靶核酸的检测方法

专利名称：靶核酸的检测方法
技术领域：
本申请基于2009年10月29日提交的日本专利申请特願2009-249122要求优先权,其全部内容通过引用纳入本申 请。本发明涉及靶核酸的检测技术。
背景技术：
一直以来，作为用于生物个体的基因分析或研究生物样本中的病毒或细菌等感染的方法，提出了全面地检测或者定量核酸序列的方法。例如，作为样本中所含的作为检测对象的核酸序列(靶核酸)的表达量的检测方法，使用微阵列(下文简称为“阵列”)(例如，非专利文献1-4)。阵列是预先将碱基序列已知的多个核酸片段(检测用探针)分别独立地固定于载体上得到的。如图8所示，在现有的阵列方法中，为了识别作为检测对象的靶序列，使用以包含靶序列的方式设计的正向引物(F引物)和反向引物(R引物)，扩增含有靶序列的DNA片段(靶核酸)。然后将扩增的靶核酸分离为单链。接着，阵列上固定的检测用探针具有与靶核酸的特征性部分序列(靶序列)互补的序列的部分和靶序列形成杂合体(杂交)，从而使靶核酸结合于载体上。通过以任意方法检测形成该杂合体的靶核酸，可以研究样本中核酸的有无。另外，开发了专门检测单核苷酸多态性(SNP)的阵列(例如专利文献1、2)。在所述方法中，使用DNA计算机技术，可以检测出样本的靶核酸的SNP的类型。现有技术文献专利文献专利文献I :特开2006-211982号公报专利文献2 :特开2006-101844号公报非专利文献非专利文献I :广M才実験T失敗U々IM検出i定量W,実験医学别冊羊土社第3章_10 74夕口7>4解析W，非专利文献2 =Bioview, No. 45，ppl4_18，2004 夕力 9 八 4 才非专利文献3 : 才f夕)口 -7'> 'J 一文' DNA千，7。応用技術 '> 一工A —社第5章実際i子Q応用非专利文献4 :厚生労働科学研究費補助金食品CO安心 安全確保推進事業P ^吵石健康食品O有効性O評価t二関+ 3研究(平成18年度総括 分担研究報告)

发明内容
发明要解决的问题在上述非专利文献1-4记载的方法中，阵列上固定的检测用探针与靶序列杂交，但是该杂交反应需要很长时间。而且，检测用探针有可能非特异性地结合与靶序列有相似性(同源性)的其他核酸序列。即,在检测样本中含有多种靶核酸时,有可能不能正确地检测靶核酸的有无。对于非特异性结合的问题，在非专利文献2中记载了通过缩短检测用探针从而可以最小化同源性，但如果缩短检测用探针，则检测时的标识信号降低。另外，在非专利文献4中记载了通过升高杂交时的温度可以减少非特异性结合，但是在通过这种方法也不能解决问题时，需要再设计检测用探针的序列并再制作阵列。因此，阵列的使用者需要研究同源性的影响。获得针对合适靶核酸的合适检测体系的加工步骤工作量极大。另一方面，专利文献1，2记载的方法是专门检测SNP的方法，其可以更精确地检测SNP，但是有检测一种SNP需要七种探针、且操作繁杂的问题。而且，由于有在杂交至阵列前连接靶核酸的扩增副产物的操作，因此给使用者带来了探针设计的麻烦。如上所述，通过现有方法构建所针对的靶核酸的检测体系需要付出很大努力。另夕卜，在短时间内更精确地检测靶核酸也很困难。因此，本说明书的公开内容的目的是提供一种能够有效地构建靶核酸的检测体系的靶核酸检测方法。解决问题的方法为了有效地构建检测体系，本发明人对在载体上固定的检测用探针和靶核酸在保持选择性的同时有效地杂交的方法进行了各种研究。其结果是得出以下结论在通过固相载体上的杂交反应的基于靶核酸的序列特异性的检测体系中，检测体系的有效构建非常困难。并且发现，通过使用以能特异性杂交的方式预先设计的多组检测用探针和标签序列，使标签序列结合于靶核酸，可以省略对杂交条件的研究，而且可以排除非特异性结合并且可以实现高选择性。而且还发现，不用使用靶序列特异的探针连接所述嵌合靶核酸，而使用与同源性低的部分序列即靶序列的特征性序列能特异性杂交的引物扩增标识的靶核酸，藉此可以减少标识的靶核酸与检测用探针的非特异性结合。基于所述发现提供以下手段。本说明书的公开内容涉及样本中的靶核酸的检测方法。本检测方法可以包括以下步骤制备包含检测用探针的固相体的步骤，所述检测用探针各自具有不同的给定碱基序列；对所述样本进行PCR，从而获得具有预先与所述靶核酸关联的与所述检测用探针互补的标签序列和标识的嵌合DNA的步骤；使所述嵌合DNA和所述检测用探针以能通过所述标签序列杂交的方式接触的步骤；基于所述固相体上的所述标识获得信号强度信息的步骤；和基于所述信号强度信息检测所述靶核酸的步骤。本检测的所述PCR步骤可以包括制备第I引物和第2引物，使用所述第I引物和所述第2引物对所述样本进行PCR，合成具有所述靶序列、所述标签序列和所述标识的嵌合DNA，其中所述第I引物具有与前述靶核酸中的靶序列互补的识别用序列和与所述标签序列互补的标签添加用序列，所述第2引物具有与同所述靶序列邻接的部分序列一致的部分序列和标识。另外，在所述PCR步骤中，对于两个以上的所述靶核酸，可以使用2个以上的所述第I引物和两个以上的所述靶核酸共通的I个所述第2引物。另外，在所述PCR步骤中，可以通过非对称PCR扩增所述嵌合DNA。使用包含能与预先与所述靶核酸关联的标签序列杂交的检测用探针的阵列，可以检测靶核酸。


