载玻片上，制成压片，在显微镜下观察，结果如图1。
[0030]实施例2筛选合适日龄的仔猪
本实例涉及仔猪处死方法与实施例1相同；分别选择1、3、5、7和21日龄仔猪，取其空肠用下述方法分离肠道隐窝:
(1)取15cm空肠并外翻成肠囊，用HBSS将肠囊洗涤干净；
(2)结扎肠囊一端，往肠囊中灌注最大量的分离液1，再结扎另一端；
(3)将灌注好分离液I的肠囊置于10mL锥形瓶中，加入50mL分离液I(30.0mMNa2EDTA-2H20)，在37°C空气摇床中孵育，摇床转速为150r/min，孵育10?20min后，分离出来的主要为绒毛；
(4)更换新的分离液1，在37°C空气摇床中孵育，摇床转速为150r/min，孵育15?20min后，分离出来的主要为绒毛且混杂有少量隐窝；
(5)更换新的分离液1，在37°C空气摇床中孵育，摇床转速为150r/min，孵育20?30min后，分离出来的主要为隐窝。
[0031]实验结果如图2，从图2中可以看出，图中黑色箭头所指的为隐窝，随着仔猪日龄增长，隐窝长度不断增加，但是，日龄大的仔猪的隐窝分离时间也较日龄小的仔猪长，综合最终结果，选取5日龄仔猪进行隐窝分离最为合适。
[0032]实施例3猪肠道隐窝的分离方法本实例涉及仔猪处死方法与实施例1相同。
[0033]选择5日龄的长白仔猪，取出空肠，用HBSS将内容物清洗干净后，分别用三种不同的方法分离隐窝。为达到为肠道组织提供足够的营养及抑制隐窝失巢性凋亡从而获得高活性隐窝的目的，本实例中所用的分离液命名为分离液2，其配方组成为:10.0mM HEPES ；30.0mM Na2EDTA_2H20 ;0.50mM DTT ;0.25mM BSA ;2.5mM D-glucose ；2.5mM L-glutamine ；0.50mM DL-β-羟丁酸钠；1mM Y-27632 ;2.7 mM KCl ；1.5 mM KH2PO4; 138 mM NaCl ；8 mMNa2HP04-7H20o
[0034]方法一:刮粘膜法
取1cm左右的空肠，纵向剖开，用HBSS清洗干净粘附在肠上皮上的杂质，用盖玻片将肠上皮逐层刮下，然后用HBSS重悬至合适的浓度。显微镜观察结果显示，首先刮下的是绒毛，最后刮下的是隐窝。
[0035]方法二:外翻肠囊法
除分离液不同外，操作步骤与实施例2相同。
[0036]方法三:肠道小片段法
(1)取15cm空肠，用冰冷的HBSS将内容物冲洗干净，用剪刀剪为I?2cm2的小片段；
(2)将肠道小片段转移至50mL离心管中，并加入4倍于肠段体积的冰冷的分离液2，4°C且100r/min条件下孵育1min后，以约I次/s的频率颠倒震摇2min，此时分离得到的主要为绒毛；
(3)去除液体保留肠道小片段后加入约20mL冰冷的分离液2，4°C且lOOr/min条件下孵育20min后，以约I次/s的频率手动颠倒震摇2min ；
(4)去除液体保留肠道小片段后加入约20mL冰冷的HBSS，以约I次/s的频率手动颠倒震摇1min ；
(5)重复步骤(4) 2?4次，可分离到隐窝。
[0037]上述三种分离方法获得的猪肠道隐窝在显微镜下观察如图3，从图3可以看出:方法一容易把隐窝的结构形态破坏；方法二需要在37°C下长时间分离，容易使隐窝活性下降；方法三可在低温条件下且较短时间内分离到结构完整的隐窝。
[0038]实施例4分离及纯化
选择5日龄的长白仔猪，取出空肠，用HBSS将内容物清洗干净后，按照实施例3中的方法三:肠道小片段法分离得到隐窝，此时隐窝中混杂有部分绒毛，可进一步借助差速沉淀的方法纯化隐窝，步骤如下:
(1)用5mL移液器将含有隐窝和绒毛混合物的悬浮液转移至新的50mL离心管中，4°C静置1.5 min，体积较大的细胞团块沉淀到管底；
(2)将上清转移至新的50mL离心管中，4°C静置5 min，此时沉淀的细胞团多为隐窝，吸出上清，获得隐窝。
