从猪分离的菌株的制作方法

从猪分离的菌株的制作方法
【专利摘要】本发明的第一方面涉及一种猪乳酸菌菌株，其中所述菌株的特征在于一种或多种以下特征：(i)展现出针对大肠杆菌的抗微生物活性的能力；(ii)展现出针对肠炎沙门氏菌的抗微生物活性的能力；(iii)抑制由12-氧-十四烷酰戟二萜醇-13-乙酸酯（PMA）诱导的IPEC细胞中的炎症的能力；(iv)阻断肠炎沙门氏菌附着或侵入IPEC细胞的能力；(v)阻断大肠杆菌附着或侵入IPEC细胞的能力；(vi)没有对选自以下的一种或多种抗生素的抗生素抗性：氨苄西林；头孢噻肟；氯霉素；红霉素；艮他霉素；四环素；万古霉素；甲硝唑；萘啶酸；和卡那霉素；和(vii)当遭受三个循环的加热时展现出热稳定性的能力，每个所述循环包括在70℃的温度下加热15分钟。本发明的其他方面涉及包含所述菌株的组合物及所述菌株的治疗用途。
【专利说明】从猪分离的菌株

【技术领域】
[0001]本发明涉及从猪分离的菌株。更具体地，本发明涉及从有机饲养的猪分离乳酸菌。所要求保护的乳酸菌具有有益的益生菌应用和治疗应用。

【背景技术】
[0002]猪的菌群组成，其消化道先天免疫功能和可能的对感染的易感性受到其生命早期饲养环境的极大影响(Mulder et al，2009)。室外饲养的猪通常比室内饲养的猪具有更发达的消化道免疫系统，表现更好且更健康。户外环境显著地影响了消化道的微生物的多样性，并且与高水平的硬壁菌门(Firmicutes)，尤其是乳酸菌[LAB]有关。
[0003]LAB包含一个进化枝的革兰氏阳性、低GC、耐酸、通常不形成孢子、不呼吸的细菌，其与某些常见的代谢和生理特征有关。LAB是棒状杆菌或球菌，其特征为对较低的pH范围有增加的耐受性。LAB可产生乳酸，作为碳水化合物发酵的主要代谢终产物并且是食品工业中使用的最重要的微生物类群之一。
[0004]乳杆菌(Lactobacilli)在有机(室外)饲养的猪的消化道菌群中占优势地位。相比之下,在室内饲养的猪中这些细菌的数量低,可能致病的种系型的水平高(Mulder etal, 2009) 0此外，已知室内饲养的猪的消化道免疫发育和功能偏离了正常水平。具体地，已知I型干扰素基因、主要组织相容性复合体I类和若干趋化因子的表达增加(Mulder etal, 2009)。
[0005]乳酸菌可以以若干方式改变菌群以及消化道结构和功能(Cotter et al, 2005 ；Ohashi and Ushida，2009)。例如，乳酸菌可以与有害细菌竞争关键营养素或消化道上的附着位点，导致有害细菌被驱逐。或者，乳酸菌可产生生物活性物质，其帮助或促进有益细菌的定殖或杀死可能有害的细菌或致病菌或干扰其生长。或者，这些生物活性因子可以是促进免疫系统发育和消化道屏障完整性的免疫调节剂。LAB菌株的生物活性大不相同。本发明旨在提供具有在治疗上有用的特性的LAB菌株。更具体地，本发明旨在提供能够促进消化道和免疫系统发育和健康的LAB菌株,从而作为益生菌具有可观的治疗潜力。


【发明内容】

[0006]本 申请人:已经表明，室外饲养的猪的微生物丛含有可产生强效且特异性的抗微生物生物活性因子或细胞_/免疫-调节生物活性因子的LAB菌株。
[0007]本发明的多个方面与优选的实施方案一起在所附的权利要求书中列出。
[0008]本发明的第一方面涉及一种猪乳酸菌菌株，其中所述菌株的特征在于一种或多种如下特征:
[0009](i)展现出针对大肠杆菌(E.coli)的抗微生物活性的能力；
[0010](ii)展现出针对肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)的抗微生物活性的能力；
[0011](iii)抑制由 12-氧-十四烧酰戟二職醇-13-乙酸酯(12-0-tetradecaboylphorbol-13-acetate (PMA))诱导的IPEC细胞中的炎症的能力；
[0012](iv)阻断肠炎沙门氏菌附着或侵入IPEC细胞的能力；
[0013](V)阻断大肠杆菌附着或侵入IPEC细胞的能力；
[0014](vi)没有对选自以下的一种或多种抗生素的抗生素抗性:氨苄西林；头孢噻肟；氯霉素；红霉素；艮他霉素；四环素；万古霉素；甲硝唑(metronizadole);萘唳酸；和卡那霉素；和
[0015](vii)当遭受三个循环的加热时展现出热稳定性的能力，每个循环包括在70°C的温度下加热15分钟。
[0016]第二方面涉及一种包含一种或多种本发明的乳酸菌菌株和可药用赋形剂、载体或稀释剂的组合物。
[0017]第三方面涉及一种包含一种或多种本发明的乳酸菌菌株的益生菌组合物。
[0018]第四方面涉及一种或多种本发明的乳酸菌菌株用于药物。
[0019]第五方面涉及一种或多种本发明的乳酸菌菌株用于治疗受试者中的肠道病症。
[0020]第六方面涉及一种或多种本发明的乳酸菌菌株在制备用于治疗受试者中肠道病症的药物中的用途。
[0021]第七方面涉及一种治疗受试者中的肠道病症的方法，所述方法包括给予所述受试者治疗有效量的一种或多种本发明的乳酸菌菌株或本发明的组合物。
[0022]本发明的第八方面涉及一种或多种本发明的乳酸菌菌株用于改善肠道微生物群。
[0023]本发明的第九方面涉及一种改善受试者中的肠道微生物群的方法，所述方法包括给予所述受试者一种或多种本发明的乳酸菌菌株或本发明的组合物。
[0024]第十方面涉及一种包含一种或多种本发明的乳酸菌菌株的饲料。
[0025]第H^一方面涉及一种包含一种或多种本发明的乳酸菌菌株的食品。
[0026]第十二方面涉及一种包含一种或多种本发明的乳酸菌菌株的饮食补充剂。
[0027]第十三方面涉及一种包含一种或多种本发明的乳酸菌菌株的食品添加剂。
[0028]第十四方面涉及一种产生益生菌的方法，所述方法包括培养本发明的乳酸菌菌株。
[0029]本发明的第十五方面涉及一种获得猪乳酸菌菌株的方法，所述方法包括从有机饲养的猪获得粪便并从所述粪便提取一种或多种猪乳酸菌菌株。
[0030]本发明的第十六方面涉及通过上述方法获得或可获得的一种或多种猪乳酸菌菌株。

【具体实施方式】
[0031]如上所述，本发明涉及一种或多种猪乳酸菌菌株。所述乳酸菌菌株的特征在于一种或多种如下特征:
[0032](i)展现出针对大肠杆菌的抗微生物活性的能力；
[0033](ii)展现出针对肠炎沙门氏菌的抗微生物活性的能力；
[0034](iii)抑制由12-氧-十四烷酰戟二萜醇-13-乙酸酯(PMA)诱导的IPEC细胞中的炎症的能力；
[0035](iv)阻断肠炎沙门氏菌附着或侵入IPEC细胞的能力；
[0036](V)阻断大肠杆菌附着或侵入IPEC细胞的能力；
[0037](vi)没有对选自以下的一种或多种抗生素的抗生素抗性:氨苄西林；头孢噻肟；氣霉素；红霉素；艮他霉素；四环素；万古霉素；甲硝唑；奈淀酸；和卡那霉素；和
[0038](vii)当遭受三个循环的加热时展现出热稳定性的能力，每个循环包括在70°C的温度下加热15分钟。
[0039]本文使用的术语“猪”意指“猪的或属于猪”，即任一种猪科哺乳动物的或属于任一种猪科哺乳动物，尤其是年幼的或体积相对小的家养阉猪、驯化的欧洲中部野猪(Susscrofa domesticus)或家猪(Sus domesticus)。
[0040]优选地，所述猪不到3个月大，优选地，不到2个月大。
[0041]优选地，所述猪乳酸菌菌株来自有机饲养的猪。在这一点上，优选地，所述猪是在没有抗生素、生长促进剂和/或生长增强剂的情况下在外面自由放养的(同时暴露于土壤)。
[0042]优选地，所述猪乳酸菌菌株来自室外饲养的猪。优选地，所述猪生命的至少60 %是在外面饲养的。更优选地，所述动物生命的至少80%是在外面饲养的，更优选地，所述动物生命的至少90 %，甚至更优选其生命的100 %是在外面饲养的。
[0043]在一个优选的实施方案中，所述乳酸菌菌株选自约氏乳杆菌(L.johnsonii)、路氏乳杆菌(L.reuteri)、植物乳杆菌(L.plantarum)、加氏乳杆菌(L.gasseri)、戍糖乳杆菌(L.pentosus)、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、阴道乳杆菌(L.vaginalis)和粘膜乳杆菌(L.mucosae)。
[0044]在一个优选的实施方案中，所述乳酸菌菌株选自约氏乳杆菌、路氏乳杆菌和植物乳杆菌。
[0045]在另一个优选的实施方案中，所述乳酸菌菌株的形式是活的细菌群、冻干的细菌群、不活的细菌制剂或其细胞组分。优选地，当所述菌株的形式是不活的细菌制剂时，其选自热灭活的细菌、辐照的细菌和裂解的细菌。
[0046]在一个优选实施方案中，所述乳酸菌菌株的形式是活细菌、死细菌或其细胞组分。
[0047]在一个优选的实施方案中，所述乳酸菌菌株是分离的形式。本文使用的术语“分离的”意指从其天然环境分离出来。
[0048]在一个优选的实施方案中，所述乳酸菌菌株是生物纯的形式。本文使用的术语“生物纯的”是指实验室培养物形式的菌株，其基本上不含其他种类的生物。优选地，所述乳酸菌菌株的形式是单一生物种类的培养物。
[0049]本文使用的术语“乳酸菌菌株”还包括所述乳酸菌菌株的突变株。本文使用的术语“突变株”包括与参考株的多核苷酸序列有至少93%同源性，优选至少96%同源性，更优选98%同源性而在细菌基因组的其他序列中包含突变的衍生菌株。突变株可通过基因工程技术获得，意味着有本发明的菌株遗传物质的改变或意味着有本发明菌株遗传物质与其他分子的重组。通常，为了获得这样的突变菌株，本领域技术人员可使用标准的诱变技术例如UV辐射或暴露于致诱变的化学制品。
[0050]本文使用的术语“突变”包括天然的或诱导的突变，所述突变包含至少一个碱基改变——包括缺失、插入、颠换和其他本领域技术人员已知的修饰，所述修饰包括引入到亲本核苷酸或氨基酸序列中同时保持与亲本序列至少50%同源性的遗传修饰。优选地，包含所述一个或多个突变的序列具有与亲本序列至少60%，更优选至少75%，更优选85%的同源性。本文使用的序列“同源性”可使用本领域技术人员已知的标准技术确定。例如，同源性可使用在线的同源性算法“BLAST”程序确定,所述程序可在http)://www.ncb1.nlm.nih.gov/BLAST/公开获得。
[0051]本文使用的术语“乳酸菌菌株”还包括乳酸菌菌株的同系物。本文使用的术语“同系物”是指核苷酸序列与亲本乳酸菌菌株的核苷酸序列有一定程度的序列同一性或序列同源性的乳酸菌菌株(此后称作“同源序列”)。在本文中，术语“同源”意指实体与目标核苷酸序列有一定同源性。在本文中，术语“同源性”可以等同于“同一性”。
[0052]在本发明的上下中，同源序列被理解为包括与亲本乳酸菌菌株的核苷酸序列(目标序列)有至少50、60、70、75、80、85或90%的同一性，优选至少95%、97%、98%或99%的同一'I"生的核苷酸序列。
[0053]同源性比较可以用眼睛进行，或更通常地，借助于容易获得的序列比较程序进行。这些可商购的计算机程序可计算两条或多条序列之间的同源性％。可在连续序列上计算同源性％，即，一条序列与另一条序列比对，将一条序列中的每个氨基酸直接与另一条序列中对应的氨基酸进行比较，一次一个残基。这被称为“无空位”比对。通常，这种无空位比对仅在相对少量的残基上进行。
[0054]虽然这是一种非常简单且一致的方法，但是它不能顾及到，例如，在以其他方式具有同一性的序列对中，一个插入或缺失会使后面的氨基酸残基被置于比对之外，从而在进行总体比对时可能导致同源性％大大降低。
[0055]因此，计算同源性％最大值首先需要产生考虑到空位罚分的最佳比对。进行这类比对的适合计算机程序是Vector NTI (Invitrogen Corp.)。可进行序列比较的软件的实例包括但不限于例如BLAST程序包(见于Ausubel et all999Short Protocols in MolecularB1logy,第 4 版-第 18 章)、BLAST2 (见于 FEMSMicrob1l Lettl999174 (2): 247-50 ；FEMSMicrob1l Lettl999177 (I):187-8)、FASTA(Altschul et all990J.Mol.B1l.403-410)和AlignX0至少BLAST、BLAST2和FASTA可获得用于进行离线和在线搜索(见于Ausubel etall999, 7-58 至 7-60 页)。
[0056]优选地，在至少20个连续核苷酸上，优选在至少30个连续核苷酸上，优选在至少40个连续核苷酸上，优选在至少50个连续核苷酸上，优选在至少60个连续核苷酸上，优选在至少100个连续核苷酸上，确定核苷酸序列的同一性程度。优选地，可在全序列上确定核苷酸序列的同一'I"生程度。
[0057]惯用的基于表型特征的细菌鉴定通常不像基于基因型方法的鉴定那样精确。细菌16S rRNA基因序列比较已经作为优选的遗传技术出现并且使得能够通过使用BLAT (http: //blast, ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi)与已知细菌 DNA 序列进行序列比较来鉴定新菌株。16S rRNA基因序列在细菌中是普遍存在的，因此可测量许多不同细菌之间的关系。通常，除了在多个水平(包括种和亚种水平)上对菌株进行分类以外，比较16S rRNA序列容许跨越所有主要的细菌门在属水平上进行生物区分。已经确定了大量菌株的16SrRNA基因序列。GenBank，最大的核苷酸序列数据库，有超过2000万条储存的序列，其中超过90000条属于16S rRNA基因。这意味着可将未知菌株的序列与许多之前储存的序列进行比较。
[0058]在一个优选的实施方案中，所述乳酸菌菌株具有选自SEQ ID N0:l_87的16S rRNA基因序列，或其同系物或变体。本发明的另一个实施方案涉及包含选自SEQ ID N0:l-87的16S rRNA基因序列或其同系物或变体的乳酸菌菌株。可作适当变动将优选的用途/方法应用于该方面。
[0059]术语“同系物”是如上所定义的。本文使用的术语“变体”包括任何变化，其中:(a)一个或多个核苷酸被另外的核苷酸置换或被缺失，(b)两个或多个核苷酸的顺序颠倒，(C)(a)和(b) —起存在。优选地，所述变体由(a)、(b)或(C)中的一项产生。更优选地，一个或两个核苷酸被置换或缺失。甚至更优选地，一个核苷酸被另一个核苷酸置换。
