一种猪肠道隐窝的分离液及其分离方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及组织分离技术领域，更具体地，涉及一种猪肠道隐窝的分离液及其分离方法。
【背景技术】
[0002]肠道是哺乳动物营养物质吸收的主要部位和最大的免疫器官。肠道上皮平均3?5天更新一次，是成年哺乳动物自我更新速度最快的组织，小肠上皮由肠绒毛-隐窝轴(villus-crypt axis)构成，伸向肠腔的绒毛包含3类成熟的上皮细胞:吸收细胞(enterocyte)、杯状细胞(goblet。611)和内分泌细胞(61^61'0611(10(31'；[116 cell)，可划分为功能区和增殖区；功能区由不具备分化能力的成熟上皮细胞组成，这些具有不同功能的细胞共同构成了绒毛结构，其中，吸收细胞占肠道上皮细胞数量的90%以上，发挥吸收营养素的功能；杯状细胞分泌粘液，形成保护屏障；分泌细胞可分泌胃肠激素。增殖区位于隐窝，是肠道上皮不断更新的源泉，肠道上皮更新失调和更新受损会引起肠癌、溃疡、慢性炎症应答和败血症等。因此，肠道隐窝是维持肠道健康和肠道功能的结构基础。
[0003]现代社会，炎症性及肿瘤性等肠道疾病越来越突出，而伦理问题限制了以人或其肠道作为材料研宄肠道上皮更新。因此，亟需开发一个肠道解剖学、生理学以及疾病和损伤过程都与人相近的研宄模型。猪的采食习性、肠粘膜屏障生理、肠道微生物组成和主要肠道疾病与人相近，可作为一个良好的研宄模型。为了能够获得结构完整且高纯度的猪肠道隐窝，为肠道上皮更新研宄和组织特异性移植提供材料，现有技术已有关于猪肠道隐窝的分离和纯化的研宄，目前各种研宄证据表明，可通过EDTA螯合的方法，将猪肠道隐窝分离出来，但是，用这种方法获得的隐窝的结构完整性、纯度和活性却遭到了一定程度的破坏。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于克服现有技术所存在的上述缺陷，提供一种用于分离猪肠道隐窝的分离液。
[0005]本发明的第二个目的是提供一种猪肠道隐窝的分离方法。
[0006]本发明的第三个目的是提供一种猪肠道隐窝的纯化方法。
[0007]本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的:
一种用于分离猪肠道隐窝的分离液，包括以下浓度各组分:5.0?10.0mM HEPES ；5.0 ?30.0 mM Na2EDTA_2H20 ；0.50 ?1.0 mM DTT ；0.25 ?0.50 mM BSA ;2.5 ?3.0 mM葡萄糖；0.5?2.5 mM谷氨酰胺；0.50?1.0 mM DL- β -羟丁酸钠；2?10 mM Y-27632 ；
1.5 ?2.7 mM KCl ; 1.0 ?1.5 mM KH2PO4; 130 ?138 mM NaCl ;5 ?8 mM Na 2HP04_7H20。
[0008]现有技术中有EDTA螯合剂用于分离小鼠的肠道隐窝，其所用的螯合剂为EDTA和多种盐溶液的组合，发明人通过前期研宄发现，将用于分离小鼠的肠隐窝的螯合剂用于分离猪的肠道隐窝时，会对猪肠道隐窝的结构、活性造成一定程度的破坏，因此，发明人在现有技术的基础上对猪肠道隐窝的分离液做出了改进，得到本发明所述专用于分离猪肠道隐窝的分离液。
[0009]本发明所述分离液的组成中，谷氨酰胺是肠道上皮细胞主要的能量供体和重要的功能调节剂；在分离猪肠道隐窝时可起到保护隐窝细胞活性的作用；羟丁酸钠是一种神经传递的抑制剂，起到麻醉和减缓肠道应激的作用。
[0010]优选地，本发明所述分离液包括以下浓度各组分:10.0mM HEPES ；30.0 mMNa2EDTA-2H20 ；0.50 mM DTT ；0.25 mM BSA ；2.5 mM 葡萄糖；2.5 mM 谷氨酰胺；0.50mM DL-β-羟丁酸钠；10 mM Y-27632 ；2.7 mM KCl ；1.5 mM KH2PO4; 138 mM NaCl ；8 mMNa2HP04-7H20o
