利文献1:国际公开第2009 / 034842
[0011]专利文献2:特开2006-211982号公报
[0012]专利文献3:特开2006-101844号公报
[0013]非专利文献
[0014]非专利文献I !Analytical Biochemistry364 (2007), 78-85
[0015]非专利文献2:临床微生物迅速诊断研究会志14:45-50
【发明内容】
[0016]所述专利文献I中记载的方法中，扩增DNA片段的特定物质结合部位(可结合特定物质的特定碱基序列)由特定物质识别，并结合于该特定碱基序列上。但是，扩增DNA片段在其特定碱基序列上与其互补链形成双链，不是容易与特定物质发生相互作用的单链状态。因此，特定物质识别特定碱基序列的效率不那么高，需要浓缩结合特定物质后的双链片段。
[0017]另外，所述专利文献2、3及非专利文献I中记载的方法中，标记步骤中，使单向引物浓度相对提高来进行扩增(也称非对称PCR)等，有目的性地选择性地扩增与阵列上的探针反应一侧的DNA链，从而提高反应性。但是，这种非对称的PCR中，有扩增效率本身降低的倾向。
[0018]另外，非专利文献2中记载的方法中，可目视检测结核菌DNA，但在从细菌中提取出的DNA适用于阵列之前需要热变性。
[0019]一般的探针杂交中，作为样本用的DNA扩增片段仍是双链，为有效率地进行与探针的杂交，一般进行热变性或碱变性来形成单链。但是，变性的扩增片段逐渐地恢复成双链，有可能降低杂交效率。另外，抑制该现象时，有时候需要最优化杂交时间或温度等条件。
[0020]另外，也考虑将得到的DNA双链的核酸5’末端上具有单链(以下，也称标记链)的DNA部分双链作为核酸扩增反应的扩增产物的方法。该方法中作为扩增产物的DNA部分双链可以在两端与其他的DNA链等杂交。因此，可用该DNA部分双链的一条标记链和探针杂交，另一条标记链和标识探针杂交等。该方法中，有可以省略热变性步骤的优点，但本案
【发明者】认为还存在以下的问题点。即，使用这种DNA部分双链的时，存在标记链的碱基序列的设计上的难度提高的问题。即，DNA部分双链上有2个标记链，并且用该部分双链检测I个靶核酸时，需要一条标记链采用和该靶核酸特异性地杂交的序列，另一条标记链采用不和该靶核酸杂交、不阻碍(不干涉)上述一条标记链和靶核酸的杂交的序列。另外，想要同时检测多个靶核酸时，需要两条标记链不干涉并非该DNA部分双链目标的其他靶核酸。此外，需要以两条标记链互相不杂交的方式设计碱基序列。
[0021]此外，该方法中，设定扩增条件的难度变高。即，因为不参与扩增的剩余的标记链各自结合到正向、反向的两个引物上。
[0022]结果为，该方法中，扩增步骤或核酸色谱法的杂交步骤中会有效率下降或由错误杂交(Mishybridization)引起的检测精确度下降的可能。特别是可知，核酸色谱法中，由于有展开溶剂的移动或蒸发的因素，因此与所谓的将阵列浸溃在杂交液中的浸溃型杂交相比也有杂交效率低的问题。
[0023]鉴于以上的现状，本说明书提供一种可以解决以往的探针杂交中样本DNA片段中的问题、实现高效的探针杂交的靶核酸的检测方法、以及该方法中使用的基因扩增剂及杂交用组合物。
[0024]另外，说明书提供一种更实用的，即，可以用简易的操作并且以高准确度检测靶核酸的靶核酸检测方法以及用于该检测方法的试剂盒等。
[0025]解决问题的方法
[0026]本案
【发明者】从提高适用于探针杂交时与探针杂交的效率、灵敏度的观点出发，就核酸扩增法的修饰进行研究。各种研究结果得到如下见解:在核酸扩增中使用的引物的一部分上导入可以抑制或停止聚合酶反应进行的部位，可提高杂交效率，提高检测灵敏度。另外，得到可以不需要热变性，短时间就可以进行高灵敏度的杂交的见解。本说明基于这些见解提供以下的手段。
[0027]( I) 一种检测样本中靶核酸的方法，其具有:
