专利名称：核糖核酸的工业化生产方法
核糖核酸的工业化生产方法技术领域-本发明涉及一种核糖核酸(RNA)的生产方法，尤其是一种操作简单、所 产核糖核酸纯度高、产量大，适合于大规模生产且安全可靠的核糖核酸的工业 化生产方法。
背景技术：
-核酸，学术定义上包括核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)，是生 物遗传功能的物质基础，因此地球上的所有生物都含有核酸，核酸制品也己成 为食品、医药等领域应用的高营养物质，因此，人们正着手研究大规模生产核 酸的方法。1. 为了改造物种，创造一类更有利于人类生存的生物体，基因工程在全世 界受到科学家的重视，基因工程的核心技术是遗传物质核酸的重组、转化、转 导及其排列顺序的测定和结构改变，许多工作离不开核酸抽提、纯化，但这方 面的研究只是在实验室里精细地操作，其核酸只能以克来计，不能实现核酸的 大规模生产。2. 草本和木本植物虽然在地球上的数量最大，但核酸含量很低，不能用作 核酸提取的原料。3. 微生物类群中，有的细菌和病毒核酸含量虽然高达50%以上，但是要 想大量获得这类细菌或病毒是非常困难的，经济成本得不偿失。虽然己有报道可培养一种细菌，能在胞外产生脱氧核糖核酸或核糖核酸， 但其最高产率也只能达到5g/L,远不能达到工业化生产的目标。目前，国内外大部分都是使用假丝酵母(Candida)作为大规模生产核酸的 菌株，但是所生产的核酸制品未见在食品上安全使用的报道。我国卫生部所提供的可用于保健食品的真菌目录，首选是酿酒酵母，而酿 酒酵母确是人类最早利用的微生物之一，它生长繁殖快，容易进行大规模培养， 不仅富含核糖核酸(一般含核酸6 8%)，而且还含有较高的蛋白质、维生素、 微量元素等生理结构物质，提取核酸后的副产品脱核酵母菌体回收率可达50% 以上，蛋白质含量也达到50%左右，是一种高蛋白饲料。目前，国内有以在啤酒生产过程中第6、 7代以后的啤酒废弃酵母为原料提取核酸的，但却存在着资 源分散、原料数量有限、所产核酸纯度不高的问题，因此虽然用啤酒废酵母可 以提取核酸，但是仍然不能大规模生产。酿酒酵母Y37 (Saccharomyces cerevisiae)是与啤酒生产同一种属的酿酒酵 母，亦是上述我国卫生部所提供的可用于保健食品的真菌之一，但是迄今为止 还没有关于发酵培养酿酒酵母Y37所获得的菌体为原料，大规模生产核糖核酸 的任何报道。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种操作简单、 所产核糖核酸纯度高、产量大，适合于大规模生产且安全可靠的核糖核酸的工 业化生产方法。本发明的技术解决方案是 一种核糖核酸的工业化生产方法，其特征在于按以下步骤进行a. 对酿酒酵母Y37菌种进行培养；b. 将所培养的酿酒酵母Y37种子接入发酵罐进行连续发酵，发酵液经离心 得菌体；c. 将所得菌体用高温食盐法抽提核酸，离心取上清液；d. 用棉饼过滤法过滤上清液，得滤液；e. 使滤液中核酸析出沉淀，并对沉淀物洗涤、过滤、干燥。所述的a步骤是将酿酒酵母Y37培养在麦芽汁固体斜面培养基上，29 31 。C，生长31 33小时，接入装有种子培养基的培养瓶中，29 3rC摇瓶培养19 21 小时，再接入装有种子培养基的种子罐中，控制温度33。C 34。C、 PH3.9土0.1， 鼓风培养，直至种子干菌浓度达到0.5% 1%。所述b步骤是将发酵培养基装在发酵罐中，起始的装液系数为0.4 0.42， 接种量14~15%，控制温度34士1'C， PH值3.9士0.1，当干菌浓度达到1.5%后 进入连续发酵。