[0060]在本发明的一个优选实施方案中，所述乳酸菌菌株的特征在于展现出针对大肠杆菌的抗微生物活性的能力。所观察到的抗微生物活性最有可能是因为本发明的乳酸菌菌株产生的抗微生物物质，虽然尚未确定这些抗微生物物质的性质。
[0061]在本发明的上下文中，展现出针对大肠杆菌的抗微生物活性的能力可以通过在体外孔扩散测定中测量对大肠杆菌生长的抑制而确定。孔扩散测定的更多细节在所附的实施例中列出。所述测定在MacConkey No3琼脂上使用大肠杆菌K88进行，平板在37°C孵育16小时。更具体地，将大肠杆菌K88加入到所述琼脂(在200ml琼脂中加入1ml的1:1000稀释的大肠杆菌K88过夜培养物，以得到相当于106CFU/ml的浓度)。将所述琼脂倒入培养皿中并使其凝固。将所述平板标记分隔成四个象限，并在每个象限中切出约5_的孔。向所述孔加入条件培养基或MRS肉汤培养基的小份(60 μ I)。盖上所述平板并将其在37°C孵育16小时。使用数字照相机给它们拍照。将图像转移到Photoshop，使用测量工具确定所述孔和抑菌圈的直径。
[0062]在上述孔扩散测定中杀死大肠杆菌的情况下，优选地，本发明的乳酸菌菌株展现出〈20000单位的抑制，更优选20000-40000单位，甚至更优选40000-60000单位，更优选60000-80000单位，更优选80000-100000单位的抑制，甚至更优选>100000单位的抑制。
[0063] 在本发明的一个优选实施方案中，所述乳酸菌菌株的特征在于展现出针对肠炎沙门氏菌的抗微生物活性的能力。同样地，所观察到的抗微生物活性最有可能是因为本发明的乳酸菌菌株产生的抗微生物物质，虽然尚未确定这些抗微生物物质的性质。
[0064]在本发明的上下文中，展现出针对肠炎沙门氏菌的抗微生物活性的能力是通过在体外孔扩散测定中测量抑制肠炎沙门氏菌生长的能力而确定。孔扩散测定的更多细节在所附的实施例中列出。所述测定在XLD琼脂上使用肠炎沙门氏菌S1400进行，平板在37°C孵育16小时。XLD琼脂按照制造商的说明书制备并冷却到45°C。将肠炎沙门氏菌S1400加入到所述XLD琼脂(在200ml琼脂中加入1ml的1:1000稀释的肠炎沙门氏菌S1400过夜培养物，以得到相当于106CFU/ml的浓度)。将所述XLD琼脂倒入培养皿中并使其凝固。将所述平板标记分隔成四个象限，并在每个象限中切出约5mm的孔。向所述孔加入条件培养基或MRS肉汤培养基的小份(60 μ I)。盖上所述平板并将其在37°C孵育16小时，如上文所述对大肠杆菌测定分析所述数据。
[0065]在上述孔扩散测定中杀死肠炎沙门氏菌的情况下，优选地，本发明的乳酸菌菌株展现出〈20000单位的抑制，更优选20000-40000单位，甚至更优选40000-60000单位，更优选60000-80000单位，更优选80000-100000单位的抑制，甚至更优选>100000单位的抑制。
[0066]在替代的实施方案中，展现出针对肠炎沙门氏菌的抗微生物活性的能力可通过在C3H/HeN或C57B1/6小鼠中在体内测量抑制肠炎沙门氏菌的能力而确定。适当的体内测定的更多细节在所附的实施例中列出。
[0067]具体地，在用肠炎沙门氏菌攻击之前和之后，用本发明的乳酸菌菌株处理C3H/HeN和C57B1/6小鼠。在感染后6天(C57B1/6)或10天(C3H/HeN)对所述小鼠实施安乐死并进行解剖，与适当的对照相比，在全身多个组织(例如肠系膜淋巴结、肝和脾)中，在肠(例如盲肠、结肠)中以及在粪便中，检测到了活沙门氏菌。本发明乳酸菌菌株的体内活性还可通过在用沙门氏菌或沙门氏菌加上LAB处理的C3H/HeN小鼠的肠中确定髓过氧化物酶[ΜΡ0]水平来测量，所述髓过氧化物酶是中性白细胞的标志物。沙门氏菌感染大大地增加了肠中的ΜΡ0，这是由于在针对感染的宿主反应中中性白细胞被募集到肠部分。用本发明的乳酸菌菌株进行共处理降低了感染沙门氏菌的小鼠的肠中的MPO活性，表明相对于对照实验，在这些动物中对感染的肠炎症应答减弱了。
[0068]在本发明的一个优选实施方案中，所述乳酸菌菌株的特征在于抑制由12-氧-十四烷酰戟二萜醇-13-乙酸酯(PMA)诱导的IPEC细胞中的炎症的能力。在本发明的上下文中，这是指乳酸菌菌株阻断由PMA触发的白细胞介素-8(IL-8)基因表达的能力。更具体地，其可通过在IPEC-J2细胞中在37°C，5% C02，95%湿度下孵育2小时时测量对由PMA诱导的炎症的抑制来确定。在RNA反转录后，使用针对猪IL-8和TNF- α (由SigmaAldrich 制备)的引物,在运行7500Fast System vl.4.0Sequence Detect1n Software 1.4版的 7500Fast Real-time PCR 系统(Applied B1system)上进行实时 PCR。
[0069]反应混合物是:10μ1Power Sybergreen Master mix, 2.5 μ I 正向引物，2.5 μ I反向引物和5μ I cDNA，然后实时PCR根据标准的7500方案运行(95°C，lOmin，I个循环。95°C，15sec，40 个循环。60°C，lmin，40 个循环。95°C，15sec，I 个循环。60°C，lmin，I 个循环。95°C，15sec，l个循环。60°C，15sec，I个循环)。分析IL-8和TNF-α基因的表达并将其与“持家”基因β_肌动蛋白的表达作比较。为了进行比较，数值以IL-8/β-肌动蛋白和TNF- α/β-肌动蛋白的比例或倍数变化给出。该测定的更多细节在所附的实施例中给出。
[0070] 在本发明的一个优选实施方案中，所述乳酸菌菌株的特征在于阻断肠炎沙门氏菌附着或侵入IPEC细胞的能力。这可通过所附实施例中列出的测定来测量。具体地，在24孔板中培养单层IPEC-J2细胞至汇合后3天，在使用前24小时通过加入DTS培养基进行同步化。将猪LAB(1ml)的过夜培养物离心，所述细菌重悬于磷酸盐缓冲盐水[PBS]。向所述孔加入LAB的小份(50 μ I)。平板在37°C、5% C02、95%湿度下孵育2小时。将肠炎沙门氏菌血清变型Enteritidis S1400 [肠炎沙门氏菌S1400]的过夜培养物继代培养(1ml中0.5ml)至Luria Bertani (LB)培养基中，并在37°C有氧孵育2_3小时直至光密度(560nm)达到0.8 (等价于I X 108CFU/ml的浓度)。将所述培养物离心，所述细菌重悬于PBS。将小份(50 μ I) 加入到IPEC-J2细胞的孔。所述平板在37°C、5%C02、95%湿度下再孵育2小时。IPEC-J2细胞单层用HBSS洗涤。每孔加入含Triton-XlOO (10ml/L)的PBS溶液(0.5ml)，刮下所述单细胞层并使其分散。通过Miles和Misra法在XLD琼脂平板上(在37°C孵育24小时)估计活沙门氏菌。乳酸菌通过相同的步骤确定(在37°C厌氧孵育48小时)。
[0071]优选地，如通过上述测定所测量的，在肠炎沙门氏菌附着/侵入IPEC细胞的情况下，本发明的乳酸菌菌株展现出，对附着/侵入的0-20 %的抑制，更优选对附着/侵入的20-40 %，甚至更优选40-60 %，更优选60-80 %，甚至更优选80-100 %的抑制。
[0072]在本发明的一个优选实施方案中，所述乳酸菌菌株的特征在于阻断大肠杆菌附着或侵入IPEC细胞的能力。这可以通过与上述用于肠炎沙门氏菌的测定类似且在所附的实施例中列出的测定来测量。
[0073]优选地，如通过上述测定所测量的，在大肠杆菌K88附着/侵入IPEC细胞的情况下，本发明的乳酸菌菌株展现出，对附着/侵入的0-20 %的抑制，更优选对附着/侵入的20-40 %，甚至更优选40-60 %，更优选60-80 %，甚至更优选80-100 %的抑制。
[0074]在本发明的一个优选实施方案中，所述乳酸菌菌株的特征在于没有对选自以下的一种或多种抗生素的抗生素抗性:氨苄西林；头孢噻肟；氯霉素；红霉素；艮他霉素；四环素；万古霉素；甲硝唑；萘啶酸；和卡那霉素。在本发明的上下文中，抗生素抗性可以通过，在置于厌氧培养罐并在37°C孵育24小时时测量各种含抗生素的圆片对所述乳酸菌菌株的MRS琼脂平板培养物的效应来确定。所述测定的更多细节在所附实施例中列出。更具体地，将猪LAB [0.5ml的1:100稀释的过夜培养物]涂布在MRS琼脂平板的表面上并干燥。将所述平板标记分隔成四个象限，并在每个象限中放置含抗生素的圆片[氨苄西林，10 μ g。头孢噻厢，30 μ g。氯霉素，10 μ g。红霉素，15 μ g。艮他霉素，10 μ g。卡那霉素,30 μ g。甲硝唑，50 μ g。萘啶酸,30 μ g。四环素,30 μ g。万古霉素,30 μ g]。将所述平板盖上，置于厌氧培养罐中并在37°C孵育24小时。使用数字照相机给所述平板拍照。将图像转移到Photoshop，使用测量工具确定抑菌圈的直径。对于每种抗生素，量取所述测试菌株的排斥面积(exclus1n area)，并将其除以用该抗生素所获得的最大排斥面积。
[0075]优选地，本发明的LAB的特征在于没有对抗生素氨苄西林、头孢噻肟、氯霉素、红霉素、艮他霉素、四环素、万古霉素、甲硝唑、萘啶酸和卡那霉素的抗性。更优选地，本发明的LAB的特征在于没有对抗生素氨苄西林、头孢噻肟、氯霉素、红霉素、艮他霉素、四环素和万古霉素的抗性。
[0076]在本发明的一个优选实施方案中，所述乳酸菌菌株的特征在于当遭受三个循环的加热时展现出热稳定性的能力，每个循环包括在70°C的温度下加热15分钟的时间。热稳定性研究的更多细节在所附的实施例中列出。更具体地，在本发明的上下文中，热稳定性通过将分离的猪LAB的过夜培养物(1ml)离心并将片状沉淀物重悬于新鲜的MRS肉汤培养基(1ml)中而测量。将小份(Iml)在70°C加热15分钟，然后在MRS琼脂上铺板(0.5ml)并在厌氧培养罐中在37°C孵育48小时。检测到少量的菌落，将这些菌落挑出，接种到含MRS肉汤培养基的Hungate管中并在37°C孵育48小时。将该培养物离心,重悬于MRS肉汤培养基，在70°C再次加热15分钟，铺板在MRS琼脂上，在厌氧培养罐中在37°C孵育48小时，将菌落挑出并接种到含MRS肉汤培养基的Hungate管中并在37°C孵育48小时。将该培养物离心，重悬于MRS肉汤培养基，在70°C再次加热15分钟，铺板(0.5ml)在MRS琼脂上，在厌氧培养罐中在37°C孵育48小时，将菌落挑出并接种到含MRS肉汤培养基的Hungate管中并在37°C孵育48小时。
[0077]在一个优选的实施方案中，所述乳酸菌菌株具有选自上文列出的(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)和(vii)的任意两种表征特征。
[0078]在一个优选的实施方案中，所述乳酸菌菌株具有选自上文列出的(i)、(ii)、
(iii)、(iv)、(v)、(vi)和(vii)的任意三种表征特征。
[0079]在一个优选的实施方案中，所述乳酸菌菌株具有选自上文列出的(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)和(vii)的任意四种表征特征。
[0080]在一个优选的实施方案中，所述乳酸菌菌株具有选自上文列出的(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)和(vii)的任意五种表征特征。
[0081]在一个优选的实施方案中，所述乳酸菌菌株具有选自上文列出的(i)、(ii)、
(iii)、(iv)、(v)、(vi)和(vii)的任意六种表征特征。
[0082]在一个优选的实施方案中，所述乳酸菌菌株具有上文列出的全部七种特征:(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)和(vii)。
[0083]在一个尤其优选的实施方案中，(A)，所述乳酸菌菌株的特征在于上述特征(i)和(ii)。
[0084]在一个尤其优选的实施方案中，(B)，所述乳酸菌菌株的特征在于上述特征(iv)和(V)。
[0085]在一个尤其优选的实施方案中，(C)，所述乳酸菌菌株的特征在于上述特征(iv)和(V)。
[0086]在一个尤其优选的实施方案中，所述乳酸菌菌株的特征在于如下由(D)至(G)表示的特征:
[0087](D)⑴和(iv); 或
[0088](E)⑴和(V);或
[0089](F) (ii)和(iv);或
[0090](G) (ii)和(V)；
[0091]更优选地，除了上述实施方案(A)至(G)任一项中列举的那些特征以外，所述乳酸菌菌株的特征还在于特征(vi)。
[0092]甚至更优选地，除了上述实施方案(A)至(G)任一项中列举的那些特征以外，所述乳酸菌菌株的特征还在于特征(iii)。
[0093]甚至更优选地，除了上述实施方案(A)至(G)任一项中列举的那些特征以外，所述乳酸菌菌株的特征还在于特征(vii)。
[0094]生物保藏
[0095]本发明的一个实施方案涉及从有机饲养的猪的粪便中分离的乳酸菌菌株并且所述乳酸菌菌株选自在2011年6月27日根据布达佩斯条约的条款在英国苏格兰阿伯丁巴克斯本 Craibstone Estate 弗格森大厦，AB219YA(Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, UK, AB219YA)的NCIMB Ltd的英国工业、食品和海洋细菌保藏中心(Nat1nal Collect1ns of Industrial, Food and Marine Bacteria(NCIMB))以如下登录号保藏的菌株:
[0096]NCIMB41846:路氏乳杆菌 GGDK31 ；
[0097]NCIMB41847:植物 / 戍糖 / 类植物乳杆菌(Lactobacillus paraplantarum)GGDK161 ；
[0098]NCIMB41848:约氏 / 台湾(Lactobacillus taiwanensis) / 嗜酸 / 加氏乳杆菌GGDK255 ；