图I :本发明的检测方法的一个实例的概要的示意图。图2 :示出本发明中的固相载体和固相载体上的检测用探针和嵌合DNA的关系的图。图3 :示出本发明中的经标识靶核酸的扩增步骤的图。图4 :示出阵列制作和靶制备的流程的图。图5 出用于检测用探针的喊基序列的表。图6 :示出本发明的实施例获得的检测结果的图。图7 :示出现有方法的实施例获得的检测结果的图。图8 :示出现有的靶核酸检测方法的一个实例的图。
具体实施例方式
本发明涉及用于检测作为检测对象的靶核酸中的靶序列的阵列。根据本发明的靶核酸的检测方法，由于制备了包含各自具有不同的固有碱基序列的多个检测用探针的固相载体，所以回避了为了构建针对每个靶核酸设计并固定检测用探针的检测体系而进行的操作。另外，通过对所述样本进行PCR，以获得具有预先与所述靶核酸关联的与所述检测用探针互补的检测用序列和标识的嵌合DNA，从而可在制备杂交用DNA的PCR中，获得靶核酸特异的且被标识的嵌合DNA，所述嵌合DNA识别靶核酸，并且具有已与检测用探针关联的检测用序列。另外，通过使用检测用序列使嵌合DNA和检测用探针杂交，基于预先关联的检测用探针和检测用序列，嵌合DNA与检测用探针杂交，因此有效地减少或回避了杂交时的非特异性结合。另外，根据本说明书的公开内容，在进行PCR时，通过使用第I引物和第2引物，减少或回避了探针或引物设计时的繁杂，其中所述第I引物具有与靶核酸中的靶序列互补的识别用序列和标签添加用序列，所述第2引物具有同靶序列邻接的部分序列和标识。另外，通过使用所述引物系列，可以简单地制备直接识别靶序列且靶核酸特异的用于与检测用探针杂交的嵌合DNA。所述方法除了确实可以检测靶核酸有多个时的各靶核酸外，还可以用于检测核酸中的单核苷酸多态性(SNP)或基因改变的核酸中的改变位点，以及检测RNA等表达基因。即，对于靶核酸中的多态性或突变，通过以与作为检测对象的突变相同的概念获得嵌合DNA，可以检测靶核酸中的SNP、改变位点、表达基因、多态性或突变等。图4概括地示出了用于检测靶核酸的阵列制作和靶制备的方案。图4的方案一并示出了本说明书公开的方法以及现有的检测方法的流程图。以实线表示的步骤是本说明书公开的方法和现有方法共通的步骤，以虚线表示的步骤是仅现有方法必需的步骤。在现有方法中，为了制作各靶核酸的阵列，要进行多个步骤。首先，获得作为检测对象的靶核酸的序列信息，并参照所述序列信息设计检测用探针。基于设计合成检测用探针，制备阵列用的斑点溶液并固定阵列。另一方面，从样本中提取、纯化作为检测对象的靶核酸(RNA或DNA等靶)。接着，设计用于扩增靶核酸的引物，添加标识并合成所述引物。之后，使用合成的引物扩增靶核酸。接着，使扩增的靶核酸和制作的阵列上的检测用探针进行杂交(hybridization)。再通过检测阵列上的标识信号，检查杂交的进行，并将所得的标识信号数值化。在本文中，在所得结果是异常的或者没有获得荧光信号自身等非预期结果时，如图4的实线和虚线所示，必须要再次设计阵列或者重新制备样本。例如，在非专利文献1-4公开的现有方法中，需要对杂交条件、引物以及阵列上的检测用探针序列等进行诸多反复研究。特别是在作为检测用探针的寡聚DNA或查询探针序列的再设计和合成上会花费很多时间。在本发明的方法中，检测用探针或查询探针仅选自100种序列即可(参照序列表)。另外，在专利文献5-6中记载的方法中，对一种靶序列的检测需要七种引物和探针，然而在本发明中，对一种靶序列的检测有两种引物即可。另一方面，在本说明书中公开的方法中，仅需制备包含多个预先确定的各自具有固有的检测用序列的检测用探针的阵列就足矣，无需考虑靶核酸。由于无需考虑作为检测对象的靶核酸即可应用所述阵列，因此如现有方法那样对各靶核酸的探针的设计、合成、固定化、杂交条件的研究均被回避。另外，在本说明书中公开的方法中，仅主要研究制备靶制备时的引物设计，即可构建检测体系。而且，通过本说明书公开的方法，可以制备杂交条件最适化的检测用探针，因此可 以在短时间内更精确地检测靶核酸。另外，本说明书中的“核酸”包括包含cDNA、基因组DNA、合成DNA、mRNA、全RNA、hnRNA和合成RNA在内的全部DNA和RNA、以及肽核酸、吗啉核酸、甲基磷酸核酸和S-寡聚核酸等人工合成核酸。此外，可以是单链或者双链。另外，本说明书中的“靶核酸”是具有任意序列的任意核酸。典型地，可以列举可能具有对体质、遗传病、癌等特定疾患的发病、疾患诊断、治疗预后、药剂或治疗的选择等成为人或非人动物中的遗传指标的碱基序列的核酸。作为指标，可以列举SNP等多态性或者先天或后天突变。另外，靶核酸也包括病原菌或病毒等微生物来源的核酸。