所述的种子和发酵培养基的组分及每升所含重量如下清糖水溶液中的还 原糖30 40g、 (NH4)2S04 1.5 2.5g、 MgS04.7H20 l 2g、 FeS04 0.05 0.10g、 磷酸1 2g，所述清糖水溶液是将甘蔗糖蜜用水稀释1 2倍，加热至95 100°C 保温30 35分钟，吹风鼓泡2 4小时，自然沉降16~18小时后的清液，是种 子和发酵培养基的碳源。所述c步骤是将b步骤所得菌体在氯化钠溶液中90±2°C的温度下抽提2 3小时，折干菌体及氯化钠的重量与水溶液的体积比分别为7~10%、 8~10%， 将抽提液离心分离脱核酵母，取上清液。所述d步骤的是将过滤棉洗净后，经压棉机压干成型，装入板框过滤机， c步骤所得上清液经棉饼过滤机过滤。所述e步骤是将滤后清液冷却至8 10°C ，用食用磷酸调节PH至2.0 2.5， 析出沉淀，用食用酒精洗涤沉淀物并过滤后进入干燥机以80士5'C的温度干燥。将所得干燥物磨粉并取80目标准筛的筛下物。本发明是将酿酒酵母Y37培养、在发酵罐中进行连续发酵取得高核糖核酸 含量(16%)的菌体，经高温食盐法提取核糖核酸，核糖核酸的提取率10 12% (W/W)，用棉饼过滤机过滤以滤除胶体蛋白等杂质，克服了现有等电点沉淀 法、凝聚剂络合法、超滤过滤法等许多过滤方法的不足，使制品中核糖核酸的 含量大于90%，具有操作简单、所产核糖核酸纯度高、产量大，适合于大规模 生产等特点。
具体实施方式
-实施例1:a. 对酿酒酵母Y37菌种进行培养，(原始菌株酿酒酵母Y37从上海市工业 微生物研究所购得)b. 将所培养的酿酒酵母Y37种子接入发酵罐进行连续发酵，发酵液离心得 菌体；c. 将所得菌体用高温食盐法抽提，离心取上清液；d. 用棉饼过滤法过滤上清液，得滤液；e. 使滤液中核酸析出沉淀，并对沉淀物洗涤、过滤、干燥。 实施例2:1. 制备种子及发酵培养基将甘蔗糖蜜用水稀释1 2倍，加热至95 10(TC保温30分钟，吹风鼓泡2 4小时，自然沉降16小时后的糖水清液为种子和发酵培养基的碳源。 种子和发酵培养基的组份为(g/0:用于碳源的糖水清液，用量以每升培养基含还原糖30 40g为准，除此之 夕卜，还有(NH4)2S04 1.5 2.5、 MgS04'7H20 1 2、 FeS04 0.05 0.10、磷酸1 2。2. 将酿酒酵母Y37培养在麦芽汁固体斜面培养基上，29 3rC，生长31~33小时，接入装有种子培养基的培养瓶中，29 3rC摇瓶培养19~21小时，再接 入装有种子培养基的种子罐中，控制温度33-C 34"C、 PH3.9士0.1，鼓风培养, 直至种子干菌浓度达到0.5% 1%。3.将发酵培养基装在IOO立方米发酵罐中，起始的装液系数为0.4~0.42， 接种量14~15%,控制温度34士rC, PH值3.9士0.1，当干菌浓度达到1.5%后 进入连续发酵，流加同一组份的发酵培养基稳定发酵6 7天后，干菌浓度达到 1.2% 1.5%，酵母细胞核酸含量由开始的9% 11%不断上升，达到16%以上， 每天可获折干高核酸酵母10.5吨以上。4. 发酵液离心得菌体，菌体在氯化钠溶液中90士2'C的温度下抽提2 3 小时，菌体(按折干菌体计)及氯化钠的重量与水溶液的体积比分别为7~10%(w/v)、 8~10% (w/v)，将抽提液离心分离脱核酵母，清液为核糖核酸清液， 核糖核酸对酵母提取率为10 12% (W/W)。5. 将过滤棉洗净后，经压棉机压干成型，装入板框过滤机，将上步骤所得 上清液经棉饼过滤机过滤，除去胶体蛋白等杂质，简易、高效，且保证了产品 核酸含量达90%以上。6. 将滤后清液冷却至8 1(TC，用食用磷酸调节PH至2.0 2.5，析出沉 淀，用食用酒精洗涤沉淀物并过滤后进入闪蒸干燥机以80士5t的温度干燥。7. 将所得干燥物磨粉并取80目标准筛的筛下物。经常规的核酸检验方法检验，所得淡黄色粉末即为成品核糖核酸(RNA)。 成品核糖核酸的纯度》90%,浊度￡40%，水份《8%。经过生产实践，核糖核酸日产量达到1.5吨以上，脱核酵母达到8吨以上， 一年可生产核糖核酸400 500吨。