[0028]制备固相体的步骤，该固相体具备具有各自不同的特定的碱基序列的检测用探针；
[0029]使用第I引物和第2引物实施所述样本中的核酸扩增的扩增步骤，第I引物包含预先与所述靶核酸关联的所述检测用探针互补的标记序列和识别所述靶核酸中第I碱基序列的第I识别序列，在所述标记序列及所述第I识别序列之间，具有可以抑制或停止DNA聚合酶反应的连结部位，
[0030]第2引物包含识别所述靶核酸中的第2碱基序列的第2识别序列，
[0031]所述扩增步骤中得到的扩增片段和所述固相体上的所述检测用探针以进行可杂交的接触的杂交步骤，
[0032]检测所述固相体上的所述扩增片段与所述检测用探针的杂交产物的检测步骤。
[0033](2)根据(I)中记载的方法，所述第2引物具有结合了标识物质或其结构可以结合标识物质的标识物质结合区域。
[0034](3)根据(I)或(2)中记载的方法，所述第2引物在所述标识物质结合区域和所述第2识别序列之间，具有所述连结部。
[0035](4)根据(I)中记载的方法，所述扩增步骤为使用核苷三磷酸实施核酸扩增的步骤，所述核苷三磷酸包括具有标识物质的三磷酸核苷衍生物。
[0036](5)根据(I)- (4)中任意一项记载的方法，所述连结部位不包含天然碱基或与天然碱基配对的天然碱基的衍生物。
[0037](6)根据(I)- (5)中任意一项记载的方法，所述连结部位包含介由磷酸二酯键邻接所述引物中的核苷酸、且原子个数为2以上40以下的任选被取代的亚烷基链或聚氧化亚
烷基链。
[0038](7)根据(6)中记载的方法，所述连结部位用以下任意一式表示。
[0039]5，-0-CmH2m-0-3， 式(I)
[0040](式中，5’表示5’端的磷酸二酯键的氧原子，3’表示3’端的磷酸二酯键的磷酸原子，m表示2以上40以下的整数。)，
[0041]或
[0042]5，- (0CnH2n) 1-0-3， 式(2)
[0043](式中，5’表示5’端的磷酸二酯键的氧原子，3’表示3’端的磷酸二酯键的磷酸原子，η表示2以上4以下的整数，I为2以上的整数，(n + I) Xl表示40以下的整数。)
[0044](8)根据(I)- (7)中任意一项记载的方法，所述扩增步骤使用所述第I引物和所述第2引物组成的多个组(set)实施核酸扩增，从而使与多个所述靶核酸预先关联的多个所述检测用探针可被检测出，
[0045]所述杂交步骤使所述扩增步骤中得到的多个所述扩增片段和所述固相体上的所述多个检测用探针进行可杂交的接触，
[0046]所述检测步骤检测所述固相体上的所述多个扩增片段与所述多个检测用探针的杂交产物。
[0047](9)根据(1)-(8)中任意一项记载的方法，所述标记序列碱基数为20以上50以下。
[0048](10)根据(9)中记载的方法，所述碱基数为20`以上25以下。
[0049](11)根据(I)-(IO)中任意一项记载的方法，所述检测用探针的所述特定的序列选自以序列号I一 100表示的碱基序列及其互补序列。
[0050](12)根据(I)-(Il)中任意一项记载的方法，所述检测用探针的所述特定的序列选自用下表中记载的序列号表示的碱基序列及其互补序列。[0051]【表1】
[0052]
【权利要求】
1.一种方法，其为根据核酸色谱法的靶核酸检测方法， 其具备: 杂交步骤，使与I个或2个以上靶核酸关联的I个或2个以上的部分双链核酸、和固相载体上与所述I个或2个以上靶核酸关联的I个或2个以上的探针，通过核酸色谱法在可杂交的条件下进行接触； 检测步骤，检测所述杂交步骤中产生的杂交产物； 对于所述I个或2个以上部分双链核酸，第I条链的5’末端侧上具有作为单链标记部分的可以与所述探针特异性杂交的标记序列，并且至少一部分上具有标识物质或标识物质结合物质。
2.根据权利要求1记载的方法，所述部分双链核酸在第2条链的5’末端侧上具有所述标识物质或所述标识物质结合物质。