对于靶核酸，可以直接使用后述样本或者其核酸级分，但优选使用全部多个靶核酸经扩增得到的扩增产物，优选地，通过借由PCR的扩增反应，更优选地，通过借由多重PCR的扩增反应。本说明书中的“样本”是指可能含有靶核酸的样本。作为样本，可以使用包括细胞、组织、血液、尿、唾液等在内的含有核酸的任意样本。本领域技术人员适当参照现有技术即可获得含有来自所述各种样本的核酸的级分。本说明书中的“靶序列”是指作为检测对象的靶核酸的特征性的由I个或者2个以上碱基组成的序列。例如，可以是靶核酸之间同源性低的部分序列，也可以是与可能包含在样本中的其他核酸的互补性或者同一性低的序列。靶序列也可以是靶核酸的特征序列。所述靶序列也可以是人为地改变序列所得的序列。下文参照附图对本说明书公开的代表性且非限定性的具体实例进行详细说明。所述详细说明仅意在向本领域技术人员示出实施本说明书的公开内容的优选实例的细节，无意于限定本说明书的公开内容的范围。另外，为了提供进一步改善的靶核酸的检测方法等，下文公开的附加特征以及公开内容可以与其他特征或发明分别地或者共同地使用。另外，下文的具体实施方式
中公开的特征或步骤的组合不是在最广义情况下实施本说明书的公开内容时必需的，而是仅记载用于特别说明本说明书的公开内容的代表性具体实例。另外，对于上述和下述的代表性具体例的各特征、以及独立和从属权利要求中记载的技术方案的各特征，在提供本说明书的公开内容的附加且有用的实施方案时，不是必须按照在此记载的具体例或所列举的顺序进行组合。对于本说明书和/或权利要求记载的全部特征，与实施例和/或权利要求记载的特征的构成不同，其作为对提交申请时的公开内容和权利要求书的特定事项的限定，意在分别地且各自地独立公开。并且，对于全部的数值范围以及类或集合的记载，其作为对提交申请时的公开内容以及权利要求的特定事项的限定，旨在公开其中间构成。图I为本发明的检测方法的原理的示意图。图2示出本发明中使用的固相体100的一个实例，图3示出图I的扩增步骤的细节。另外，图I和图3是用于检测样本中包含的一种靶核酸的检测方法和引物的一个实例。另外，在以下的说明中，在对某碱基序列添加编号并进行说明时，对所述编号添加(_)并进行记载是指与所述碱基序列互补的碱基序列。[靶核酸中的靶序列的检测方法]本说明书中公开的检测方法包括以下步骤制备包含多个检测用探针的固相体的步骤，所述多个检测用探针各自具有不同的固有碱基序列；对所述样本进行PCR，从而获得具有预先与所述靶核酸关联的与所述检测用探针的检测用序列互补的标签序列和标识的嵌合DNA的步骤；使用所述检测用序列和所述标签序列使所述嵌合DNA和所述检测用探针杂交的步骤；基于所述载体上的所述标识获得信号强度信息的步骤；和基于所述信号强度信息检测所述靶核酸的步骤。在本说明书公开的检测方法中，以I种或者2种以上的靶核酸作为适用对象，更详细地，以与所述靶核酸中的特征序列有关的靶序列作为检测对象。下文主要对一种靶核酸的一系列步骤进行说明，但是以下步骤也适用于同时检测多个或者多种靶核酸的情况。(固相载体的制备步骤)如图I所示，本说明书中公开的检测方法(以下简称为本检测方法)可以具有制备固相体100的步骤。所述固相体100可以在实施检测方法前预先制备，也可以商购，或者在每次实施检测方法时制备。如图I所示，固相体100可以在载体102上包含多个检测用探针104，所述检测用探针104各自具有不同的固有碱基序列，即检测用序列106。通过制备所述固相体100，可以回避对探针设计、合成、阵列制作、杂交条件的研究。图2不出固相体100的一例。检测用探针104各自具有用于探测的固有喊基序列，即检测用序列106。所述检测用序列106可以与靶核酸10的特征序列即靶序列12无关地设定。通过与靶序列12无关地设定，可以以下述方式设定检测用探针104的检测用序列106 :即可减少或回避多个检测用探针104之间的非特异性结合，并且考虑适合杂交的温度和时间等杂交条件。另外，无需考虑靶核酸10的种类，总是可以使用相同的检测用探针104。 作为所述检测用探针104的检测用序列106，可以使用例如序列号I-序列号100中记载的碱基序列或与所述碱基序列互补的碱基序列。所述碱基序列全都为相同碱基长度，解链温度(Tm)为40°C以上80°C以下，优选50°C以上70°C以下，在相同条件的杂交中可以得到均质的杂交结果。检测用探针104的检测用序列106可以从所述候选碱基序列中适当选择并使用。所使用的2种以上的检测用探针104的解链温度优选尽可能接近。在希望同时地、全面地检测多个靶核酸10时，优选地进行组合，从而使针对多个靶核酸10分别使用的多个检测用探针104的解链温度相互最接近。例如，在按解链温度的顺序对检测用探针104进行排列时，例如，与希望区别开的2种以上靶核酸10分别对应的2种以上检测用探针104可以从在解链温度的排列中相邻的2种碱基序列中选择。另外，用于与其他靶核酸10对应的检测用探针104的检测用序列106可从与已选择的碱基序列紧邻的碱基序列选择，也可以从隔开的一系列碱基序列选择。