[0099]NCIMB41849:植物 / 戍糖 / 瑞士 (Lactobacillus helveticus)/ 类植物乳杆菌GGDK258 ；
[0100]NCIMB41850:约氏乳杆菌 GGDK266。
[0101]上述保藏NCMB41846、NCIMB41847, NCIMB41848, NCIMB41849 和 NCMB41850，由阿伯丁 Greenburn路，AB219SB,阿伯丁大学Rowett营养与健康研究所(Rowett Instituteof Nutrit1n and Health, University of Aberdeen)的 George Grant 博士代表 申请人:GT生物制剂有限公司，完成。
[0102]本 申请人:后续的研究表明，以NCIMB41847保藏的菌株是类植物乳杆菌和路氏乳杆菌的混合物。本 申请人:后续的研究表明，以NCMB41850保藏的菌株是约氏乳杆菌和路氏乳杆菌的混合物。本 申请人:后续的研究表明，以NCMB41848保藏的菌株是路氏乳杆菌。随后保藏了菌株NCMB41847和NCMB41850各个组分的分离菌株(见下文)。
[0103]本发明的另一个实施方案涉及从有机饲养的猪的粪便中分离的乳酸菌菌株并且所述乳酸菌菌株选自在2012年7月11日根据布达佩斯条约的条款在英国苏格兰阿伯丁巴克斯本 Craibstone Estate 弗格森大厦，AB219YA(Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, UK, AB219YA)的NCIMB Ltd的英国家工业、食品和海洋细菌保藏中心(Nat1nal Collect1ns of Industrial, Food and Marine Bacteria(NCIMB))以如下登录号保藏的菌株:
[0104]NCIMB42008 约氏乳杆菌；
[0105]NCMB42009 路氏乳杆菌；
[0106]NCMB42010 植物乳杆菌；
[0107]NCIMB42011 路氏乳杆菌；
[0108]NCMB42012路氏乳杆菌
[0109]上述保藏Ν(ΠΜΒ42008、Ν(ΠΜΒ42009、Ν(ΠΜΒ42010、Ν(ΠΜΒ42011 和 NCMB42012，由 GT生物制剂有限公司，c/olnstitute of Medical Sciences, University of Aberdeen, Foresterhill, Aberdeen, Aberdeensshire, AB252ZD, UK 的 Denise Kelly 教授代表 申请人: GT 生物制剂有限公司完成。
[0110]本发明还包括可从所述菌株获得的突变株以及与选自以上述登录号保藏的那些菌株的菌株有至少70%的DNA-DNA同源性和/或至少99.5%的16S RNA同一性的菌株。
[0111]本文使用的术语“ 16S rRNA同一性”是指与已知菌株的同一性百分数。在一个优选的实施方案中，所述乳酸菌菌株与选自以上述登录号保藏的那些菌株的菌株具有至少85%或至少90%，或至少95、96、97、98或99%的16S rRNA同一性。在一个高度优选的实施方案中，所述乳酸菌菌株与选自以上述登录号保藏的那些菌株的菌株具有至少99.5%的16SrRNA 同一f生。
[0112]在本发明的上下文中，术语“DNA-DNA”同源性是指两条或多条单独的DNA链，基于其核苷酸序列，彼此之间紧密相关的程度。通常，这以其同一性％的方式测量。在一个优选的实施方案中，所述乳酸菌菌株与选自以上述登录号保藏的那些菌株的菌株具有至少70%的DNA-DNA同源性，更优选地，与选自以上述登录号保藏的那些菌株的菌株具有至少80%，或至少85%，更优选至少90、95、97、98或99%的同源性。
[0113]在一个高度优选的实施方案中，所述乳酸菌菌株与选自以上述登录号保藏的那些菌株的菌株具有至少70%的DNA-DNA同源性和至少99.5%的16S rRNA同一性。
[0114]组合物
[0115]本发明的另一方面涉及一种包含一种或多种如上所述的乳酸菌菌株以及可药用赋形剂、载体或稀释剂的组合物。合适的赋形剂、稀释剂、载体如下所述。
[0116]所述组合物可以是任何组合物，但优选是口服、经肠或经直肠给予的组合物。例如，所述组合物可以是可食用的组合物。“可食用的”意指经批准用于人或动物消费的材料。
[0117]本发明的另一方面涉及一种包含如上所述的乳酸菌菌株的益生菌组合物。
[0118]本发明的另一个方面涉及多于两种的如本文所述的乳酸菌菌株的结合物。在尤其优选的实施方案中，这种结合物展现出协同作用，例如所述结合物是协同的，即，所产生的效应强于所述结合物中各个乳酸菌组分产生的简单累积的效应。
[0119]本发明的一个优选实施方案涉及二、三、四或五种不同乳酸菌的结合物，更优选二、三或四种不同乳酸菌的结合物 ，更优选二或三种不同乳酸菌的结合物。当本发明涉及多于一种乳酸菌菌株的结合物时，所述结合物的各个组分可以以任意比例存在。
[0120]更优选地，本发明涉及两种不同乳酸菌的结合物。优选地，所述两种不同的乳酸菌，按重量计，以1/99.9-99.9/1的比例存在，例如1/99-99/1或10/90-90/10,或20/80-80/20，或 30/70-70/30 等。
[0121]在一个高度优选的实施方案中，所述结合物是约氏乳杆菌和路氏乳杆菌的结合物。甚至更优选地，所述结合物是如上所述的NCMB41850:约氏乳杆菌和路氏乳杆菌GGDK266。出人意料的是，这种特定的乳酸菌结合物意外地在早期断奶的猪中产生了有益的体内应答(见实施例)。
[0122]在另一个高度优选的实施方案中，所述结合物是植物乳杆菌和路氏乳杆菌的结合物。甚至更优选地，所述结合物是如上所述的NCMB41847:植物/戊糖/类植物乳杆菌和路氏乳杆菌GGDK161。
[0123]本文使用的术语“益生菌”意指对宿主的健康或健康幸福有有益效果的微生物细胞制剂或微生物细胞的组分。(Salminen S，Ouwehand A.Benno Y.et al〃Prob1tics:howshould they be defined"Trends Food Sc1.Technol.1999:10107-10)。
[0124]优选地，所述益生菌组合物是可口服给予的组合物，其含有有代谢活性的(即活的)和/或冻干的，或不活的经热灭活的、辐照的或裂解的益生菌。所述益生菌组合物可含有其他成分。本发明的益生菌组合物可以口服给予，即为片剂、胶囊剂或粉剂的形式。或者，本发明的益生菌组合物可以作为食品或营养产品例如基于乳或乳清的发酵乳制品，或作为药品口服给予。
[0125]合适的益生菌每日剂量是约IXlO3-约IX 111个菌落形成单位(CFU)，更优选约I X 17-约 I X 110CFU,更优选约 IXlO6 -约 I X 110CFUo
[0126]在一个优选的实施方案中，所述组合物以相对于所述组合物的重量约IXlO6-约I X 1012CFU/g,优选约I X 18 -约I X 1010CFU/g的量含有菌株和/或其细胞组分作为活性成分。举例来说，所述剂量可以是lg、3g、5g和10g。
[0127]通常,将益生菌任选地与至少一种合适的益生元(preb1tic)化合物结合。益生元常常是非消化性的碳水化合物例如寡糖或多糖，或不能在上消化道中被降解或吸收的糖醇。已知的益生元包括商业化的产品例如菊粉和反式低聚半乳糖。
[0128]优选地，相对于组合物总重量，本发明的组合物包括的益生元的量为以重量计约1-约30%，优选以重量计5-20%。优选的碳水化合物选自低聚果糖(或F0S)、短链低聚果糖(fructo-oligosaccharlde)、菊粉、低聚异麦芽糖、果胶、低聚木糖(或XOS)、低聚壳聚糖(或COS)、β -葡聚糖、改性阿拉伯胶和抗性淀粉、聚葡萄糖、D-塔格糖、阿拉伯胶纤维、卡罗布胶、燕麦和柑橘纤维。尤其优选的益生元是短链低聚果糖(为了简单起见，下文显示为FOSs-c.c);所述FOSs-c.c.不是可消化的糖类，通常通过转化甜菜糖获得并且包括与三个葡萄糖分子键合的蔗糖分子。
[0129]乳酸菌的制备
[0130]本发明的另一方面涉及一种用于产生益生菌的方法，所述方法包括培养本发明的乳酸菌菌株。本领域技术人员熟悉适合用于培养本发明的菌株的标准技术和条件。
[0131]本发明的另一方面涉及一种制备一种或多种本发明的菌株的方法，所述方法包括以下步骤:
[0132](i)从有机饲养的猪获得粪便；
[0133](ii)冷冻所述粪便并使其在合适的稀释剂中分散；
[0134](iii)任选在补充的猪初乳碳水化合物的存在下，将在步骤(ii)中获得的分散的粪便施加到合适的琼脂，并在厌氧条件下孵育；
[0135](V)选择步骤(iv)期间形成的不同细菌菌落，任选在补充的猪初乳碳水化合物的存在下，接种到合适的肉汤培养基中；
[0136](vi)孵育在步骤(V)中获得的接种的菌落。
[0137]合适的琼脂包括例如MRS或LAMVAB琼脂平板。然而,其他合适的琼脂也可以使用并且它们对技术人员来说是熟悉的。
[0138]合适的肉汤培养基包括例如MRS肉汤培养基。然而,其他合适的肉汤培养基也可以使用并且它们对技术人员来说是熟悉的。
[0139]优选地，步骤(iii)包括将所述琼脂在约37°C的温度孵育至少72小时。
[0140]优选地，步骤(vi)包括将所接种的菌落在约37°C的温度孵育至少48小时。
[0141]本发明的另一方面涉及一种获得猪乳酸菌菌株的方法，所述方法包括从有机饲养的猪获得粪便并从所述粪便提取一种或多种猪乳酸菌菌株。
[0142]优选地，所述方法包括以下步骤:
[0143](i)从有机饲养的猪获得粪便；
[0144](ii)冷冻所述粪便并使其在合适的稀释剂中分散；
[0145](iii)任选在补充的猪初乳碳水化合物的存在下，将在步骤(ii)中获得的分散的粪便施加到合适的琼脂，并在厌氧条件下孵育；
[0146] (V)选择步骤(iv)期间形成的不同细菌菌落，任选在补充的猪初乳碳水化合物的存在下，接种到合适的肉汤培养基中；
[0147](vi)孵育在步骤(V)中获得的接种的菌落。
[0148]本发明的另一方面涉及通过上述方法获得或可获得的猪乳酸菌菌株。
[0149]治疗应用
[0150]本发明的另一方面涉及如上所定义的一种或多种乳酸菌菌株用于医药。
[0151]本发明的另一方面涉及如上所定义的一种或多种乳酸菌菌株用于治疗肠病症。
[0152]本发明的另一方面涉及如上所定义的一种或多种乳酸菌菌株或组合物在制备用于治疗肠病症的药物中的用途。
[0153]本文使用的术语“药物”包括在人医学和兽医学中用于人和动物的药物。另外，本文使用的术语“药物”意指提供治疗和/或有益的效果的任何物质。本文使用的术语“药物”不一定仅限于需要上市许可的物质，还可包括可在化妆品、营养制品、食物(包括例如食物(feed)和饮料)、益生菌培养物和天然药物中使用的物质。另外，本文使用的术语“药物”包括被设计用于掺在动物饲料例如家畜饲料和/或宠物食品中的产品。
[0154]本发明的另一方面涉及一种治疗受试者中的肠病症的方法，所述方法包括给予所述受试者药学有效量的如上所述的一种或多种乳酸菌菌株或药物组合物或益生菌组合物。
[0155]优选地，所述肠病症选自肠易激综合征(IBS)、炎性肠道病症(IBD)、功能性消化不良、功能性便秘、功能性腹泻(包括抗生素相关性腹泻、旅行者腹泻(traveller’ sdiarrhoea)和小儿腹泻)、功能性腹痛、功能性胃气胀、上腹痛综合征、餐后不适综合征、克罗恩病、溃疡性结肠炎、胃肠反流性疾病(GERD)、变态反应、特应性疾病例如特应性皮炎、坏死性小肠结肠炎、其他感染以及其组合。
[0156]在一个优选的实施方案中，所述肠病症是IBS。IBS的精确病理生理学仍有待阐明。最近的研究记载了 IBS患者和肠感染相关疾病中的粘膜炎症和肠道微生物群变化。
[0157]在一个高度优选的实施方案中，所述病症是沙门氏菌病。沙门氏菌病是一种由多种沙门氏菌菌株引起的疾病，其特征在于发热和肠病症。
[0158]本发明的另一个方面涉及一种或多种如上所定义的乳酸菌菌株用于改善肠道微生物群。
[0159]本发明的另一方面涉及一种改善受试者中肠道微生物群的方法，所述方法包括给予所述受试者本发明的包含一种或多种乳酸菌菌株的组合物或药物组合物或益生菌组合物。
[0160]本发明的乳酸菌菌株还可用于预防性应用。在预防性应用中，给予对具体疾病易感或有患上该疾病的风险的患者足以至少部分地降低患病风险的量的本发明的组合物。这种量被定义为“预防有效剂量”。精确量取决于多种患者特异性因素例如患者的健康状况和体重。
[0161]本发明的乳酸菌菌株和益生菌组合物还可用于动物营养品(例如用于猪营养品)，尤其是在早期断奶期和育肥期(growing fattening per1d)。预期所述益生菌会增强免疫功能，减少并预防感染性疾病，有益地改变微生物群组成，并改善动物的生长和表现，例如通过提高饲料转化效率。术语“动物”包括所有动物，包括人。动物的实例是非反刍类和反刍类。反刍类动物包括例如绵羊、山羊和牛例如母牛，如肉牛和奶牛。在具体的实施方案中，所述动物是非反刍类动物。非反刍类动物包括宠物，例如马、猫和狗；单胃动物例如猪(pig)或猪类(swine)(包括但不限于仔猪、生长猪和母猪)；家禽例如火鸡、鸭和鸡(包括但不限于肉仔鸡、产蛋鸡)；鱼(包括但不限于鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、鲶鱼和鲤鱼)；和甲壳类(包括但不限于河虾和对虾)。
[0162]饲料(Feedstuff)/产品
[0163]本发明的另一方面涉及含有一种或多种本发明的菌株的食品、饮食补充剂、营养制品、营养配方物、饮料和药物。
[0164]在一个优选的实施方案中，所述组合物另外包含至少一种其他种类的其他食品级细菌，其中所述食品级细菌优选选自乳酸菌、双歧杆菌、丙酸杆菌或其混合物。
[0165]本发明的一个方面涉及包含一种或多种本发明的乳酸菌菌株的食品。术语“食品”意欲包括所有可以食用的产品，所述产品可以是固体、凝胶状的或液体。合适的食品可包括例如功能性食品、食品组合物、宠物食品、家禽饲料、保健食品、饲料等。在一个优选的实施方案中，所述食品是保健食品。