[0011]在得到上述分离液的基础上，本发明还提供上述分离液在猪肠道隐窝分离中的应用。
[0012]本发明对现有技术中猪肠道隐窝的分离方法也做出了改进，即在低温条件下通过上述分离液和HBSS的配合获得结构完整且活性和纯度都较高的猪肠道隐窝。
[0013]本发明所述猪肠道隐窝的分离方法，包括以下步骤:
51.将清洗过的仔猪小肠剪成小段，低温条件下，在上述分离液中通过孵育-振动去除肠绒毛；
52.去除分离液，将小肠置于HBSS中振动一段时间，重复步骤S2，即可分离获得肠道隐窝。
[0014]优选地，上述分离方法中，步骤SI中孵育-振动重复I?2遍，步骤S2重复2?4遍。
[0015]优选地，SI所述孵育在低速离心的条件下进行，更优选地，所述孵育是在10r/min的条件下进行，孵育的时间为10?20min。
[0016]优选地，SI和S2所述振动的时间为2?lOmin。
[0017]本发明所述小肠可以选择空肠、十二指肠和回肠；优选地，可以是空肠。
[0018]不同日龄仔猪肠道绒毛和隐窝大小不同，筛选合适日龄的仔猪可以达到最优分离肠道隐窝的目的；因此，优选地，所述仔猪为5日龄仔猪。
[0019]优选地，所述低温为O?8°C ;更优选地，所述低温是在4°C条件下进行。
[0020]作为一种优选的技术方案，本发明上述猪肠道隐窝的分离方法包括以下步骤:
51.取仔猪空肠，用冰冷的HBSS将内容物冲洗干净，将空肠剪成小段；
52.空肠小段转移至离心管中，并加入4倍于肠段体积的冰冷的分离液，4°C且10r/min条件下孵育1min后，以约I次/s的频率颠倒震摇2min，此时分离得到的主要为绒毛；
53.去除液体，保留空肠小段，加入冰冷的分离液，4°C且10rpm条件下孵育20min后，以约I次/s的频率手动颠倒震摇2min ；
54.去除液体，保留空肠小段，加入冰冷的HBSS，以约I次/s的频率手动颠倒震摇1min ；
55.重复S42?4次，即可分离到隐窝。
[0021]本发明还提供上述猪肠道隐窝的纯化方法，是将上述任一种方法获得的猪肠道隐窝通过差速沉淀的方法进行纯化，纯化后的猪肠道隐窝的纯度达95%。
[0022]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:
本发明提供了一种用于分离猪肠道隐窝的分离液，利用该分离液，选择合适日龄的仔猪的小肠，在低温条件下对仔猪小肠进行孵育，通过人工摇晃，将绒毛除去，再次低温孵育，通过多次在HBSS中人工摇晃，获得结构完整，活性和纯度都较高的隐窝，将获得的隐窝再通过差速沉淀的方法进行纯化，即可进一步获得高纯度的隐窝，纯化后的猪肠道隐窝的纯度达95%。所获得的隐窝为肠道上皮更新研宄和组织特异性移植提供材料，具有广泛的应用价值。
【附图说明】
[0023]图1为I日龄长白隐窝绒毛轴结构示意图。
[0024]图2为不同日龄长白仔猪隐窝大小观察(4X );其中，图a、图b、图c和图d分别为I日龄、5日龄、7日龄和21日龄仔猪隐窝。
[0025]图3为不同方法分离到的隐窝的形态(4X );其中，图a、图b、图c分别为刮粘膜法、外翻肠囊法和小肠片段法。
[0026]图4为纯化后的隐窝(4X );随机选择6个视野计算隐窝的比例为0.95±0.04(n=6)0
[0027]图5为对比例I所述方法分离得到的隐窝观察(4X )。
【具体实施方式】
[0028]下面结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换，均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0029]实施例1隐窝-绒毛轴结构观察
麻醉I日龄长白仔猪，放血处死后剖开仔猪腹部，取出空肠，用冰冷的HBSS将肠腔中的内容物冲洗干净，将空肠纵向剖开，再用冰冷的HBSS将粘附在肠道上皮上的杂质彻底洗涤干净；在解剖显微镜下，用镊子将空肠的肌肉层和上皮分开，取少量的猪肠道上皮置于