优选地，使用与希望同时检测的多个靶核酸10对应的全部检测用探针的解链温度为解链温度排列的一系列碱基序列。另外，解链温度可采用通过GC %法、Wallace法、基于Current Protocols inMolecular Biology的方法(秀润社刊生物实验说明3,可真实扩增的PCR,第25页记载)等算出的值，但优选地，在本发明中，通过引入解链温度的范围和碱基序列浓度的影响的Nearest-Neighbor法算出。采用Nearest-Neighbor法的解链温度可以容易地通过例如Visual OMP (卜U '7'夕；Ws' ^才口夕一株式会社制)的软件或日本基因研究所(http://www. ngrl. co. jp/)提供的软件(OligoCalculator ；http://www. ngrl. co. jp/tool/ngrl_tool. html)获得。另外,序列号I-序列号100按照以VisualOMP算出的解链温度(0. IM探针浓度、50mM Na+离子和I. 5mM Mg+离子)的降序排列。对于所述检测用探针104中的检测用序列106 (也称为标准正交化序列)，可通过计算例如相对于从随机数目获得的给定碱基长度的DNA序列的连续一致长度、通过 Nearest-Neighbor法的解链温度预测、Hamming距离、二级结构预测而进行设计。标准正交化序列为核酸的碱基序列，其指解链温度均一、即以解链温度聚集在一定范围内的方式设计的序列，核酸自身在分子内(intramolecular)构造、不妨碍与互补序列形成杂交的序列，以及不与其互补碱基序列以外的序列形成稳定杂交的碱基序列。包含在一个标准正交化序列群中的序列在所希望的组合之外的序列之间以及自身序列内难以发生反应，或者不发生反应。另外，在PCR中扩增标准正交化序列时，不会受到例如上述交叉杂交之类的问题的影响，与具有该标准正交化序列的核酸初始量相应的量的核酸具有被定量扩增的性质。如上所述的标准正交化序列在 H. Yshida and A. Suyama,“Solution to 3-SAT by breadthfirst search”，DIMACS VI. 54，9-20 (2000)和日本专利申请 2003-108126 中有详细记载。可以使用所述文献中记载的方法设计标准正交化序列。将检测用探针104固定于载体102。作为所述载体102，可以使用固相载体。例如，载体102可以是塑料，也可以是玻璃，对材质没有特别限定。另外，载体102的形状可以是如图I所示的平板状，也可以是珠状，对其形状没有特别限定。优选地，固相体100为载体102为固相平板状、多个检测用探针104以一定的序列固定的阵列(特别是微阵列)。阵列可以固定有多个检测用探针104，并适合同时地、全面地检测各种靶核酸10。另外，固相体100可以具有在载体102上划分开的多个阵列区域。在所述多个阵列区域中，可以分别固定由同一组合形成的检测用探针104的系列，也可以分别固定由不同的组合形成的检测用探针104的系列。如果多个阵列区域中固定不同组合的检测用探针104的系列，则可以分派各个阵列区域，目的是检测不同基因中的靶核酸10。另外，优选的固相体100可以具有将两种以上的检测用探针104以基于其解链温度的顺序排列的排列形式。例如，使用所述固相体100，按照检测用探针104的顺序，分派与2种以上的靶核酸10对应的2种以上的检测用探针104，藉此可以抑制由检测用探针104的检测用序列106的解链温度之差或检测用探针104的固定化位置所致的杂交差异，并更精确地检测样本中的靶核酸10，其中所述2种以上的靶核酸10与可能存在于某基因的某位点的2种以上的靶序列12对应。对检测用探针104的固定化形式没有特别限制。可以是共价结合，也可以是非共价结合。可以通过现有公知的各种方法将检测用探针104固定于载体102的表面。另外，也可以具有适合载体102表面的连接序列。优选地，连接序列为在检测用探针104之间具有相同碱基长度的相同序列。(嵌合DNA获得步骤PCR步骤)如图I所示，PCR步骤可以是对样本进行PCR的步骤，从而获得下述嵌合DNA :所述嵌合DNA具有标识42和预先与靶核酸10关联的能与特定检测用探针104的检测用序列106杂交的标签序列66。通过获得所述嵌合DNA60，无需考虑靶核酸10的靶序列12的碱基序列，即可利用具有预先确定与靶序列12无关的固有检测用序列106的检测用探针104。优选地，标签序列66与检测用探针104的固有检测用序列106以能特异性杂交的程度互补，更优选地，与检测用序列106完全互补。下文对标识进行了描述。对于PCR步骤，只要能获得所述嵌合DNA60即可，对所使用的引物形式无特别限定。下面参照图I对本检测方法中优选的PCR步骤的一个实例进行说明。在图I的右上侧示出了使用第I引物30和第2引物40对样本中的靶核酸10及其互补链20进行PCR，获得作为其扩增产物的嵌合DNA60的步骤。