[0039](3)重复步骤(I)?(2)，可获得纯度高达90%以上的隐窝，结果如图4。
[0040]对比例I 实验方法同实施例3，唯一不同的是所用的分离液的配方组成为:30.0mMNa2EDTA-2H20 ；0.50 mM DTT ；2.5 mM D-glucose ；2.7 mM KCl ；1.5 mM KH2PO4; 138 mM NaCl ；8 mM Na2HP04-7H20，结果如图5，从图5中可以看出，用该分离液分离得到的隐窝有些没用被分离开来，有些隐窝的结构形态遭到破坏。
【主权项】
1.一种用于分离猪肠道隐窝的分离液，其特征在于，包括以下浓度各组分:5.0?10.0mM HEPES ；5.0 ?30.0 mM Na2EDTA_2H20 ；0.50 ?1.0 mM DTT ；0.25 ?0.50 mM BSA ；2.5?3.0 mM葡萄糖；0.5?2.5 mM谷氛醜胺；0.50?1.0 mM DL- β -轻丁酸纳；2?10 mM Y-27632 ;1.5 ?2.7 mM KCl ;1.0 ?1.5 mM KH2PO4; 130 ?138 mM NaCl ;5 ?8 mMNa2HP04-7H20o
2.根据权利要求1所述的分离液，其特征在于，包括以下浓度各组分:10.0mM HEPES ;30.0 mM Na2EDTA-2H20 ；0.50 mM DTT ；0.25 mM BSA ；2.5 mM 葡萄糖；2.5 mM 谷氨酰胺；0.50 mM DL-β -羟丁酸钠；10 mM Y-27632 ；2.7 mM KCl ；1.5 mM KH2PO4; 138 mM NaCl ；8 mMNa2HP04-7H20o
3.权利要求1或2所述分离液在猪肠道隐窝分离中的应用。
4.一种猪肠道隐窝的分离方法，其特征在于，包括以下步骤: 51.将清洗过的仔猪小肠剪成小段，低温条件下，在权利要求1或2所述分离液中通过孵育-振动去除肠绒毛； 52.去除分离液，将小肠置于HBSS中振动一段时间，重复步骤S2，即可分离获得肠道隐窝。
5.根据权利要求3所述的分离方法，其特征在于，SI中孵育-振动重复I?2遍，步骤S2重复2?4遍。
6.根据权利要求3所述的分离方法，其特征在于，SI所述孵育在低速离心的条件下进行，孵育的时间为10?20min。
7.根据权利要求3所述的分离方法，其特征在于，SI和S2所述振动的时间为2?1min0
8.根据权利要求3所述的分离方法，其特征在于，所述仔猪为5日龄仔猪。
9.根据权利要求3所述的分离方法，其特征在于，所述低温为O?8°C。
10.一种猪肠道隐窝的纯化方法，其特征在于，将权利要求4?9任一项所述方法获得的猪肠道隐窝通过差速沉淀的方法进行纯化。
【专利摘要】本发明属于组织分离技术领域，具体公开了一种用于分离猪肠道隐窝的分离液及其分离方法，该分离液包括以下浓度各组分：5.0～10.0mM HEPES；5.0～30.0 mM Na2EDTA-2H2O；0.50～1.0 mM DTT；0.25～0.50 mM BSA；2.5～3.0 mM 葡萄糖；0.5～2.5 mM谷氨酰胺；0.50～1.0 mM DL-β-羟丁酸钠；2～10 mM Y-27632；1.5～2.7 mM KCl；1.0～1.5 mM KH2PO4；130～138 mM NaCl；5～8 mM Na2HPO4-7H2O；在低温条件下仔猪小肠通过上述分离液和HBSS的配合获得结构完整、活性和纯度都较高的猪肠道隐窝。
【IPC分类】C12N5-071
【公开号】CN104745525
【申请号】CN201510080396
【发明人】王修启, 黎相广, 高春起, 严会超, 傅厚龙, 陈明霞, 翟振亚, 范宏博
【申请人】华南农业大学
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2015年2月15日