[0166]本文使用的术语“功能性食品”意指不仅能够提供营养效应还能够为食用者提供其他有益效应的食品。因此，功能性食品是其中纳入了可赋予食品特定功能(例如医学或生理学益处)而不是纯粹的营养效应的组分或成分(例如本文记载的那些)的普通食品。
[0167]可适用于本发明的具体食品的实例包括给基于乳的产品，即食点心、用例如乳或水复原的粉剂、巧克力乳饮料、麦芽饮料、即食食品、人用的速溶食品或饮料或者提供意欲用于宠物或家禽的全部或部分饮食的食物组合物。
[0168]在一个优选的实施方案中，本发明的组合物是意欲用于人、宠物或家禽的食品。所述组合物可意欲用于选自狗、猫、猪、牛、马、山羊、绵羊或家禽的动物。在优选的实施方案中，所述组合物是意欲用于成年物种尤其是成人的食品。
[0169]在本发明中，“基于乳的产品”是指脂肪含量不同的任何基于液体或半固体乳或乳清的产品。所述基于乳的产品可以是例如牛乳、山羊乳、绵羊乳、脱脂乳、全脂乳、不经任何加工从奶粉和乳清调配的乳或者加工产品，例如酸乳酪、凝固乳(curdled milk)、凝乳、酸乳、全脂酸乳、酪乳和其他酸乳制品。另一个重要的类别包括乳饮料，例如乳清饮料、发酵乳、炼乳、婴儿或宝宝乳；调味乳、冰激淋；含乳食品例如糖果。
[0170]本发明的一个方面涉及包含一种或多种本发明的菌株的饲料或动物饲料。
[0171]饲料可以是食品添加剂、饲料预混物或动物饲料。本发明的饲料的的具体实例包括如下:动物饲料添加剂，其包含(a)本发明的猪乳酸菌(b)至少一种脂溶性维生素(C)至少一种水溶性维生素(d)至少一种微量矿物质和/或至少一种大量矿物质；动物饲料组合物，其包含本发明的猪乳酸菌，粗蛋白质含量为50_88g/kg饲料。所谓的预混物是本发明的动物饲料添加剂的实例。预混物优选是指一种或多种微量成分与稀释剂和/或载体的均匀混合物。预混物用于帮助微量成分在较大混合物中均匀分散。
[0172]此外，任选的饲料添加剂成分是着色剂例如类胡萝卜素(例如β_胡萝卜素)、虾青素和叶黄素；芳香化合物；稳定剂；抗微生物肽；多不饱和脂肪酸；产生活性氧的物质；和/或至少一种选自以下的酶:植酸酶(EC3.1.3.8或3.1.3.26);木聚糖酶(EC3.2.1.8);半乳聚糖酶(EC3.2.1.89) ; α -半乳糖苷酶(EC3.2.1.22);蛋白酶(EC3.4.)、磷脂酶 A1(EC3.1.1.32);磷脂酶 A2 (EC3.1.1.4);溶血磷脂酶(EC3.1.1.5);磷脂酶C(EC3.1.4.3);磷脂酶D(EC3.1.4.4);淀粉酶例如α -淀粉酶(EC3.2.1.1);和/或β葡聚糖酶(EC3.2.1.4 或 EC3.2.1.6)。
[0173]多不饱和脂肪酸的实例是C18、C20和C22多不饱和脂肪酸，例如花生四烯酸、二十二碳六烯酸(docosohexaenoic acid)、二十碳五烯酸和Y-亚油酸。
[0174]产生活性氧的物质的实例是化学品例如过硼酸盐、过硫酸盐或过碳酸盐；和酶例如氧化酶、加氧酶或合成酶(syntethase)。
[0175]通常，脂溶性和水溶性维生素，以及微量矿物质可形成所谓的意欲添加到所述饲料中的预混物的一部分，而大量矿物质通常单独地添加到所述饲料中。当富含本发明的猪乳酸菌时，这些组合物类型中的任一种都是本发明范围内的动物饲料添加剂。
[0176]这些组分的实例的非排他性列表如下:脂溶性维生素的实例是维生素A、维生素D3、维生素E和维生素K例如维生素K3。水溶性维生素的实例是维生素B12、生物素和胆碱、维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、叶酸和泛酸盐(panthothenate)例如Ca-D-泛酸盐。微量矿物质的实例是锰、锌、铁、铜、碘、硒和钴。大量矿物质的实例是钙、磷、钠。
[0177]这些组分的营养需要量(用家禽和仔猪/猪举例)列于WOO1/58275的表A中。营养需要量意指这些组分应在饮食中以指示的浓度提供。
[0178]或者，本发明的动物饲料添加剂包含至少一种在W001/58275表A中指定的单独组分。至少一种意指任一种、一种或多种、一种、或两种、或三种、或四种依次类推直至所有13种，或直至所有15种单独组分。更具体地，该至少一种单独组分以这样的量被包含在本发明的添加剂中，使得提供WOO1/58275表A的第4列、第5列或第6列所示的范围之内的饲料中的浓度(in-feed concentrat1n)。
[0179]动物饲料组合物或饮食通常具有相对高的蛋白质含量。家禽和猪的饮食可以如WOO1/58275表B第2-3列所示进行表征。鱼类饮食可以如该表B的第4列所示进行表征。另外这种鱼类饮食通常具有200 - 310g/kg的粗脂肪含量。W001/58275对应于US09/779334，其以引用的方式纳入本文。
[0180]本发明的动物饲料组合物通常具有50 - 800g/kg的粗蛋白含量，还包含本文记载和/或要求保护的本发明的猪乳酸菌。
[0181]并且，或者作为(上述粗蛋白含量的)替代，本发明的动物饲料组合物可具有10-30MJ/kg的可代谢能量含量；和/或0.l-200g/kg的钙含量；和/或0.l_200g/kg的有效磷含量；和/或0.l-100g/kg的甲硫氨酸含量；和/或0.l-150g/kg的甲硫氨酸加半胱氨酸含量；和/或0.5-50g/kg的赖氨酸含量。
[0182]在某些优选实施方案中，所述可代谢能量、粗蛋白、钙、磷、甲硫氨酸、甲硫氨酸加半胱氨酸和/或赖氨酸的含量在W001/58275表B的范围2、3、4或5 (R.2_5)的任一范围内。粗蛋白是用氮(N)乘以因数6.25来计算的，即，粗蛋白(g/kg) = N(g/kg) X6.25。氮含量是用凯氏(Kjeldahl)方法(A.0.A.C., 1984, OfficialMethods of Analysis 第
14IK, Associat1n of Official Analytical Chemists, Washington DC)来石角定的。可代谢能量可以根据下列文献来计算:NRC publicat1n Nutrient requirements inswine, 1988 年第九次修订版，subcommittee on swinenutrit1n, committee on animalnutrit1n, board of agriculture, nat1nal research council.Nat1nal AcademyPress, Washington, D.C.，pp.2-6 ;和 European Table of Energy Values for PoultryFeed-stuffs,Spelderholt centre for poultry research and extens1n, 7361DABeekbergen, The Netherlands.Grafisch bedrijf Ponsen&looijen bv,ffageningen.1SBN90-71463-12-5。
[0183]钙、有效磷和氨基酸在完全动物饮食中的饮食含量根据例如VeevoedertabeI1997,gegevens over chemische samenstelling， verteerbaarheid envoederwaarde van voedermiddelen, Central VeevoederbureaujRunderweg6, 8219pkLelystad.1SBN90-72839-13-7 等饲料表来计算。
[0184]在一个优选实施方案中，本发明的动物饲料组合物含有至少一种植物蛋白或蛋白源。其还可含有动物蛋白例如肉骨粉(Meat and Bone Meal)和/或鱼粉(Fish Meal)，通常其量为0-25%。本文使用的术语植物蛋白是指包含至少一种衍生自或源自植物的蛋白(包括修饰蛋白和蛋白衍生物)的任何化合物、组合物、制剂或混合物。在某些尤其优选的实施方案中，植物蛋白的蛋白含量为至少10、20、30、40、50或60% (w/w) 0
[0185]植物蛋白可以衍生自植物蛋白源，例如豆类和谷物，例如来自豆科(Fabaceae (Leguminosae))、十字花科(Cruciferaceae)、黎科(Chenopodiaceae)和禾本科(Poaceae)植物的物质,如大豆粉(soy bean meal)、羽扇豆粉(lupin meal)和油菜粉(rapeseed meal)。在具体实施方案中，植物蛋白源是来自豆科的一种或多种植物例如大豆、羽扇豆、豌豆或菜豆(bean)的材料。植物蛋白源的其他实例是油菜籽、向日葵籽、棉籽和甘蓝。植物蛋白源的其他实例是谷物，例如大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉米(maize/corn)、水稻、黑小麦和高粱。
[0186]动物饮食可以例如制成粉状饲料(非颗粒状的)或颗粒饲料。通常，将磨碎的饲料原料混合，并根据所述物种所用的规范加入足够量的必需维生素和矿物质。本发明的猪乳酸菌可以作为固体或液体制剂加入。
[0187]本发明的组合物可以是食品补充剂或可以添加到食品补充剂中，所述食品补充剂在本文中还称为饮食补充剂或食品添加剂。因此，本发明的另一方面涉及包含一种或多种本发明的菌株的饮食补充剂或食品添加剂。
[0188]本发明的另一实施方案涉及如上所述的饲料用于改善动物生长表现的用途，所述动物生长表现通过每日体重增加和/或饲料转化率测量。
[0189]在优选的实施方案中，本发明涉及在动物饲料中使用包含一种或多种本发明的猪乳酸菌的饲料以改善每日体重增加、改善饲料转化率(FCR)和/或调节消化道微生物群的方法。
[0190] 在替代的优选实施方案中，包含一种或多种本发明的猪乳酸菌的饲料可改善动物饲料消化吸收率，并且/或者通过帮助适当消化而保持动物健康，并且/或者支持免疫系统功能。
[0191]FCR可根据仔猪生长试验确定，所述仔猪生长试验包括将其中包含本发明的猪乳酸菌的饲料以合适的浓度(每kg饲料)添加到动物饲料中的第一处理和不向动物饲料添加本发明的猪乳酸菌的第二处理(对照)。在本发明的上下文中，术语饲料转化率或FCR与术语饲料转化率(feed convers1n)同义。FCR被计算为相对于体重增加(以g/动物表示)的饲料摄入量(以g/动物表示)。如通常所知的，改善的FCR比对照FCR低。在具体实施方案中，与对照相比，FCR改善(即，减少)了至少1.0%，优选至少1.5%、1.6%、1.7%、1.8%U.9%,2.0%,2.1%,2.2%,2.3%,2.4%或至少 2.5%。
[0192]本文中使用的术语“消化道(gut)”是指胃肠道或消化管(还称为消化通道(alimentary canal)),其是指在多细胞动物中摄取食物、消化食物从而吸取能量和营养素并排出残余废物的器官系统。
[0193]本文使用的术语消化道“微生物群”是指驻留在消化道中并通过帮助适当的消化和/或支持免疫系统功能来保持健康的天然微生物培养物。
[0194]本文使用的与消化道微生物群相关的术语“调节”通常意指变化、操纵、改变或调整健康且机能正常的动物的机能或其状态，即非治疗使用。
[0195]稀释剂、赋形剂和载体
[0196]如上文所提及的，本发明还涉及包含本发明的乳酸菌菌株的组合物，更优选药物组合物。本发明的乳酸菌菌株通常在与药用载体、赋形剂或稀释剂的混合物中给予，尤其是用于人治疗。所述药物组合物可以在人医学或是兽医学中用于人或动物使用。
[0197]对于本文记载的多种不同形式的药物组合物而言，这种合适的赋形剂的实例可以在A Wade和PJ Weller编辑的“Handbook of Pharmaceutical Excipients,第2版，(1994)中找到。
[0198]用于治疗用途的可接受的载体或稀释剂在制药领域是熟知的，记载于例如 Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing C0.(A.R.Gennaroedit.1985)。
[0199]合适的载体的实例包括乳糖、淀粉、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、甘露醇、山梨醇等。合适的稀释剂的实例包括乙醇、甘油和水。
[0200]可根据预定给药途径和标准的药学实践选择药用载体、赋形剂或稀释剂。药物组合物可包括作为或除所述载体、赋形剂或稀释剂之外的任何合适的一种或多种粘合剂、一种或多种润滑剂、一种或多种悬浮剂、一种或多种包衣剂、一种或多种增溶剂。
[0201]合适的粘合剂的实例包括淀粉、明胶、天然糖如葡萄糖、无水乳糖、自由流动乳糖、β -乳糖、玉米甜味剂、天然和合成胶如阿拉伯胶、黄蓍胶或海藻酸钠、羧甲基纤维素和聚乙二醇。
[0202]合适的润滑剂的实例包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。
[0203]在药物组合物中可提供防腐剂、稳定剂、染料和甚至调味剂。防腐剂的实例包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸的酯。还可使用抗氧化剂和悬浮剂。
[0204]给药
[0205]本发明的组合物可适于口服、直肠、阴道、肠胃外、肌内、腹膜内、动脉内、鞘内、支气管内、皮下、皮内、静脉内、鼻、口腔或舌下给药途径。优选地，本发明的组合物适于口服、直肠、阴道、肠胃外、鼻、口腔或舌下给药途径。
[0206]对于口服给药，特别是使用压制片剂、丸剂、片剂、凝胶剂(gellule)、滴剂和胶囊剂。
[0207]其他给药形式包括溶液或乳液，它们可通过静脉内、动脉内、鞘内、皮下、皮内、腹膜内或肌内注射，并由无菌或可灭菌溶液制备。本发明的药物组合物还可为栓剂、阴道栓剂、混悬剂、乳剂、洗剂、软膏剂、乳膏剂、凝胶剂、喷雾剂、溶液或扑粉剂的形式。
[0208]经皮给药的替代方式是通过使用皮肤贴片。例如，可将有效成分纳入到由聚乙二醇水性乳液或液体石蜡组成的乳膏剂内。还可以将乳酸菌菌株纳入到由白蜡或白色软石蜡基质与可能需要的稳定剂和防腐剂共同组成的软膏剂内。
[0209]组合物可被配制成单位剂型，即形式是包含单位剂量的离散部分或者单位剂量的多重单位或亚单位。
[0210]剂量