(第I引物)如图I所示，第I引物30具有识别用序列32和标签添加用序列36。制备第I引物30，其数目同靶核酸10的种类。如果推测在某种生物的基因组DNA的给定部分有两种突变，例如有野生型为A、突变型为T的单碱基置换突变时，对于所述部分，靶核酸10有两种。因此，对于该部分，一种靶核酸10具有含有野生型碱基的靶序列12，另一种靶核酸10具有含有突变型碱基的靶序列12。因此，在基因的某位点存在2种靶核酸10时，制备各自具有与各靶核酸10所具有的靶序列12互补的识别用序列32的两种第I引物30。(识别用序列)识别用序列32可以与作为靶核酸10中的特征序列的靶序列12特异性杂交、识别样本中的靶核酸10。识别用序列32以能与靶核酸10的靶序列12以高选择性杂交的程度互补地设定。优选地，完全互补地(特异地)设定。另外，作为识别用序列32，优选的长度因突变的形式而异，因此对其没有特别限定，但优选例如15个碱基以上。通过使识别用序列32的长度为15个碱基以上，可以高选择性与靶序列12杂交。另外，如果识别用序列32在60个碱基以下，则可以减少非特异性杂交，因此是优选的。(标签添加用序列)第I引物30可以具有用于向扩增产物即嵌合DNA60添加标签序列66的标签添加用序列36，目的是使嵌合DNA60能够与检测用探针104的检测用序列106杂交。嵌合DNA60中的标签序列66是检测靶核酸10的序列，因此以能与各靶核酸10的检测用探针104的检测用序列106杂交的方式设定。因此，与一种靶核酸10对应的一种嵌合DNA60与一种检测用探针104对应。另外，优选地，标签序列66与检测用探针104的固有检测用序列106完全互补。因此，优选地，标签添加用序列36为与检测用探针104中用于检测的固有检测用序列106相同的碱基序列。如上所述，制备第I引物30，使其与靶核酸10的靶序列12特异地结合，并且其数目与靶核酸10的种类一样多，藉此形成能特异性地扩增并检测靶核酸10。另外，对于第I引物30，以使PCR扩增产物即嵌合DNA60能特异地结合于与靶核酸10预先关联的特定检测、用探针104的方式形成。
(第2引物)如图I所示，第2引物40可以具有标识42和与同靶核酸10的靶序列12邻接的碱基序列相同的部分序列44。标识42可在其5’侦U。(标识)标识42用于检测PCR扩增产物即嵌合DNA60。作为标识42，可以适当选择并使用现有公知的标识。所述标识可以是自身被激发时发出荧光信号的荧光物质等各种色素，还可以是通过酶反应或抗原抗体反应与第2成分组合发出各种信号的物质。典型地，可以使用Cy3、AleXa555、Cy5、AleXa647等荧光标识物质。另外，也可以使用结合生物素和链霉亲和素HPR并用底物处理等导致的显色来检测。(部分序列)部分序列44由与同靶核酸10的靶序列12邻接的部分序列14相同的碱基序列组成。在此，同靶序列12邻接的部分序列14不是指相对于靶序列12没有间隔一个碱基(核苷酸)地紧邻5’侧，间隔适当个数的碱基(核苷酸)也可以。第2引物40中的部分序列44是用于使第2引物40与靶核酸10的互补链20退火的序列。在检测DNA上的某个突变时，将野生型和突变型两者分别作为靶核酸10设计第I引物30和第2引物40，此时，第2引物40的部分序列44可以为这些靶核酸10所共通。即，可以将部分序列44作为同所述靶核酸10的靶序列12邻接的共通的部分序列。共通的部分序列为与突变无关的共通的碱基序列。因此，可以平均化靶核酸10的扩增效率，并且可以减少所使用的第I引物40。所述部分序列44可以说是具有与构成某个突变的多个靶序列12对应的多个靶核酸10有同源性的序列。如上所述，第2引物40具有标识42和部分序列44，其基于所述部分序列44以能合成作为扩增产物的含有靶序列12的嵌合DNA60的方式形成。另外，在本方法以具有构成突变的多个靶序列12的多个靶核酸10作为对象时，第2引物40可以具有在相同条件下能扩增具有构成突变的多个靶序列12的多个靶核酸10的共通的部分序列44。其次，参照图I和图3对使用所述第I引物30和第2引物40获得嵌合DNA60的步骤进行说明。另外，在以下的说明中，仅对能获得目的嵌合DNA60的PCR反应进行了说明。如图3所示，介由第I引物30的识别用序列32将第I引物30退火至靶核酸10的靶序列12。其结果是，以靶核酸10为模板，以第I引物30为基点，新的DNA链得以延伸，从而合成了包含新合成的部分序列14 (-)的DNA链50。所得DNA链50具有标签添加用序列36、识别用序列32和部分序列14㈠。接下来，介由其部分序列44，第2引物40退火至由此获得的DNA链50的部分序列14㈠。其结果是，以DNA链50为模板，以第2引物40为基点，新的DNA链得以延伸，从而合成了包含与识别用序列32互补的碱基序列和与标签添加用序列36互补的碱基序列的DNA链60。由于识别用序列32为与靶序列12 (-)相同的碱基序列，因此，与识别用序列32互补的碱基序列与靶序列12 —致。与标签添加用序列36互补是指与检测用探针104的固有检测用序列106相同，因此与之互补的碱基序列是与检测用探针104的固有检测用序列106互补的标签序列66。因此，由此获得的DNA链60为将标识42预先与靶序列12和检测用探针104关联的嵌合DNA60。以所述嵌合DNA60为模板进行进一步的扩增反应。