3.根据权利要求1或2记载的方法，所述杂交步骤之前，具备使用第I引物和第2引物，对靶核酸实施扩增反应得到所述部分双链核酸作为扩增产物的扩增步骤，其中所述第I引物含有所述标记序列和识别所述靶核酸第I碱基序列的第I识别序列，在所述标记序列和所述第I识别序列之间具有可以抑制或停止DNA聚合酶反应的连结部位；所述第2引物具有识别所述靶核酸第2碱基序列的第2识别序列和所述标识物质或所述标识物质结合物质。
4.根据权利要求1或2记载的方法，所述杂交步骤之前，具备使用第I引物、第2引物I和第2引物II，对靶核酸实施扩增反应得到所述部分双链核酸作为扩增产物的扩增步骤，其中所述第I引物含 有所述标记序列和识别所述靶核酸第I碱基序列的第I识别序列，在所述标记序列和所述第I识别序列之间具有可以抑制或停止DNA聚合酶反应的连结部位；所述第2引物I含有标识用序列和识别所述靶核酸中第2碱基序列的第2识别序列；所述第2引物II含有所述标识物质或所述标识物质结合物质和所述标识用序列。
5.根据权利要求1或2记载的方法，所述杂交步骤之前，具备使用第I引物、第2引物I，在含有所述标识物质或所述标识物质结合物质和与所述标识用序列特异性杂交的序列的标识用探针的存在下，对靶核酸实施扩增反应得到部分双链核酸与所述标识用探针的复合物的扩增步骤，其中所述第I引物含有所述标记序列和识别所述靶核酸第I碱基序列的第I识别序列，在所述标记序列和所述第I识别序列之间具有可以抑制或停止DNA聚合酶反应的连结部位；所述第2引物I含有标识用序列和识别所述靶核酸中第2碱基序列的第2识别序列。
6.根据权利要求1记载的方法，所述部分双链核酸的双链部分上具备所述标识物质或所述标识物质结合物质。
7.根据权利要求1或6记载的方法，所述杂交步骤之前，具备使用第I引物和第2引物、同时使用包括具备所述标识物质或所述标识物质结合物质的三磷酸核苷衍生物在内的核苷三磷酸，对靶核酸实施扩增反应得到所述部分双链核酸作为扩增产物的扩增步骤，其中所述第I引物含有所述标记序列和识别所述靶核酸第I碱基序列的第I识别序列，在所述标记序列和所述第I识别序列之间具有可以抑制或停止DNA聚合酶反应的连结部位；所述第2引物具有识别所述靶核酸第2碱基序列的第2识别序列。
8.根据权利要求1-7中任一项记载的方法，使包含扩增反应液的展开溶剂和所述固相载体的一部分接触，实施所述杂交步骤，所述扩增反应液含有所述扩增步骤后的所述扩增产物。
9.根据权利要求8记载的方法，制备包含扩增反应液和结合于所述标识物质结合物质的标识物质的所述展开溶剂，使该展开溶剂和所述固相载体的至少一部分接触，实施所述杂交步骤，所述扩增反应液含有所述扩增步骤后的所述扩增产物。
10.根据权利要求9记载的方法，实施所述扩增步骤，在保持所述扩增反应溶液的腔中至少供给所述标识物质，制备所述展开溶剂，使所述展开溶剂和所述固相载体的一部分在所述腔内接触。
11.根据权利要求1-10中任一项记载的方法，所述标识物质结合物质选自包括抗原抗体反应中的抗体和生物素、地高辛及FITC等在内的半抗原中的I种或2种以上， 所述标识物质为具备可以和标识物质结合物质结合的部位，为利用选自荧光、放射能、酶、磷光、化学发光及染色中的I种或2种以上的标识物质。
12.色谱仪主体，其为根据权利要求1-11中任一项记载的靶核酸的检测方法中使用的色谱仪主体， 其具备 固相载体， 固定配置于所述固相载 体不同位置上的所述探针的、互相平行的3个以上的线性探针区域，和 配置于与所述固相载体上的所述3个以上探针区域不同的位置上、呈互相平行状并相对于所述探针区域也呈平行状的2个以上的位置标识区域， 在所述2个以上位置标识区域中的2个位置标识区域之间，以等间隔状配置所述3个以上探针区域中的3个探针区域。
13.根据权利要求12记载的色谱仪主体，在与固定所述2个位置标记的所述3个探针区域的一侧的相反侧上，以与所述3个探针区域间的间隔等间隔地配置I个以上所述探针区域。