[0211]本领域的普通技术人员不用过度实验就可容易地确定一种速溶组合物的适宜剂量以给予受试者。通常，医师会确定对个体患者最适合的实际剂量，其取决于多种因素，包括所使用的具体菌株的活性、该菌株的新陈代谢稳定性和作用长短、年龄、体重、平常健康状况、性别、饮食、给药方式和时间、排泄速度、药物组合、具体病症的严重程度和个体正进行的治疗。本文公开的剂量是一般情况的示例。当然也可有使用更高或更低剂量范围的个别情况，这都在本发明的范围内。
[0212]人或动物中通常有效的每日剂量是约I X 13-约I X 1011，更优选约IXlO7-约I X 111，甚至更优选约 IXlO6-约 I X 110CFU0
[0213]组合
[0214]在一个优选的实施方案中，本发明的组合物以任意组合给予，例如两种或多种所述乳酸菌可以任何组合或比例给予。
[0215]在另一尤其优选的实施方案中，本发明的组合物与一种或多种其他活性剂组合给予。在这样的情况中，本发明的组合物可以与所述一种或多种其他活性剂连续、同时或相继给予。
[0216]菌株的分离和表征
[0217]从有机饲养的猪的粪便分离的LAB菌株(挑选了总共436个单独的菌落)主要是路氏乳杆菌、约氏乳杆菌、加氏乳杆菌、戊糖乳杆菌菌株，还有少量的植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、阴道乳杆菌，和一株粘膜乳杆菌，以及若干未培养的菌株。
[0218]大多数所述LAB产生可在体外抑制肠炎沙门氏菌和/或大肠杆菌K88生长的物质。这些抗病原体效应的效能在个体菌株之间大不相同。
[0219]根据在体外确定的抗微生物效能选择了一些菌株。对这些细菌在体外阻断病原体附着/侵入猪小肠上皮细胞(IPEC)的能力和其对抗生素的敏感性进行进一步筛选。
[0220]对一些菌株的底物范围和特异性以及其在体外抑制IPEC细胞中的炎症的能力进行测定。从这些菌株中鉴定出十四种具有有利特性的LAB(5种约氏乳杆菌、6种路氏乳杆菌和3种植物乳杆菌)。将这些菌株中的两种[GGDK266和GGDK31]大量制备，用于在新断奶的仔猪中进行体内评估。在这组14种LAB中存在其他可能重要的候选者。
[0221]当进行冷冻干燥并将干燥的LAB保存在脱脂奶粉中时，生存力的少量损失是明显的。脱脂奶粉与单糖结合会稍微好一些，但是难以保持。将GGDK266和GGDK31的大量制备物冷冻干燥并保存在该介质中。
[0222]获得了五种热条件下的LAB培养物。然而，三种菌株的体外生物特性和益生菌潜能受到热处理的不利影响。虽然如此，所述细菌中的两种仍保留了天然未加热处理形式的生物特性。
[0223]使小鼠口服猪LAB (路氏乳杆菌或粘膜乳杆菌)的处理极大地降低了急性(C57B1/6小鼠)和慢性((C3H/HeN小鼠)形式的沙门氏菌病中肠炎沙门氏菌的致病性。
[0224]所述数据表明，来自有机饲养的猪的LAB有相当的潜力作为新且有效力的益生菌的来源。
[0225]本 申请人:进行的研究包括从有机饲养的猪分离大量的LAB和通过在体外和体内评估其生物效能和作用方式筛选有效力的益生性LAB菌株。
[0226]更具体地，进行实验以建立源自有机饲养的猪的粪便的LAB的培养物。对所述LAB菌株在体外对多种病原体的抗微生物活性进行了筛选。进行实验以确定所述LAB菌株在体外是否可阻断病原体附着到猪上皮细胞上。还进行研究以评估LAB在体外阻断猪上皮细胞中的炎症应答的能力。选择在体外展示出良好的生物活性谱的菌株并大量培养用于体内大规模研究。
[0227]实验技术的更多细节记载于所附的实施例部分。简言之，使用选择性微生物培养基从猪粪便分离LAB菌株并培养。分离单独的菌落并分析16S rRNA基因序列以使得能够对菌株进行基因型鉴定。在测量附着、抗细菌和抗炎活性、抗生素敏感性和最终的热稳定性之后进一步确定潜在益生菌的表型特征。使用孔扩散测定评估了衍生自LAB的条件培养基的抗细菌活性，以确定对肠道病原体肠炎沙门氏菌和大肠杆菌K88的杀死活性。还评估了LAB菌株阻断或干扰肠炎沙门氏菌和大肠杆菌K88附着/侵入猪上皮细胞(IPEC)的能力，以及LAB菌株抑制由12-氧-十四烷酰戟二萜醇-13-乙酸酯[PMA]诱导的IPEC细胞中的炎症的能力。另外，还确定了 LAB菌株的代谢特性(API CH50试剂盒)和其对抗生素的敏感性。建立了基于对LAB的生物特性进行评分的分级系统，所述分级系统用于选择候选LAB菌株，用于体内益生菌评估。
[0228]上述实验的结果的更多细节记载于所附的实施例中。
[0229]从有机饲养的猪的粪便分离的LAB(挑选了 436个单独的菌落)主要是约氏乳杆菌或约氏乳杆菌相关的菌株以及路氏乳杆菌或路氏乳杆菌相关的菌株，以及少量的植物乳杆菌相关的菌株和未培养的菌株。这表示比其他人的报道(Martin et al, 2009 ；Yunet al,2009 ； Liihtei?en et al, 2010 ；Yao et al，2011)更窄的猪相关 LAB 的范围。然而，与常规/集中饲养的猪相比，室外有机饲养的猪具有高水平的LAB和更发达的肠免疫功能(Mulder et al, 2009) 0本发明的细菌数据表明，约氏乳杆菌和路氏乳杆菌菌株在幼猪消化道和免疫系统的恰当发育中尤其重要。另外，包含衍生自有机饲养的猪的消化道或粪便的其他乳酸菌，尤其是德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)和食淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorous),可增强路氏乳杆菌、植物乳杆菌和约氏乳杆菌的免疫稳态特性。
[0230]在孔扩散测定中所有分离的猪LAB产生可杀死肠炎沙门氏菌或干扰其生长并且杀死大部分大肠杆菌K88或抑制其生长的物质。在个体菌落之间抗微生物活性的效能大不相同，不论其是否是路氏乳杆菌、约氏乳杆菌或植物乳杆菌。各LAB的抗沙门氏菌和抗大肠杆菌K88效能之间没有普遍相关性。已知，LAB可产生一系列的活性因子，包括有机酸、小的抗微生物化合物和抗细菌肽(Cintas et al, 2001) 0由来自有机饲养的猪的LAB产生的这些抗微生物物质的性质尚未确定。
[0231]测试了基于抗病原体活性选择的三十三种猪LAB菌株阻断肠炎沙门氏菌和大肠杆菌K88附着/侵入IPEC细胞的能力。它们都能够显著地减少沙门氏菌附着/侵入IPEC细胞。大多数还可阻断大肠杆菌K88。就病原体杀死而言，在所述LAB阻断沙门氏菌和大肠杆菌K88的能力之间没有普遍相关性。不希望囿于理论，现认为LAB可通过占据单层细胞上的结合位点或通过产生可干扰病原体附着到上皮细胞上(例如阻断表面粘附素的结合位点)的因子，来限制所述病原体接触上皮细胞层(Ljungh and Wadstrom, 2006 ；Blandinoet al, 2008 ；ffilliams, 2010)。
[0232]猪LAB还可阻断或抑制IPEC细胞中由PMA触发的炎性基因(白细胞介素_8:1L-8)表达。各个培养物影响炎症的能力大不相同，但是五种菌株(RINH瓶编号29、30、31、86和266)具有强的抗炎特性。已知，一些LAB菌株具有免疫调节或抗炎特性(Cotter etal, 2005 ；Blandino et al, 2008 ；0hashi and Ushidaj2009 ；Elmadfa et al, 2010 ；Liu etal, 2010)。所涉及的机制仍然不清楚，但是很可能涉及通过所述LAB产生的生物活性因子来调节分子信号传递系统。
[0233]抗生素抗性是越来越严重的问题，并且可通过基因转移在细菌间传播(Korhonenet al, 2007 ；Gousia et al，2011 ;Nicolau，2011)。理想的是，候选益生菌应几乎没有或没有对抗生素的抗性，以使抗性基因转移至宿主菌群的风险最小。对猪LAB(33种菌株)针对10种单独抗生素的抗性进行了筛选。一种菌株(RINH瓶编号266)对所有测试的抗生素敏感。大部分对氨苄西林、头孢噻肟、氯霉素、红霉素、艮他霉素、四环素和万古霉素敏感。然而，大部分展现出对甲硝唑、萘啶酸的抗性以及对卡那霉素的较小程度的抗性。在这些LAB分离株中这种相对低的抗生素抗性发生率可能与源仔猪饲养的环境[有机室外饲养]有关(Mulder et al, 2009)。
[0234]如所预期的那样，当使用API CH50试剂盒进行测定时，约氏乳杆菌、路氏乳杆菌和植物乳杆菌展现出菌株特异性的一般底物反应谱。然而，大多数基因型菌株的底物反应性展现出细微差异。这表明它们是属于所述基因型的独特个体菌株。
[0235]基于其体外生物活性，经鉴定14种LAB [4种植物乳杆菌相关菌株，3种约氏乳杆菌相关菌株和I种路氏乳杆菌]有潜力用于体内测试。大量制备这些LAB菌株中的两种[GGDK266和GGDK31]。有趣的是，所述14种LAB中的7种(RINH瓶编号85、86、131、230、255,266)已从补充有来自猪初乳的碳水化合物级分的LAB选择性琼脂中分离出来。LAB的生长和生物活性谱部分地取决于其在其中生长的碳水化合物底物(Gopal et al, 2001 ；Tzortzis et al, 2004)。本发明的数据可表明所述LAB中的一些是宿主适应性的并且需要某些猪相关碳水化合物用于最佳生长或生物活性。
[0236]如果所述LAB可以经受住冷冻干燥以使它们作为益生菌可被处理或加工，那么这是有利的。然而，在进行冷冻和干燥的过程中，它们的生存力可极大地降低(Tomaset al, 2009 ；Strasser et al, 2009 ；Reddy et al, 2009)。常常单独地或结合单糖使用脱脂奶粉，作为冷冻保护剂以保持所述细菌的生存力(Tomas et al, 2009 ；Strasser etal，2009)。在本发明的研究中，将猪LAB干燥并仅保存在脱脂奶粉中时，生存力的少量损失是明显的。蔗糖或乳糖结合脱脂奶粉的保护性略好一些。然而，所述产品是易潮湿的并且难以保存或处理。因此，决定将猪LAB干燥并保存在脱脂奶粉中。
[0237]用于动物的补充饲料常常作为丸粒给予，所述丸粒的产生涉及高温(De Angeliset al, 2006)。因此，要加入动物饲料的LAB应该具有很大程度的热稳定性，以使加工期间生存力的损失最小。在本发明的研究中，使五种LAB经受三次在70°C持续15分钟的加热。在第三次加热处理后回收的所述细菌全部都是活的并且在大多数情况下，所述细菌以类似于所述细菌的天然形式的速率生长。所述细菌中的两种保留了天然的未加热处理形式的生物特性。然而，所述加热处理的菌株中的一种丧失了在体外阻断病原体附着至上皮细胞上的能力，而另一种的阻断活性大大减小。还有一种菌株不能在体外阻断上皮细胞中PMA诱导的炎症，虽然其天然形式是强的炎症抑制剂。因此，加热处理可差别化地影响个体LAB的生物活性。当考虑将LAB包括在压成丸粒的动物饲料中时，需要将此纳入到考量之中。
[0238] 实验证明，如果用衍生自有机饲养的猪的LAB共处理小鼠，那么肠炎沙门氏菌的致病性被减弱。RINH瓶编号323 (粘膜乳杆菌)大大降低了急性(C57B1/6小鼠)和慢性(C3H/Hen小鼠)沙门氏菌病中肠炎沙门氏菌侵入、传播到全身性组织并在其中增殖的能力。此外，RINH瓶编号31 [GGDK31] ,RINH瓶编号32、RINH瓶编号46或RINH瓶编号47 (均为路氏乳杆菌)在C3H/HeN小鼠中减少了肠炎沙门氏菌的大肠定殖、侵入和全身性扩散以及增殖。总之，RINH瓶编号31 [GGDK31]和RINH瓶编号32在该沙门氏菌病慢性模型中最有效。这些LAB有潜力作为新的益生菌，以在体内改善消化道健康并增加对感染的抵抗力。
[0239]由沙门氏菌引起的感染是多因素过程(Naughton and Grant, 2005)。肠炎沙门氏菌在整个胃肠道定殖，移动穿过粘液层并附着到粘膜上。大肠充当所述病原体的容器，但侵入主要经M细胞进行,所述M细胞存在于回肠的派伊尔淋巴集结(Peyer’ s patches)。大多数侵入的沙门氏菌传播到肠系膜淋巴结，然后出来传播至肝和脾(Naughton andGrant, 2005)。不希望囿于理论,现认为LAB可在感染的多个阶段阻断沙门氏菌(Cintas etal, 2001 ；Cotter et al, 2005 ；0hashi and Ushida, 2009)。通过竞争营养素、杀死病原体或阻断附着位点，LAB可限制所述大肠容器中沙门氏菌的数量。LAB还可以以与本文中用IPEC-J2细胞和用Caco-2细胞(Neeser et al, 2000)所观察到的方式类似的方式防止附着到回肠粘膜细胞上，从而限制侵入。或者，LAB可直接调节对感染的宿主应答，尤其是抑制炎症。通过限制消化道损伤和保留屏障完整性(Smith et al, 2008 ；Schreiber et al, 2009),大大地降低了沙门氏菌侵入和传播的能力。
【专利附图】

【附图说明】
[0240]本发明通过非限制性实施例并参考以下非限制性附图进一步描述，其中:
[0241]图1示出了来自乳酸菌的条件培养基的抗细菌活性测定。
[0242]图2a和b示出了从有机饲养的猪的粪便培养的所有个体LAB的条件培养基对肠炎沙门氏菌S1400的抑制活性(以孔扩散测定中的抑制面积表示)。
[0243]图3a和b示出了从有机饲养的猪的粪便培养的所有个体LAB的条件培养基对大肠杆菌K88的抑制活性(以孔扩散测定中的抑制面积表示)。
[0244]图3c和d示出了从有机饲养的猪的粪便培养的所有个体LAB的条件培养基的抑制活性(以孔扩散测定中的抑制的面积表示)。
[0245]图4a、b、c示出了从有机饲养的猪的粪便培养的LAB对(a)肠炎沙门氏菌S1400，和(b)大肠杆菌K88粘附到培养物中的IPEC细胞的抑制；(c)对肠炎沙门氏菌S1400和(b)大肠杆菌K88的抑制的比较。
[0246]图5示出了使用以确定量的抗生素浸透的圆片进行的乳酸菌抗生素敏感性测定。
[0247]图6示出了使用API CH50试剂盒进行的对LAB底物谱的评估[49种底物，淡色表示阳性反应，除了 25中阳性反应是黑色以外，深色表示没有反应]。
[0248]图7示出了用PMA和猪LAB处理的IPEC细胞中IL-8基因表达的Λ Ct (a)，比例(b)和倍数变化(C)。