另外，优选地，将获得所述嵌合DNA60的PCR步骤以非对称PCR步骤实施。例如，通过改变第I引物和第2引物的浓度，可进行非对称PCR。由于所获得的嵌合DNA60为双链DNA状态，因此通过将其解离为单链，可供杂交步骤。另外，在本文中提及的解离可通过采用包括诸如化学变性和热变性等的变性处理实现。例如，在通过化学变性解离连接的寡核苷酸时，可以进行碱变性等本领域技术人员已知的处理。在通过热变性解离连接的寡核苷酸时，可以在生理条件下在85°C以上、优选在90°C以上的温度进行，但是本领域技术人员可以选择适当的解离方法。若通过所述PCR步骤，则通过对可能含有靶核酸10的样本进行PCR，可以一举获得通过预先与靶核酸10关联的检测用探针104能特异性检测的嵌合DNA60。另外，无需从PCR反应物回收嵌合DNA60，可以直接进行随后的步骤 。原因在于仅嵌合DNA60结合于检测用探针104并通过标识42检测。另外，也可以通过公知的方法回收嵌合DNA60。例如，可以在单链化后，通过诸如使用适当的固相载体等的公知方法分离回收嵌合DNA50。(杂交步骤)杂交步骤为如下所述的步骤，即在将具有与嵌合DNA60中的标签序列66互补的检测用序列106的检测用探针104固定于载体102的固相体100上，使所述检测用探针104和嵌合DNA60接触从而使其能杂交。如图I和图2(c)所示，在嵌合DNA60与检测用探针104中的检测用序列106在一定条件下以能特异性地杂交的程度互补时，通过所述步骤，它们在杂交的载体102上的给定检测用探针104形成双链。在杂交步骤后，还可以包含适当的洗涤步骤。在杂交步骤中，提供在样本中存在靶核酸10时仅以PCR步骤合成的、并且仅与预先关联的检测用探针104杂交的嵌合DNA60。检测用探针104的检测用序列106和嵌合DNA60的标签序列66以高选择性设计，能高度抑制错误杂交，因此在杂交步骤中嵌合DNA60对检测用探针104的非特异性杂交被高度抑制。(信号强度信息获得步骤)信号强度信息获得步骤是基于杂交后的载体102上的标识42获得靶核酸10的信号强度信息的步骤。根据本发明的信号强度信息获得步骤，通过嵌合DNA60与检测用探针104杂交，可以获得基于标识42的信号强度信息。如图I所示，在信号强度信息获得步骤中，可以检测与固相体100的检测用探针104关联、来自标识42的标识信号48。由于预先获知关联的检测用探针104在固相体100上的位置，因此可以在后续的检测步骤中通过检测标识信号48确定靶核酸10的有无或比例。对于信号强度信息获得步骤，可根据所用的载体102的形态或标识42的种类，适当选择并采用现有公知的方法。典型地，在通过洗涤操作等从载体102除去没有杂交的寡核苷酸等后，可以对添加的标识物质的荧光信号通过阵列扫描等进行检测，或者对标识物质进行化学发光反应。在载体使用珠的情况下，可列举借助流式细胞仪的检测方法。(检测步骤)检测步骤为基于针对检测用探针104所得的标识42的信号强度信息，检测样本中的靶核酸10的有无或比例等的步骤。根据本方法，即便在同时检测多个靶核酸10时，也可确实地检测作为检测对象的靶序列。通过本方法，杂交步骤中对检测用探针104的非特异性结合被高度抑制，因此可以更精确地并以高的检测灵敏度检测靶核酸10，并且可以获得其有无或者比例等。(引物系列)本发明的引物系列包括前述第I引物和第2引物。所述引物系列与固定有检测用探针104的固相体组合，为适合获得前述嵌合DNA的引物系列。例如，第I引物具有检测与相同基因等相关的存在于个体内的突变、或者种或属中存在的差异的特定靶核酸特异的识别用序列32、和预先与检测用序列106关联的标签添加用序列36，第2引物具有标识。引物系列也可以用于检测两种以上的靶核酸。此时，可以含有对各靶核酸特异的第I引物和2种以上靶核酸共通的单一第2引物。本发明的引物系列也可以与固定有前述检测用探针的阵列等的载体制成试剂盒。实施例I下面通过列举实施例对本发明具体说明，但以下实施例不是对本发明的限定。实施例2在以下实施例中，用本发明的检测方法按照以下顺序进行靶核酸的检测。下面按照所述顺序进行说明。(I) DNA微阵列的制作(2)靶核酸和引物的制备和扩增(3)杂交(4)使用扫描仪的检测(5)数据分析(I) DNA微阵列的制作在塑料板上，以溶解有3’末端由氨基修饰的合成寡聚DNA(株式会社日本基因研究所制)的水溶液作为检测用探针，使用日本力' ^ 株式会社的GENESH0T (注册商标)斑点仪(SPOTTER)制作斑点。