14.根据权利要求12或13记载的色谱仪主体，所述固相体具备:用于在其I个端部上与核酸色谱法的展开溶剂接触的末端细小状的液体接触部或液体接触部形成标记。
15.根据权利要求14记载的色谱仪主体，所述液体接触部形成标记为:使得可看到用于切割所述固相体的一部分形成所述液体接触部的切割部位的标记。
16.根据权利要求15记载的色谱仪主体，所述标记具有沿着所述标记可切割所述固相体的脆弱性。
17.一种方法，其为检测样本中靶核酸的方法， 其具有: 制备固相体的步骤，该固相体具备具有各自不同的特定碱基序列的检测用探针； 使用第I引物和第2引物对所述样本中的核酸实施扩增的扩增步骤， 第I引物包含预先与所述靶核酸关联的所述检测用探针的互补标记序列和识别所述靶核酸中第I碱基序列的第I识别序列，在所述标记序列及所述第I识别序列之间，具有可抑制或停止DNA聚合酶反应的连结部位， 第2引物包含识别所述靶核酸中的第2碱基序列的第2识别序列；所述扩增步骤中得到的扩增片段和所述固相体上的所述检测用探针以可杂交的方式进行接触的杂交步骤； 检测所述固相体上的所述扩增片段与所述检测用探针的杂交产物的检测步骤。
18.根据权利要求17记载的方法，所述第2引物具有结合标记物质或以能结合标记物质的方式构成的标记物质结合区域。
19.根据权利要求17或18记载的方法，所述第2引物在所述标识物质结合区域和所述第2识别序列之间，具有所述连结部。
20.根据权利要求17记载的方法，所述扩增步骤为使用包括具有标识物质的三磷酸核苷衍生物在内的核苷三磷酸实施核酸扩增的步骤。
21.根据权利要求17-20中任一项记载的方法，所述连结部位不包含天然碱基或与天然碱基配对的天然碱基的衍生物。
22.根据权利要求17-22中任一项记载的方法，所述连结部位介由磷酸二酯键邻接于所述引物中的核苷酸，包含原子个数为2以上40以下的任选被取代的亚烷基链或聚氧化亚烷基链。
23.根据权利要求22记载的方法，所述连结部位用以下任一个式表示。 5’ -0-CmH2m-0_3 ’ 式(I) (式中，5’表示5’端的磷酸二酯键的氧原子，3’表示3’端的磷酸二酯键的磷酸原子，m表示2以上40以下的整数。)， 或，
- (OCnH2n) !-O-Sj 式(2) (式中，5’表示5’端的磷酸二酯键的氧原子，3’表示3’端的磷酸二酯键的磷酸原子，η表示2以上4以下的整数，I为2以上的整数，(n + I) X I表示40以下的整数。)。
24.根据权利要求17-23中任一项记载的方法， 所述扩增步骤为:使用所述第I引物和所述第2引物组成的多个组实施核酸扩增，以能用与多个所述靶核酸预先关联的多个所述检测用探针进行检测， 所述杂交步骤为:使所述扩增步骤中得到的多个所述扩增片段、和所述固相体上的所述多个检测用探针以可杂交的方式进行接触的步骤， 所述检测步骤为:检测所述固相体上所述多个扩增断片与所述多个检测用探针的杂交产物的步骤。
25.根据权利要求17-24中任一项记载的方法，所述标记序列的碱基数为20以上50以下。
26.根据权利要求25记载的方法，所述标记序列的碱基数为20以上25以下。
27.根据权利要求17-26中任一项记载的方法， 所述检测用探针的所述特定的序列选自以序列号1-100表示的碱基序列及其互补序列。
28.根据权利要求17-27 中任一项记载的方法， 所述检测用探针的所述特定的序列选自用下表中记载的序列号表示的碱基序列及其互补序列。 