[0249]图8示出了在脱脂奶粉SKP，(100g/l)、SKP+乳糖(均为100g/l)、SKP+蔗糖(均为100g/l)或SKP(200g/l)中冷冻干燥之后猪LAB的稳定性。
[0250]图9示出了分离的LAB对热处理的稳定性(a)，在用PMA和天然的或加热处理的猪LAB处理的IPEC细胞中IL-8基因表达的比例(b)和倍数变化(c) ； (d)天然的和热处理的RINH瓶编号31的抗生素敏感性。
[0251]图10示出了进行C3H/HeN小鼠研究的方案，以在体内评估瓶编号323(粘膜乳杆菌)抗沙门氏菌感染的效能。
[0252]图lla-c示出了在已用或未用323 (粘膜乳杆菌，LM)共处理的C3H/HeN小鼠中在感染后第10天肠炎沙门氏菌S1400在组织中的分布。
[0253]图12a_b示出了已用或未用瓶编号323 (粘膜乳杆菌)共处理的C3H/HeN小鼠在感染后第10天的脾重(mg/100g Bff)和肠(回肠)髓过氧化物酶(μ g)。
[0254]图13示出了进行C57B1/6小鼠研究的方案，以在体内评估瓶编号323 (粘膜乳杆菌)抗急性沙门氏菌感染的效能。
[0255]图14a_c示出了在已用或未用RINH瓶编号323共处理的C57B1/6小鼠中在感染后第6天肠炎沙门氏菌S1400在组织中的分布。
[0256]图15示出了已用或未用瓶编号323 (粘膜乳杆菌)共处理的C57B1/6小鼠在感染后第6天的脾重(mg/100g Bff) ο
[0257]图16示出了进行C3H/HeN小鼠研究的方案，以在体内评估从有机饲养猪的粪便选出的LAB抗沙门氏菌感染的效能。
[0258]图17a和b示出了已用或未用选择的LAB共处理的C3H/HeN小鼠在感染后第7_8天的粪便中肠炎沙门氏菌的排泄。
[0259]图18a_b示出了已用或未用选择的LAB共处理的C3H/HeN小鼠在感染后第10天回肠(a)、盲肠(b)和结肠(c)中肠炎沙门氏菌的分布(LoglOCFU/g)。
[0260]图19a_c示出了已用或未用选择的LAB共处理的C3H/HeN小鼠在感染后第10天肠系膜淋巴结(a)、肝(b)和脾(c)中肠炎沙门氏菌的分布(LoglOCFU/g)。
[0261]图20示出了喂食GGDK266和GGDK31的猪与对照在第0_7、7_14和0_14天的表现(日体重增加，DWG,以g/天表示)。
[0262]图21示出了使用变性凝胶梯度电泳(DGGE，试验I)进行的微生物多样性分析。使用通用引物进行的DGGE表明在所述处理和安慰剂之间总微生物多样性没有差异。通过银染色法使凝胶上的带可见。
[0263]图22示出了使用DGGE进行的微生物多样性分析。使用乳酸菌(LAB)特异性引物进行的DGGE表明在盲肠和回肠样品中在用GGDK266和安慰剂进行的处理之间有LAB多样性的显著差异。通过银染色法使凝胶上的带可见。
[0264]图23示出了使用DGGE进行的微生物多样性分析。使用乳酸菌(LAB)特异性引物进行的DGGE表明在回肠样品中在用GGDK266和安慰剂进行的处理之间有LAB多样性的显著差异。通过银染色法使凝胶上的带可见。
[0265]图24示出了使用DGGE进行的微生物多样性分析。使用乳酸菌(LAB)特异性引物进行的DGGE表明在盲肠样品中在用GGDK266和安慰剂进行的处理之间有LAB多样性的显著差异。通过银染色法使凝胶上的带可见。
[0266]图25示出了口服给予GGDK266显著下调的基因本体论生物学过程。
[0267]图26示出了在用GGDK266处理的动物与用安慰剂处理的动物中免疫应答和对刺激的应答的变化(基因的百分数与一系列不同的GO注释)。
[0268]图27示出了口服给予GGDK266显著富集的基因本体论生物学过程。
[0269]实施例
[0270]材料和方法
[0271]材料:这些研究使用了在室外和室内饲养的猪的研究过程中收集的猪粪便样品(Mulder et al, 2009) 0培养物保藏主要基于从冷冻样品411、412和416收集的LAB，所述冷冻样品411、412和416来自其粪便中LAB水平尤其高的室外饲养猪。
[0272]MRS肉汤培养基预混物、琼脂和万古霉素、厌氧菌气体组件(gas pack)和指示器以及抗生素圆片购自Oxoid,厌氧菌催化剂购自Fisher Scientific,半胱氨酸-HCL、溴甲酹绿和脱脂奶粉购自Sigma-Aldrich。猪初乳碳水化合物级分作为D.Kelly的SMART163计划的一部分制备。DNA提取试剂盒购自MP B1medicals, PCR试剂和提纯试剂盒(clean-upkit)购自 Promega。API CH50 试剂盒购自 B1merieux UK Ltd。
[0273]标准培养基:MRS肉汤培养基和MRS琼脂根据制造商的说明书制备。LAMVAB琼脂根据Jackson et al.(2002)的方法制备。琼脂平板在使用前立即制备。在厌氧条件下将MRS肉汤培养基慢慢倒入(1ml/管)至无菌的Hungate管中并在室温下保存。
[0274]补充碳水化合物的培养基:将猪初乳的SMART163硫酸铵沉淀物(在0、20、25、30、35、45、50、55或65%饱和度下沉淀或在65%饱和度下可溶)与从15ml或50ml初乳中回收的量成比例地称出。将碳水化合物级分各自分散在15ml的MRS或LAMVAB琼脂中，维持在45°C，然后向各个平板倒入每种级分。还将它们分散在MRS肉汤培养基(50ml)中，所述补充的肉汤培养基在厌氧条件下被慢慢倒入到8根(6ml/管)无菌Hungate管中。
[0275]动物:雌性C3H/HeN和C57 B1/6小鼠(5_6周龄)购自Harlan UK。将它们在置于2级防范设施中的HEPA-过滤的fIexifilm隔离器内的标准笼子(caging)中成组或成对饲养。它们一直自由获得高质量的啮齿动物食物和无菌去离子水，并且容许它们在开始实验前适应新环境 7_10 天。根据 UK Animals (Scientific Procedures) Actl986, RowettInstitute of Nutrit1n and Health (RINH)获得了许可。本文的研究由持有 Home OfficePersonal Licence的职员在经批准的Home Office Project Licence的支持下进行(如UK Animals (Scientific Procedures) Actl986 中所定义和列出的)，并且由 RINH EthicalReview Committee 审查和批准。
[0276]方法
[0277]LAB的培养:在最初的研究中，将少量的冷冻粪便(10mg)分散在Iml的最大恢复稀释剂(MRD)中。制备了两种进一步连续10倍的稀释液。将所有三种悬浮物在MRS或LAMVAB琼脂平板上划线。在之后的研究中，将所述粪便样品分散在5ml的MRD中，进一步在MRD中稀释(1:40)，将该稀释液的0.5ml涂布在含或不含补充的猪初乳碳水化合物的MRS或LAMVAB琼脂平板的表面上。在所有情况中，将所述平板在厌氧培养罐中在37°C孵育72小时。从所述琼脂平板挑出不同的菌落(至少8个/平板)并将其接种到含有MRS肉汤培养基的Hungate管中或含有猪初乳碳水化合物的合适MRS肉汤培养基的Hungate管中。将所述管在37°C孵育48小时。
[0278]冷冻原种:将每种培养物的小份(0.7ml)用无菌注射器和针头吸出并加至塑料管中，所述塑料管用CO2吹洗，含有0.3ml甘油和2mg L-半胱氨酸。将所述管用塑料塞子密封、标记、混合内容物、冷冻并保存在_80°C。
[0279]条件培养基:将剩余的培养物转移至Corningl5ml离心管中，在室温、100g下离心5分钟，慢慢倒出上清液，分装并冷冻。将片状沉淀物立即提取用于16S rRNA基因分析或冷冻。
[0280]16S rRNA 基因分析(Clarridge, 2004):使用FastDN'A暴 Spin kit for Soil结合Fastprepl20珠磨(bead beater)系统根据所述试剂盒提供的方案提取细菌DNA。进行 PCR (反应混合物:缓冲液，10 μ I。dNTP(2mM)，5y I。27F 引物(20pmol/μ I)，2 μ I。1492R 引物(20pmol/yl)。2 μ I Go Taq Flexi 聚合酶，0.5 μ I。MgC12，5 μ 1.Η20，23.5 μ I 和 2 μ I 提取的 DNA)，使用 MJ Research PTC-200Peltier Thermal Cycler 运行35个循环:95°C持续3分钟，95°C持续30秒，57°C持续30秒和72°C持续2分钟。引物:27F (FOl) AGAGTTTGATCCTGGCTCAG ； 1492R (RP2) ACGGCTACCTTGTTACGACTT。PCR 产物提纯使用Wizard? SV Gel和PCR Clean-up试剂盒(Promega)根据制造商的说明书完成。对16SPCR产物使用基于毛细管电泳技术的全自动基因分析仪(Genomics Sect1n, RINH, UoA)，使用反向引物和正向引物519R和926F进行测序。通过使用BLAST (http://blast, ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi)将序列与已知细菌DNA序列进行比较来鉴定菌株。
[0281]抗微生物活性:XLD琼脂按照制造商的说明书制备并冷却至45°C。将肠炎沙门氏菌S1400加入至所述XLD琼脂(在200mlXLD琼脂中加入1ml的1:1000稀释的沙门氏菌过夜培养物，以得到相当于106CFU/ml的浓度)。将所述琼脂倒入培养皿中并使其凝固。将所述平板标记分隔成四个象限，并在每个象限中切出约5mm的孔。向所述孔加入条件培养基或MRS肉汤培养基的小份(60 μ I)。盖上所述平板并将其在37°C孵育16小时。使用数字照相机给它们拍照。将图像转移到Photoshop，使用测量工具确定所述孔和抑菌圈的直径。计算数值并将其存储于Excel电子表格。除了使用MacConkey No3琼脂以外,对大肠杆菌K88进行相同的操作。
[0282]抗生素敏感性:将猪LAB[0.5ml的1:100稀释的过夜培养物]涂布在MRS琼脂[90mm]平板的表面上并干燥。将所述平板标记分隔成四个象限，并在每个象限中放置含抗生素的圆片[氨卡西林，10 μ g。头孢噻I亏,30 μ g。氯霉素，10 μ g。红霉素，15 μ g。艮他霉素，10 μ g。卡那霉素,30 μ g。甲硝唑,50 μ g。萘啶酸,30 μ g。四环素,30 μ g。万古霉素，30 μ g]。将所述平板盖上，置于厌氧培养罐中并在37°C孵育24小时。使用数字照相机给所述平板拍照。将图像转移到Photoshop，使用测量工具确定抑菌圈的直径。计算数值并将其存储于Excel电子表格。
[0283]在体外防止沙门氏菌的附着/侵入:在24孔板中培养单层IPEC-J2细胞至汇合后3天，在使用前24小时加入DTS培养基进行同步化。将猪LAB的过夜培养物(1ml)离心[在室温下100gX 5分钟]，将所述细菌重悬于Iml磷酸盐缓冲盐水[PBS]。向所述孔加入LAB的小份(50 μ I)。将平板在37°C、5% C02、95%湿度下孵育2小时。将肠炎沙门氏菌血清变型Enteritidis S1400 [肠炎沙门氏菌S1400]的过夜培养物继代培养(1ml中0.5ml)至Luria Bertani (LB)培养基中，并在37°C有氧孵育2_3小时直至光密度(560nm)达到0.8。这给出了等价于lX108CFU/ml的浓度。将所述培养物离心[在室温下100gX 5分钟]，所述细菌重悬于10ml PBS0向IPEC-J2细胞的孔加入小份(50 μ I)。以用PBS处理的孔作为对照。将所述平板在37°C、5% C02、95%湿度下再孵育2小时。IPEC-J2细胞单层用HBSS洗涤5次。每孔加入含Triton-XlOO (10ml/L)的PBS溶液(0.5ml)，刮下所述单细胞层并使其分散。通过Miles and Misra法[Robertson et al, 2003]在XLD琼脂平板上(在37°C孵育24小时)估计活沙门氏菌。LAB通过所述相同的方法确定(在37°C厌氧孵育48小时)。
[0284]抑制炎症应答:在24孔板中培养单层IPEC-J2细胞至汇合后3天，在使用前24小时通过加入DTS培养基进行同步化。将猪LAB的过夜培养物(1ml)离心[在室温下100gX 5分钟]，所述细菌重悬于Iml的PBS。向每个孔[每个样品3个孔]加入LAB的小份(50 μ I)和每孔220ng的12-氧-十四烷酰戟二萜醇_13_乙酸酯[PMA]。仅PMA或PBS作为对照。将所述平板在37°C、5% C02、95%湿度下孵育2小时。从所述培养皿除去培养基，并将所述细胞用PBS洗涤2次。向每个孔加入含巯基乙醇的RLT缓冲液(0.5ml)，将所述细胞刮下并转移至eppendorf管[将从3个孔刮下的每个样品合并]。RNA提取使用IRNfiiSiV必Mini试剂盒根据制造商的说明书进行，反转录用高容量cDNA ReverseTranscript1n Kit (Applied B1systems)进行。实时 PCR 在运行 7500Fast Systemvl.4.0Sequence Detect1n Softwarel.4 版的 7500Fast Real-time PCR 系统(AppliedB1system)上进行。用于猪 IL-8 和 TNF-α 的引物[IPEC-J2，SY100604186-096IL-8-2 反向，SY100604186-090TNFla 反向，SY100604186-095IL-82 正向，SY100604186_089TNFal 正向，和 SY100604186-093]由 Sigma Aldrich 制备。反应混合物是:10 μ I Power SybergreenMaster mix，2.5 μ I正向引物，2.5 μ I反向引物和5 μ I cDNA，然后实时PCR根据标准的7500 方案运行(95°C，10min，l 个循环。95°C，15sec，40 个循环。60°C，lmin，40 个循环。95°C，15sec，l 个循环。60°C，lmin，I 个循环。95°C，15sec，I 个循环。60°C，15sec，I 个循环)。分析IL-8和TNF-α基因的表达并将其与“持家”基因β -肌动蛋白的表达作比较。为了进行比较，数值以IL-8/ β -肌动蛋白和TNF- a / β -肌动蛋白的比例或倍数变化给出。