如表I所示，所使用的合成寡聚DNA序列是文献(AnalyticalBiochemistry 364 (2007) 78-85)的 Supplementary Tablel 记载的 D1001 至 D1100 的 100种(参照图5)。制作斑点后，在80°C进行I小时的烘焙。另外，所述探针按照其Tm为通过VisualOMP算出的解链温度(0. IM探针浓度、50mM Na+离子和I. 5mM Mg+离子)的降序排列。接着按照下述顺序进行合成寡聚DNA的固定化。即，用2XSSC/0. 2% SDS洗涤15分钟，之后用95°C的2XSSC/0. 2% SDS洗涤5分钟，之后重复三次用灭菌水洗涤(上下振荡10次)。之后通过离心(IOOOrpmX3分)脱水。(2)靶核酸和引物的制备和扩增 作为检测对象的样本基因使用口腔内微生物种中的粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)(样本 I)和不解乳假枝杆菌(Pseudorambibacter alactolyticus)(样本 2)2种。各样本的长度为作为微生物的特征序列的周围序列的150bp左右，将由所述碱基序列形成的人工基因作为靶核酸。将用于扩增所述靶核酸的引物按照以下所述人工地合成。第2引物即正向引物(F引物)为Y -AGGTTAAAACTCAAAGGAATTGACG-3'(序列号101)，并且5/侧以Cy3标识。第I引物即反向引物(R引物)按照样本的靶序列制成。样本I的反向引物为 5' -GCAGATTCATTGGTCAGAGAACATATCTCTAGAGTGGT-3'(序列号 102)。样本 2 的反向引物为 5' -CATCTAAAGCGTTCCCAGTTCCATATCTCTATTGCGCT-3'(序列号 103)。接下来如下所述扩增所述样本。另外，作为样本扩增用试剂，使用QIAGEN公司的多重PCR试剂盒。作为热循环仪，使用Applied Biosystems公司的GeneAmp PCRSystem9700o首先，对各样本制备如下所示的试剂。另外，分别将F引物和R引物调整为IOpmol/u I使用。(试剂制备)
dH20 15. Ou I多重PCR试剂盒25. OiUF 引物 3. 75 illR 引物 3. 75 ill样本2.5ul总计50. Ou I接下来，将制备试剂装入热循环仪的板子上，进行热循环反应(95°C 15分后；94°C 30秒、62°C 30秒、72°C 30分，50个循环；72°C 10分，之后降低至4°C )。而且，对扩增的标识样本用QIAGEN公司的MinElutePCR纯化试剂盒纯化，之后确定以所需长度进行了扩+
>曰o(3)杂交为了使⑵所得的扩增样本与固定于微阵列上的检测用探针杂交，制备以下的杂交对照和杂交溶液，并由此制备杂交用试剂。另外，对于杂交对照中使用的Alexa555标识寡聚DNA序列，使用图5中记载的探针中与Dl_100的序列互补的序列的5 ’末端以Alexa555标识的 Alexa555-rDl_100。(杂交对照)Alexa555-rDl_100 10 U ITE (pH8. 0) 390 U I总计400 ill(杂交溶液)20 X SSC 2. Oml10% SDS 0.8ml100% 甲酰胺 12. OmlIOOmM EDTA 0. 8mlmi I IiQ 24. 4mI总计40. Oml(杂交用试剂)杂交对照I. 5 ill杂交溶液9. Oiil小计10. 5 U I标识样本7. 5 ii I
总计18·0μ1使用Applied Biosystems 公司的 GeneAmp PCR system 9700 于 90°C将制备的标识样本溶液加热I分钟，之后使用热封闭液(TAITEC^iDTU-N)于80°C加热I分钟。将上述样本溶液各9 μ I加至微阵列的斑点区域,为防止干燥使用Comfort/plus用ThermoblockSlide (Eppendorf公司)，于37°C静置30分钟，由此进行杂交反应。(洗涤)杂交后，将杂交反应结束后的微阵列基板漫溃于装有以下组成的洗涤液的玻璃染色缸中，上下振荡5分钟，将玻璃基板移入装有灭菌水的染色缸中，上下振荡I分钟，以2000rpm离心干燥I分钟，除去残留于微阵列基板表面的水分。(洗涤液的组成)