权利要求
1.一种核糖核酸的工业化生产方法，其特征在于按以下步骤进行a.对酿酒酵母Y37菌种进行培养；b.将所培养的酿酒酵母Y37种子接入发酵罐进行连续发酵，发酵液经离心得菌体；c.将所得菌体用高温食盐法抽提核酸，离心取上清液；d.用棉饼过滤法过滤上清液，得滤液；e.使滤液中核酸析出沉淀，并对沉淀物洗涤、过滤、干燥。
2. 根据权利要求1所述的核糖核酸的工业化生产方法，其特征在于所 述的a步骤是将酿酒酵母Y37培养在麦芽汁固体斜面培养基上，29~31°C，生 长31 33小时，接入装有种子培养基的培养瓶中，29 31'C摇瓶培养19 21小 时，再接入装有种子培养基的种子罐中，控制温度33。C 34'C、 PH3.9土0.1， 鼓风培养，直至种子千菌浓度达到0.5% 1%。
3. 根据权利要求2所述的核糖核酸的工业化生产方法，其特征在于所述 b步骤是将发酵培养基装在发酵罐中，起始的装液系数为0.4-0.42，接种量 14~15%，控制温度34士rC， PH值3.9土0.1，当干菌浓度达到1.5%后进入连 续发酵。
4. 根据权利要求2或3所述的核糖核酸的工业化生产方法，其特征在于 所述的种子和发酵培养基的组分及每升所含重量如下清糖水溶液中的还原糖 30 40克、(NH4)2S04 1.5 2.5克、MgS04'7H20 1 2克、FeS04 0.05 0.10克、 磷酸1 2克，所述清糖水溶液是将甘蔗糖蜜用水稀释1 2倍，加热至95 10(TC保温30 35分钟，吹风鼓泡2 4小时，自然沉降16~18小时后的清液， 是种子和发酵培养基的碳源。
5. 根据权利要求4所述的核糖核酸的工业化生产方法，其特征在于所 述c步骤是将b步骤所得菌体在氯化钠溶液中，90士2'C的温度下抽提2 3小 时，折干菌体及氯化钠的重量与水溶液的体积比分别为7~10%、 8 10%，将抽 提液离心分离脱核酵母，取上清液。
6. 根据权利要求5所述的核糖核酸的工业化生产方法，其特征在于所 述d步骤是将过滤棉洗净后，经压棉机压干成型，装入板框过滤机，c步骤所 得上清液经棉饼过滤机过滤。
7. 根据权利要求6所述的核糖核酸的工业化生产方法，其特征在于所述 e步骤是将滤后清液冷却至8 10'C，用食用磷酸调节PH至2.0 2.5，析出沉 淀，用食用酒精洗涤沉淀物并过滤后进入干燥机以80士5"C的温度干燥。
8. 根据权利要求7所述的核糖核酸的工业化生产方法，其特征在于将所 得干燥物磨粉并取80目标准筛的筛下物。
全文摘要
本发明公开一种核糖核酸的工业化生产方法，是将酿酒酵母Y37培养、在发酵罐中进行连续发酵取得高核糖核酸含量(16％)的菌体，经高温食盐法提取核糖核酸，核糖核酸的总收率大于10％(W/W)，用棉饼过滤机过滤以滤除胶体蛋白等杂质，克服了现有等电点沉淀法、凝聚剂络合法、超滤过滤法等许多过滤方法的不足，使制品中核糖核酸的含量大于90％，具有操作简单、所产核糖核酸纯度高、产量大，适合于大规模生产等特点。
文档编号C12P19/00GK101402985SQ20081022881
公开日2009年4月8日 申请日期2008年11月17日 优先权日2008年11月17日
发明者乔宾福, 俞慧君, 方文增, 谢赐福, 黄国新 申请人:珍奥集团股份有限公司