【表27】名称 |Seq(5 — 3，)|SEQ.1D.DI—OOl TGTTCTCTGACCAATGAATCTGC?D I—002 TGGAACTGGGAACGCTTTAGATG2Dl-003 TTCGCTTCGTTGTAATTTCGGAC3Dl-005 TAGCCCAGTGATTTATGACATGC5DI—006 CGCTCTGGTTACTATTGGACGTT6Dl— 010 GAGTAGCAGGCAAATACCCTAGA10Dl— 012 AGTCATACAGTGAGGACCAAATG12Dl-014 TGCTCACTTACATTACGTCCATGTiDl-016 AGGTCCGGTAGTAATTTAGGTGC16Dl — 020 TATTCTACCAACGACATCACTGC20Dl-023 CATCTCCAAGAATTGACCCACCA23Dl-025 GAAGGATCGCTTTTATCTGGCAT25Dl — 026 CATTTGTCAGGTACAGTCCACTT26Dl-027 GCCCACACTCTTACTTATCGACT27Dl-030 CCGTCTGGGTTAAAGATTGCTAG30`Dl 一 035 ATGCCGTTGTCAAGAGTTATGGT35Dl — 038 CGCGACATTTAGTCCAGGAGATG38Dl-040 AGACAATTAGAATCAGTGCCCCT40D I—041 GCATTGAGGTATTGTTGCTCCCATlDl — 044 GAGTCCGCAAAAATATAGGAGGC44Dl-045 GCCTCACATAACTGGAGAAACCT45Dl-050 GGGATAGGTATTATGCTCCAGCC50Dl-052 GCCTATATGAACCAAGCCACTGC52
29.根据权利要求17— 28中任一项记载的方法， 所述杂交步骤包括:对具备多个所述检测用探针的所述固相体供给作为移动相的包含所述扩增片段的液 体，相对于所述固相体展开所述移动相。
30.核酸扩增法中使用的核酸扩增剂，从5’侧包括笫I任意碱基序列和识别待扩增的核酸中的第I碱基序列的第I识别序列，在所述第I任意碱基序列和所述第I识别序列之间包含具有可抑制或停止DNA聚合酶反应的连结部位的寡核苷酸衍生物。
31.根据权利要求30记载的核酸扩增剂，所述第I碱基序列上结合标识。
32.一种核酸扩增用试剂盒，其包括2种以上权利要求30或31记载的核酸扩增剂。
33.一种探针杂交用组合物，其包含DNA双链片段，该DNA双链片段为在至少一条链的5’侧上有单链部分，具有基于碱基配对的双链部分的DNA双链片段；至少一条DNA链在所述单链部分和所述双链结合部分之间具有可抑制或停止DNA聚合酶反应的连结部位，所述单链部分具有识别探针中的碱基序列的识别序列。
34.根据权利要求33记载的探针杂交用组合物，另一条链的5’侧也有单链部分，在该单链部分上连结标识。
35.一种DNA双链片段，其为至少一条链的5’端上有单链部分，并具有基于碱基配对的双链部分的DNA双链片段；至少一条DNA链在所述单链部分和所述双链结合部分之间具有可抑制或停止DNA聚合酶反应的连结部位。
36.一种方法，其为扩增样本中靶核酸的方法， 其具备:至少使用第I引物实施所述样本核酸扩增的步骤，所述第I引物包含第I任意碱基序列和识别所述靶核酸中第I碱基序列的第I识别序列，在所述第I任意碱基序列和所述第I识别序列之间具有可抑制或停止DNA聚合酶反应的连结部位。
37.色谱仪主体,其为根据权利要求29记载的靶核酸的检测方法中使用的色谱仪主体，其具备 固相载体， 固定配置于所述固相载体不同位置上的所述探针的、互相平行的3个以上的线性探针区域，和 配置于与所述固相载体上的所述3个以上探针区域不同的位置上、呈互相平行状并相对于所述探针区域也呈平行状 的2个以上的位置标识区域， 在所述2个以上位置标识区域中的2个位置标识区域之间，以等间隔状配置所述3个以上探针区域中的3个探针区域。。
【文档编号】C12Q1/68GK103797119SQ201280045065
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2012年9月14日 优先权日:2011年9月14日
【发明者】丹羽孝介, 广田寿一, 川濑三雄 申请人:日本碍子株式会社