mi I IiQ 188. Oml20 X SSC 10. Oml10% SDS 2. Oml总计200. Oml(4)使用扫描仪的检测使用Appleied Precision公司的ArrayWoRx适当调节曝光时间，获得突光照片。再使用GenePix Pro，对所得照片的荧光信号进行数值化。(5)数据分析使用GenePix Pro作为照片的数值化软件，对所得照片的荧光信号进行数值化。图6示出了对样本I和样本2各自是否与检测用探针发生非特异性结合进行验证的结果。如图6(a)所示，在混合样本I和样本2进行反应时，与两者均反应产生了荧光信号，可以检测样本。另外，由图6(b)和(c)所示可知，在不混合样本而是仅以样本I或仅以样本2进行反应时，可以显著减少与不希望的探针的非特异性结合反应。还可知，各样本均特异性结合于以能识别的方式各自设计的检测用探针。接下来，作为比较例，验证了现有的靶核酸的检测方法(非专利文献4的方法)。在以下比较例中，用现有检测方法按照以下顺序检测靶核酸。下面按照所述顺序进行说明。在塑料板上，将溶解有3 ’末端以氨基修饰的合成寡聚DNA (株式会社日本基因研究所制)的水溶液作为检测用探针，使用日本力' ^ 株式会社的GENESH0T (注册商标)斑点仪制作斑点。所使用的合成寡聚DNA序列，5' -ACCACTCTAGAGATA-3'(序列号104)用于样本1，5^ -AGCGCAATAGAGATA-Si (序列号105)用于样本2。在塑料板上制作斑点后，于80°C进行I小时的烘焙，按照Tm的降序排列。作为检测对象的样本基因，使用与实施例一样的样本I、样本2。用于扩增所述靶核酸的共通引物如下所示地人工合成。F引物为Y -AGGTTAAAACTCAAAGGAATTGACG-3'(序列号 106)，5’ 侧以 Cy3 标识。R 引物为 5' -ATGGTGTGACGGGCGGTGTGT-3'(序列号 107)。接下来同上述(3)-(5)那样通过热循环反应扩增样本I和样本2，在与在实施例6制作的检测用探针杂交后、洗涤、进行信号检测。图7示出了对样本I和样本2各自是否与检测用探针发生非特异性结合进行验证的结果。如图7(a)_(c)所示，甚至在样本中不含样本I时，检测到样本I的检测用探针的弱的信号，另一方面，甚至在样本中不含样本2时，也检测到样本2的检测用探针的弱的信号。即，观察到样本的非特异性结合。另外，以现有方法杂交所需的时间为2小时左右。另外，观察到对检测用探针的非特异性反应(荧光强度为10%左右)。另一方面，根据本发明的杂交所必需的时间可以缩短至30分钟左右，对样本的DNA微阵列上的不想要的检测用探针的非特异性反应能够大幅减少(荧光强度不足1%)。因此，通过本发明，可以以杂交温度恒定(37°C左右)且以时间为30分钟左右(现有的1/4)进行。可以得到与现有技术相比更高的信号结果，可以进行与现有技术相比更正确的特定核酸中的喊基检测和序列的确定。另外，在现有方法中，在得到所希望的结果之前，有时需要杂交条件的最适化、探针序列的再设计或者阵列的再制作。与之相对，在本发明中，不必进行探针序列的再设计，阵列的再制作，可以通常相同规格的阵列进行评价。序列用自由正文序列号1-100 :探针；序列号101-103 :引物；序列号104-105 :探针；序列号106-107 :引物权利要求
1.样本中的靶核酸的检测方法，包括以下步骤 制备包含检测用探针的固相体的步骤，所述检测用探针各自具有不同的给定碱基序列； 对所述样本进行PCR，从而获得具有预先与所述靶核酸关联的与所述检测用探针互补的标签序列和标识的嵌合DNA的步骤； 使所述嵌合DNA和所述检测用探针以能通过所述标签序列杂交的方式接触的步骤； 基于所述固相体上的所述标识获得信号强度信息的步骤；和 基于所述信号强度信息检测所述靶核酸的步骤。
2.权利要求I所述的方法，其中在所述PCR步骤中， 制备第I引物和第2引物，所述第I引物具有与所述靶核酸中的靶序列互补的识别用序列和与所述标签序列互补的标签添加用序列，所述第2引物具有与同所述靶序列邻接的部分序列一致的部分序列和标识， 使用所述第I引物和所述第2引物对所述样本进行PCR，从而合成具有所述靶序列、所述标签序列和所述标识的嵌合DNA。
3.权利要求I或2所述的方法，其中对于2个以上的所述靶核酸，所述PCR步骤是使用2个以上的所述第I引物和2个以上的所述靶核酸共通的I个所述第2引物的步骤。
4.权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述PCR步骤是采用非对称PCR扩增所述嵌合DNA的步骤。
5.用于检测权利要求1-4中记载的靶核酸的阵列，其包含能与预先与所述靶核酸关联的标签序列杂交的检测用探针。
全文摘要
本说明书的公开内容的目的是提供可有效构建靶核酸的检测体系的靶核酸的检测方法。为此目的，本说明书的公开内容制备了第1引物(30)和第2引物(40)，所述第1引物(30)具有与靶核酸中的靶序列(12)互补的识别用序列(32)和标签添加用序列(36)，所述第2引物具有标识(42)。针对样本中的靶核酸(10)，使用第1引物(30)和第2引物(40)，扩增具有标签序列(66)和标识(42)的嵌合DNA(60)。使嵌合DNA(60)与固相体(100)的检测用探针(104)杂交，获得基于标识(42)的信号强度信息，并基于信号强度信息检测靶核酸(10)。
文档编号C12Q1/68GK102639714SQ20108004928
公开日2012年8月15日 申请日期2010年10月26日 优先权日2009年10月29日
发明者丹羽孝介, 川濑三雄, 广田寿一 申请人:日本碍子株式会社