[0285]例如:
[0286]a.计算 IL- 8 的 Δ Ct (2h) [Ct IL-8 减去 Ct β -肌动蛋白]
[0287]b.计算 PMA 的 Λ Ct (2h) [Ct PMA 减去 Ct β -肌动蛋白]
[0288]c.将 ACt(IL-8)除以 Δ Ct (PMA)
[0289]d.将数值向上取整
[0290]底物反应性:使用API CH试剂盒(B1merieux UK Ltd)确定个体LAB的碳水化合物反应性。测定根据制造商的说明书进行，在37°C孵育24小时和48小时后记录反应。在API CH50平板上有50个小囊(capule)。这些小囊含有各种可能的底物和阴性对照。底物的范围如下:单糖16种、单糖/醇4种、二糖8种、三糖2种、多糖3种、醇6种、其他7种。对于每个底物组，计数阳性反应的数量。将该数量除以可能的最大值以给出该底物组的排名。对所述细菌而言，所有底物得分的总和给出了总排名。高排名指示了广谱的底物反应性。
[0291]LAB的热处理:将少量的冷冻粪便(10mg)分散在5ml的最大恢复稀释剂(MRD)中。使沉积物沉降并将上层倒入印pendorf管中(lml/管)。将所述管在50°C、60°C或70°C加热10分钟。将各小份(0.4ml)铺在MRS琼脂上，并在厌氧培养罐中在37°C孵育72小时。在70°C加热后检测到少量的菌落。将不同的菌落挑出，接种到含MRS肉汤培养基的Hungate管中并在37°C孵育48小时。
[0292]在第二个研究中，将少量的冷冻粪便(10mg)分散在5ml的最大恢复稀释剂(MRD)中。使沉积物沉降并将上层倒入印pendorf管中(lml/管)。将所述管在50°C加热持续20分钟、在50°C持续20分钟加60°C持续20分钟或者在50°C持续20分钟加60°C持续20分钟加70°C持续20分钟。将各小份(0.5ml)铺在MRS琼脂上，并在厌氧培养罐中在37°C孵育48小时。检测到少量的菌落，并将其挑出，接种到含MRS肉汤培养基的Hungate管中并在37°C孵育48小时。
[0293]在第三次研究中，将分离的猪LAB的过夜培养物(1ml)离心(在室温下100gX 5分钟)，片状沉淀物重悬于新鲜的MRS肉汤培养基(1ml)。将小份(Iml)在70°C加热15分钟，然后铺在MRS琼脂上(0.5ml)并在厌氧培养罐中在37°C孵育48小时。检测到少量的菌落，并将其挑出，接种到含MRS肉汤培养基的Hungate管中并在37°C孵育48小时。将该培养物离心，重悬于MRS肉汤培养基，在70°C再次加热15分钟，铺在MRS琼脂上，在厌氧培养罐中在37°C孵育48小时，将菌落挑出，接种到含MRS肉汤培养基的Hungate管中并在37°C孵育48小时。同先前一样，将该培养物离心，重悬于MRS肉汤培养基,在70°C再加热15分钟，铺在MRS琼脂上(0.5ml)，在厌氧培养罐中在37°C孵育48小时，将菌落挑出，接种到含MRS肉汤培养基的Hungate管中并在37°C孵育48小时。
[0294]冷冻干燥的细菌的稳定性:将LAB的过夜培养物离心(在室温下100gX 5分钟)。片状沉淀物重悬于2ml无菌PBS中并再次离心。然后，将随后的片状沉淀物重悬于5ml冷冻溶液中[脱脂的脱脂奶粉(SKP)，100g/l ;SKP+乳糖，均为100g/l ;SKP+蔗糖，均为10g/I ;*SKP，200g/l]。将所述样品在_20°C冷冻(2-3小时)，然后在-80°C过夜保存。将它们冷冻干燥48小时并将干燥的材料保存在室温下。在完成冷冻干燥后第O和约第40天和约第80天测定所述样品中活细菌。将它们铺在MRS琼脂上并在37°C厌氧孵育48小时。
[0295]GGDK31和GGDK266的大量制备:在500ml玻璃螺旋盖瓶中制备两个500ml批次的MRS肉汤培养基，将其高压灭菌(autclaved)并使其冷却至室温(接近气火焰)同时用CO2吹洗。将4ml的GGDK31或GGDK266的24小时培养物加入到每个含MRS的瓶子中并轻轻地盖上盖。将所述瓶子置于厌氧培养罐中并在37°C孵育24小时。将所述培养物在6个无菌50ml离心管中离心[在室温下100gX 5min]。丢弃上清液，用培养物再次填满管并再次离心直至回收所有的细菌。所述6个管各自含有几乎相等量的细菌。将每个管中的细菌重悬于40ml无菌PBS中，再次离心并丢弃上清液。将每个管中的细菌重悬于20ml的SKM(100g/1)，在-20°C冷冻(2-3小时)，然后在-80°C过夜，冷冻干燥48-72小时，在4°C保存。为了评估所述样品中活细菌，将一管冻干材料重悬于20ml MRS肉汤培养基中，在室温孵育2小时，稀释，铺在MRS琼脂上并在37°C厌氧孵育48小时。
[0296]粘膜乳杆菌体内研究1:在第-7、-4、-2和O天给予16只出周龄)雌性C3H/HeN小鼠瓶编号323的过夜培养物(粘膜乳杆菌；50μ I ;>109CFU)，此后每日给予直至第+9天。给予另外16只小鼠(对照)培养基。在第O天，通过强饲法给予8只小鼠(粘膜乳杆菌处理的)和8只对照小鼠单次剂量的肠炎沙门氏菌S1400(50y I 108CFU)。另外，给予8只小鼠(粘膜乳杆菌处理的)和8只对照小鼠单次剂量的培养基。在沙门氏菌感染后每日两次监测体重和健康得分。在沙门氏菌感染后第10天对所述小鼠实施安乐死(过量异氟烷和驱血法)并解剖。在接近微生物学无菌条件下收集胃、空肠和回肠的代表性部分、盲肠加内容物、结肠加内容物、脾和肝和一个肾以及肠系膜淋巴结。将上段空肠、中段空肠、回肠、盲肠以及上行结肠和下行结肠的代表性部分置于中性缓冲福尔马林或RNA-1ater中并保存用于以后的分析。
[0297] 粘膜乳杆菌体内研究2:在第-7、-4、-2和O天给予5只(6周龄)雌性C57B1/6小鼠瓶编号323的过夜培养物(粘膜乳杆菌；50μ I ;>109CFU)，此后每日给予直至第+5天。给予另外5只小鼠培养基。在第O天，通过强饲法给予所有10只小鼠单次剂量的肠炎沙门氏菌S1400(50l.! I 107CFU)。在第6天，根据用于研究I的方法，对所述小鼠实施安乐死并解剖。
[0298]体内新的猪LAB:给予4只(6周龄)雌性C3H/HeN小鼠RINH瓶编号31的过夜培养物(路氏乳杆菌；50 μ I ；>109CFU)，四只被给予RINH瓶编号32 (路氏乳杆菌)的培养物。四只被给予瓶编号323 (粘膜乳杆菌)的培养物，4只被给予RINH瓶编号46 (路氏乳杆菌)的培养物，4只被给予RINH瓶编号47 (路氏乳杆菌)的培养物，8只被给予MRS。这在第-6、-4、-2和O天完成，并在此后每日给予直至第+9天。在第O天，通过强饲法给予所有经乳杆菌处理的小鼠和4只对照小鼠单次剂量的沙门氏菌S1400(50y I 108CFU)。另外，给予剩余4只对照小鼠单次剂量的培养基。在第10天，根据用于研究I的方法，对所述小鼠实施安乐死并解剖。
[0299]微生物学:使用Janke-Kunkel Ultra-Turrax T25组织匀衆器在20000rpm下将组织在MRD中[l:100w/v]均质化，持续30秒，空肠和回肠内容物也是如此。将最初的匀浆连续稀释(I: 10v/v)最高达8次，铺在XLD琼脂和MacConkey N0.3琼脂上，并在37°C过夜孵育。同先前一样评估活计数[Robertson et al, 2003]。
[0300]统计分析:在合适时通过与处理结果有关的单因素方差分析(ANOVA)来初步评估数据。如果ANOVA表明在所有组之间有显著差异(p〈0.05)，那么随后根据需要通过Tukey-Kramer多重比较检验或Kruskal-Wallis多重比较检验分析所述数据。这使用Instat Statistical Package (GraphPad Software Inc., San Diego, USA)进行。
[0301]基于来自所述多重比较检验的输出信息，表或图中的均值用上标字母标记。给彼此显著不同的均值(p〈0.05)分配了不同的上标字母。给彼此没有显著不同的均值分配了常见的上标字母。
[0302]结果
[0303]1.LAB 的分离
[0304]将来自有机饲养猪的粪便在选择性琼脂上铺板并在厌氧条件下孵育。从所有研究中，挑出总计436个单独的乳酸菌[LAB]菌落，接种到MRS肉汤培养基中并在厌氧条件下孵育。给予每种培养物独特的RINH瓶编号，将小份冷冻在含30%甘油和L-半胱氨酸(约2mg/ml)的MRS培养基中并在_80°C保存。进行16S rRNA基因分析，通过与已知细菌DNA序列进行比较来鉴定菌株(表1)。
[0305]培养的LAB菌落大多数是约氏乳杆菌和约氏乳杆菌相关菌株[约氏乳杆菌、约氏/加氏乳杆菌、约氏/台湾乳杆菌](240/436)和路氏乳杆菌或路氏乳杆菌相关菌株[路氏乳杆菌、路氏/桥(Lactobacillus pontis)乳杆菌、路氏/阴道乳杆菌、路氏/嗜酸乳杆菌(169/436)]。有7种植物/戊糖乳杆菌菌落，19种其他种和5种未培养的菌株。
[0306]2.体外抗沙门氏菌活性
[0307]使用孔扩散测定筛选来自分离的LAB的条件培养基对肠炎沙门氏菌S1400的抗细菌活性(图1)。
[0308]来自个体LAB菌落的条件培养基抗肠炎沙门氏菌的活性大不相同(图2a)。这不是菌株依赖性的。约氏乳杆菌中抗沙门氏菌活性的范围与路氏乳杆菌中的类似。将所述培养物基于其在体外抑制沙门氏菌的能力任意分组(图2b)。组I具有〈20000单位的抑制，组2有20000-40000单位的抑制，组3有40000-60000单位的抑制，组4有60000-80000单位的抑制，组5有80000-100000单位的抑制，组6?100000单位的抑制(图2b)。组I由14种菌株组成(总数的3.4% )，组2有95种菌株(22.8% )，组3有99种菌株(23.7%)，组4有99种菌株(23.7% )，组5有86种菌株(20.6% )，组6有24种菌株(5.8% )。后面的这一组由17种约氏乳杆菌和约氏乳杆菌相关菌株、6种路氏乳杆菌或路氏乳杆菌相关菌株以及一种未培养的菌株组成。
[0309]3.体外抗大肠杆菌K88的活性
[0310]同样，通过孔扩散测定筛选来自LAB的条件培养基抗大肠杆菌K88的活性。与沙门氏菌一样，抗大肠杆菌K88的活性在个体LAB菌落之间大不相同(图3a)。所述活性的范围和变化在约氏乳杆菌和路氏乳杆菌菌株中是类似的。一般而言，任何个体LAB的抗沙门氏菌活性和抗大肠杆菌K88活性之间没有直接关联(图3c、3d)。然而，在大肠杆菌K88组5的10种菌株中(图3b)，7种对所述两种病原体都有相对高的活性，两种对大肠杆菌K88有高活性但是对沙门氏菌有中等活性，一种主要对大肠杆菌K88有活性。
[0311]4.候选LAB的初步选择
[0312]鉴定了 33种菌株用于进一步的体外测试(表2)。这些菌株包含18种约氏乳杆菌和约氏乳杆菌相关菌株，11种路氏乳杆菌或路氏乳杆菌相关菌株，和4种植物乳杆菌和植物乳杆菌相关菌株(表2a)。
[0313]5.猪肠上皮[IPEC-J2]细胞的附着/侵入
[0314]评估了 LAB阻断肠炎沙门氏菌和大肠杆菌K88附着/侵入IPEC细胞的能力(图4a.4b.4c)。所述候选LAB均大大地减少了沙门氏菌对IPEC细胞的附着和侵入。它们中的大多数还非常有效地抗大肠杆菌K88。然而，所述菌株中的3种仅对大肠杆菌K88对IPEC细胞的附着/侵入有有限影响。
[0315]6.LAB对抗生素的敏感性
[0316]评估了所述候选LAB对一系列抗生素的敏感性(表4、图5)。除了一种菌株(RINH瓶编号266)以外，所有菌株都展现出一定程度的对单独抗生素的抗性。所有菌株对氨苄西林(10 μ g)、头孢噻肟(30 μ g)和氯霉素(10 μ g)是敏感的。大多数对红霉素(15 μ g)、艮他霉素(10 μ g)、四环素(30 μ g)和万古霉素(30 μ g)是敏感的。几乎全部菌株对甲硝唑(50 μ g)和萘啶酸(30 μ g)有抗性并且对卡那霉素(30 μ g)有较低程度的抗性。23
[0317]7.候选LAB的精选
[0318]鉴定了 23种高排名的菌株用于进一步的体外测试。
[0319]8.LAB的底物特异性
[0320]使用API CH50试剂盒筛选所述候选LAB的底物反应性(表5、表6、图6)。约氏乳杆菌、路氏乳杆菌和植物乳杆菌均展现出菌株特异性的普遍的底物反应谱。另外，每种基因型的大多数菌株展现出其底物反应性的细微差异，表明它们是独特的个体菌株。
[0321]9.猪肠上皮[IPEC-J2]细胞中炎症的抑制
[0322]测试了候选LAB阻断或抑制由12-氧-十四烷酰戟二萜醇_13_乙酸酯[PMA]在IPEC细胞中触发的炎症应答的能力(图7、表7)。所述候选菌株阻断由PMA触发的白细胞介素-8(IL-8)基因表达的能力大不相同。5种菌株(RINH瓶编号29、30、31、86和266)具有强的抗炎效应。
[0323]10.候选LAB的最终选择
[0324]经鉴定，14种菌株具有针对沙门氏菌和大肠杆菌K88的杀死和阻断活性，具有对抗生素的敏感性、碳水化合物反应性和在体外抑制炎症的能力。这些菌株中的7种是尤其优选的。所述后一组包含4种植物乳杆菌相关菌株、3种约氏乳杆菌相关菌株和一种路氏乳杆菌。将这些LAB菌株中的两种[GGDK266和GGDK31]大量制备，用于在使用新断奶的仔猪的试验中进行评估(表8)。
[0325]11.LAB的冷冻干燥和保存
[0326]评估了在脱脂奶粉[SKP]、SKP加乳糖或SKP加蔗糖中冷冻干燥后LAB的存活和生存力(图8)。当在SKP中干燥的样品在室温保存42天和84天时，生存力的少量损失是明显的。这在脱脂奶粉和结合使用糖时没那么显著。然而，24后者的制剂趋向于易潮湿并难以保持。因此，通过在脱脂奶粉中干燥所述细菌[100g/l]来制备GGDK266和GGDK31的大量制备物(表8)。
[0327]12.热处理研究
[0328]将来自有机饲养猪的粪便的悬浮物在50_70°C加热处理不同的时间，铺在MRS琼脂上，将菌落挑出并在MRS肉汤培养基中培养[RINH瓶编号417-506]。回收的菌株类型是不同的，梭菌种的比例高并且所分离的菌株对热保持敏感。
[0329]在70°C对分离的LAB培养物加热15分钟，进行3次(图9)。在第一次加热处理后，活细菌减少达3-4个对数级。然而，存活的细菌有一定程度的热抗性。当将活细菌再培养并再加热两次时，除了一个例外外，所述细菌的损失低。
[0330]在70°C加热处理3次改变了所述菌株的生物活性图9。RINH瓶编号521 (经加热处理的瓶编号255)不能阻断病原体附着到IPEC细胞上，RINH瓶编号520 (经加热处理的瓶编号230)阻止附着的能力降低。RINH瓶编号517 (经加热处理的瓶编号31)消除IPEC细胞中触发的炎症应答的能力消失。相反，RINH瓶编号518 (经加热处理的瓶编号85)和RINH瓶编号519 (经加热处理的瓶编号86)的生物学特性与天然菌株的类似。
[0331]13.小鼠感染研究
[0332]13.1粘膜乳杆菌(RINH瓶编号323)
[0333]当用高水平的肠炎沙门氏菌S1400攻击时，C3H/HeN小鼠患上持续性的但非致死性的肠和全身性感染，其具有人沙门氏菌病主要形式的许多特征。相反，当用相同的病原体攻击时，C57B1/6小鼠患上让人想到人急性感染的主要是全身性的严重感染。为了评估粘膜乳杆菌(瓶编号323)减轻沙门氏菌病的能力，在用肠炎沙门氏菌攻击之前和之后用粘膜乳杆菌处理 C3H/HeN 和 C57B1/6 小鼠(图 10、13)。在感染后第 6 (C57B1/6)或 10 (C3H/HeN)天，对所述小鼠实施安乐死并解剖。
[0334]全身性组织:口服给予粘膜乳杆菌限制了肠炎沙门氏菌在C3H/HeN和C57B1/6小鼠中引起全身性感染的能力(图lla-c;14a-c)。在小鼠的肠系膜淋巴结、肝和脾中检测到大量的活沙门氏菌。相反，如果所述小鼠已用RINH瓶编号323 (粘膜乳杆菌)共处理，那么这些组织中存在的沙门氏菌数量大大减少。沙门氏菌感染导致脾增大(图12a ;15)。在用RINH瓶编号323 (粘膜乳杆菌)和沙门氏菌两者处理的小鼠中，这种组织应答显著减弱。
[0335]肠:在用沙门氏菌或沙门氏菌加RINH瓶编号323 (粘膜乳杆菌)处理的C3H/HeN小鼠中测定了肠髓过氧化物酶[ΜΡ0]，所述髓过氧化物酶是中性粒细胞的标志物。沙门氏菌感染大大地增加了肠中的MPO，这是因为中性粒细胞被募集到针对感染的宿主应答的肠部分(图12b)。用RINH瓶编号323(粘膜乳杆菌)进行共处理降低了感染沙门氏菌的小鼠肠中的MPO活性，表明在这些动物中针对感染的肠炎症应答削弱。
[0336]13.2 新的猪 LAB
[0337]选择了 4种LAB:RINH瓶编号31、RINH瓶编号32、RINH瓶编号46和RINH瓶编号47 (均为路氏乳杆菌；分别为LR31、LR32、LR36和LR47)。为了评估它们减轻病原体感染的效能，在用肠炎沙门氏菌攻击之前和之后，用这些LAB或RINH瓶编号323 (粘膜乳杆菌，LM)处理C3H/HeN小鼠(图16)。在感染后第10天，对所述小鼠实施安乐死并解剖。如果所述小鼠已用LAB共处理，那么肠炎沙门氏菌的粪便排泄减少(图17a、b)。LR31和LR32趋向于对粪便沙门氏菌排出量有最大影响。
[0338]肠:用LR31、LR32、LM、LR46或LR47处理显著地减少了盲肠中沙门氏菌的数量(图18a)。此外，LR31、LR32、LR46和LR47使结肠中沙门氏菌的数量减少，而LM不能(图18b)。用LR31和LR32时，所述减少趋向于更大。与大肠相比，所述LAB对小肠中沙门氏菌的数量没有明显影响。
[0339]全身组织:用LR31、LR32、LM、LR46或LR47进行处理大大减少了在脾和肝中检测到的沙门氏菌的数量(图19a-c)。用LR31和LR32时，所述减少比用LM、LR46或LR47时更明显。在用LR31、LR32和LR46处理，而不是用LM或LR47处理后，肠系膜淋巴结中沙门氏菌数量降低。
[0340]讨论
[0341]从有机饲养猪的粪便分离的LAB菌株(挑选了总共436个单独的菌落)主要是路氏乳杆菌、约氏乳杆菌、加氏乳杆菌、戊糖乳杆菌菌株，还有少量的植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、阴道乳杆菌和单株粘膜乳杆菌，以及若干未培养的菌株。所述LAB的大多数产生可在体外抑制肠炎沙门氏菌和/或大肠杆菌K88生长的物质。个体菌株之间这些抗病原体物质的效能大有不同。一部分LAB抗肠炎沙门氏菌的活性高而抗大肠杆菌K88的活性低，反之亦然，但是大多数抗所述两种病原体的活性类似。
[0342]基于体外确定的抗微生物效能选择出33株菌株。进一步筛选这些细菌在体外阻断病原体附着/侵入猪肠上皮细胞(IPEC)的能力和其对抗生素的敏感性。
[0343]测定了 23种菌株的底物范围和特异性以及其在体外抑制IPEC细胞中的炎症的能力。通过这，鉴定了 14种具有尤其有利的特性的LAB(5种约氏乳杆菌、6种路氏乳杆菌和3种植物乳杆菌)。
[0344]大量制备了两种LAB菌株[GGDK266和GGDK31]，用于在新断奶的仔猪中进行体内评估。其他可能重要的候选菌株存在于该含有14种LAB的组中。
[0345]还评估了在多种溶液中冷冻干燥后LAB的存活和生存力。长期保存用脱脂奶粉干燥的样品时，生存力的少量损失是明显的。当使用脱脂奶粉和糖时，这种损失会不那么明显。然而，后者的制备物是易潮湿的并且难以保持。因此，决定使用脱脂奶粉悬浮物进行LAB的冷冻干燥和保存。将GGDK266和GGDK31的大量制备物在该介质中冷冻干燥。
[0346] 对于要在丸粒状动物饲料中使用的LAB而言，热稳定性是有用的特性。获得了 5种加热条件下活的分离猪LAB。然而，所述菌株中3种菌株的体外生物学特性和益生菌潜能受到加热处理的不利影响。虽然如此，所述细菌有2种保留了其天然未加热处理形式的生物学特性。
[0347]测试5种猪LAB(路氏乳杆菌[4]或粘膜乳杆菌[I])在体内减轻沙门氏菌病的能力。用这些LAB处理小鼠可大大地降低肠炎沙门氏菌的致病性。
[0348]14.评估口服给予有机乳杆菌益生菌菌株对消化道微生物群的调节和早期断奶猪的表现
[0349]在早期断奶仔猪上进行体内试验，以测试本发明的两种益牛菌菌株,乳杆菌菌株GGDK266 和 GGDK31,的效应。
[0350]试骀设计
[0351]动物:
[0352].24只大的-白色XRedon仔猪
[0353].早期断奶(21日龄，& 7_8kg)，在当地农场出生
[0354]?称重，然后在不同的组之间均匀分配
[0355].3种实验处理(η = 8):
[0356]A -基础饮食+安慰剂
[0357]B -基础饮食+益生菌⑶DK266，剂量10 X 112
[0358]C -基础饮食+益生菌⑶DK31，剂量1X 112
[0359]?观察期:14天
[0360]饮食:
[0361]基于大麦、小麦和大豆粉的饮食
[0362].饲料组成(％ ):
[0363]

【权利要求】
1.一种猪乳酸菌菌株，其中所述菌株的特征在于一种或多种以下特征: (i)展现出针对大肠杆菌(E.coli)的抗微生物活性的能力； (ii)展现出针对肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)的抗微生物活性的能力； (iii)抑制由12-氧-十四烷酰戟二萜醇-13-乙酸酯(PMA)诱导的IPEC细胞中的炎症的能力； (iv)阻断肠炎沙门氏菌附着或侵入IPEC细胞的能力； (v)阻断大肠杆菌附着或侵入IPEC细胞的能力； (vi)没有对选自以下的一种或多种抗生素的抗生素抗性:氨苄西林；头孢噻肟；氯霉素；红霉素；艮他霉素；四环素；万古霉素；甲硝唑；萘啶酸；和卡那霉素；和 (vii)当遭受三个循环的加热时展现出热稳定性的能力，每个循环包括在70°C的温度下加热15分钟的时间。
2.权利要求1的乳酸菌菌株，其具有选自(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(V)、(vi)和(vii)的任意两种特征。
3.权利要求1的乳酸菌菌株，其具有选自(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(V)、(vi)和(vii)的任意三种特征。
4.权利要求1的乳酸菌菌株，其具有选自(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(V)、(vi)和(vii)的任意四种特征。
5.权利要求1的乳酸菌菌株，其具有选自(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(V)、(vi)和(vii)的任意五种特征。
6.权利要求1的乳酸菌菌株，其具有选自(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(V)、(vi)和(vii)的任意六种特征。
7.权利要求1的乳酸菌菌株，其具有所有七种特征:(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(V)、(vi)和(vii)。
8.前述权利要求任一项的乳酸菌菌株，选自约氏乳杆菌(L.johnsonii)、路氏乳杆菌(L.reuteri)>植物乳杆菌(L.plantarum)、加氏乳杆菌(L.gasseri)、戍糖乳杆菌(L.pentosus)、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、阴道乳杆菌(L.vaginalis)和粘膜乳杆菌(L.mucosae)。
9.前述权利要求任一项的乳酸菌菌株，选自约氏乳杆菌、路氏乳杆菌和植物乳杆菌。
10.前述权利要求任一项的乳酸菌菌株，选自: NCIMB41846:路氏乳杆菌 GGDK31 ； NCIMB41847:类植物乳杆菌(Lactobacillus paraplantarum)和路氏乳杆菌 GGDK161 ； NCIMB41848:路氏乳杆菌 GGDK255 ； NCIMB41849:植物 / 戍糖 / 瑞士(Lactobacillus helveticus) / 类植物乳杆菌GGDK258 ； NCIMB41850:约氏乳杆菌和路氏乳杆菌GGDK266 ； NCIMB42008约氏乳杆菌； NCIMB42009:路氏乳杆菌； NCIMB42010:植物乳杆菌； NCIMB42011路氏乳杆菌；和NCIMB42012:路氏乳杆菌。
11.一种组合物，其包含一种或多种权利要求ι-?ο任一项的乳酸菌菌株以及可药用赋形剂、载体或稀释剂。
12.—种益生菌组合物，其包含一种或多种权利要求1-10任一项的乳酸菌菌株。
13.—种或多种权利要求1-10任一项的乳酸菌菌株用于医药。
14.一种或多种权利要求1-10任一项的乳酸菌菌株用于治疗受试者中的肠病症。
15.—种或多种权利要求1-10任一项的乳酸菌菌株在制备用于治疗受试者中肠病症的药物中的用途。
16.权利要求14或权利要求15的一种或多种乳酸杆菌的用途，其中所述受试者是哺乳动物，优选人。
17.权利要求14或权利要求15的一种或多种乳酸杆菌的用途，其中所述肠病症是沙门氏菌病、肠易激综合征(IBS )、炎性肠道病症(IBD )、功能性消化不良、功能性便秘、功能性腹泻(包括抗生素相关性腹泻、旅行者腹泻和小儿腹泻)、功能性腹痛、功能性胃气胀、上腹痛综合征、餐后不适综合征、克罗恩病、溃疡性结肠炎、胃肠反流性疾病(GERD)、变态反应、特应性疾病例如特应性皮炎、坏死性小肠结肠炎、其他感染以及其组合。
18.一种治疗受试者中肠病症的方法，所述方法包括给予所述受试者药物有效量的一种或多种权利要求1-10任一 项的乳酸菌菌株或权利要求11或权利要求12的组合物。
19.一种或多种权利要求1-10任一项的乳酸菌菌株用于改善肠道微生物群。
20.一种改善受试者中肠道微生物群的方法，所述方法包括给予所述受试者包含一种或多种权利要求1-10任一项的乳酸菌菌株的组合物或者权利要求11或权利要求12的组合物。
21.—种或多种权利要求1-10任一项的乳酸菌菌株在制备用于改善肠道微生物群的药物中的用途。
22.—种饲料,其包含一种或多种权利要求1-10任一项的菌株。
23.—种食品,其包含一种或多种权利要求1-10任一项的菌株。
24.一种饮食补充物，其包含一种或多种权利要求1-10任一项的菌株。
25.—种食品添加剂,其包含一种或多种权利要求1-10任一项的菌株。
26.—种产生益生菌的方法,所述方法包括培养权利要求1-10任一项的菌株。
27.—种制备一种或多种权利要求1-10任一项的菌株的方法,所述方法包括以下步骤: (i)从有机饲养的猪获得粪便； (?)冷冻所述粪便并使其在合适的稀释剂中分散； (iii)任选在补充的猪初乳碳水化合物的存在下，将在步骤(ii)中获得的分散的粪便施加到合适的琼脂，并在厌氧条件下孵育； (v)选择步骤(iv)期间形成的不同菌落，任选在补充的猪初乳碳水化合物的存在下，接种到合适的肉汤培养基中； (vi)孵育步骤(V)中获得的接种的菌落。
28.一种获得猪乳酸菌菌株的方法，所述方法包括从有机饲养的猪获得粪便并从所述粪便提取一种或多种猪乳酸菌菌株。
29.权利要求28的方法，其包括以下步骤: (i)从有机饲养的猪获得粪便； (?)冷冻所述粪便并使其在合适的稀释剂中分散； (iii)任选在补充的猪初乳碳水化合物的存在下，将在步骤(ii)中获得的分散的粪便施加到合适的琼脂，并在厌氧条件下孵育； (v)选择步骤(iv)期间形成的不同细菌菌落，任选在补充的猪初乳碳水化合物的存在下，接种到合适的肉汤培养基中； (vi)孵育步骤(V)中获得的接种的菌落。
30.通过权利要求28或权利要求29的方法获得或可获得的一种或多种猪乳酸菌菌株。
31.一种乳酸菌菌株，其包含选自SEQ ID勵:1-87的163 rRNA基因序列或者所述序列的变体或同系物 。
【文档编号】C12R1/23GK104080903SQ201280044674
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2012年7月13日 优先权日:2011年7月14日
【发明者】D·凯利 申请人:Gt生物制剂有限公司