微生物生物质和微生物油的直接化学修饰的制作方法
【专利说明】微生物生物质和微生物油的直接化学修饰
[0001] 本申请是申请日为2009年4月9日、发明名称为"微生物生物质和微生物油的直 接化学修饰"的中国专利申请200980121520. 5(国际申请号PCT/US2009/040123)的分案申 请。
[0002] 相关申请的交叉参考
[0003] 本申请是非临时申请，且要求于2008年4月9日提交的61/043,620和于2008年 6月20日提交的61/074610的权益，所述专利申请为了所有目的以其全文并入作为参考。
[0004] 对序列表的引用
[0005] 本申请包括所附的1-12页所示的序列表。 发明领域
[0006] 本发明涉及基因工程、水产业领域，以及涉及含脂质微生物生物质（microbial biomass)的化学修饰。
[0007] 发明背景
[0008] 全球经济对能量需求的增加已经对化石燃料的成本施加越来越多的压力。这与日 益增加的减少空气污染意义一道，已经刺激了家庭能源供应的开发并且触发了用于内燃引 擎的非石油燃料的开发。对于压缩点火（柴油）引擎来说，已经显示脂肪酸的简单醇酯（生 物柴油）可以接受为替代性柴油燃料。生物柴油比源自化石燃料的柴油具有更高的氧含 量，因此减少颗粒物质、烃类和一氧化碳的排放，同时由于低硫含量还减少硫排放（Sheehan J等人，用于城市公共汽车的生物柴油和石油柴油的寿命周期清单（Life Cycle Inventory of Biodiesel and Petroleum Diesel for Use in an Urban Bus), National Renewable Energy Laboratory,Report NREL/SR-580-24089,Golden,Colo. (1998),Graboski,M.S.和 R. L. McCormick, Prog Energy Combust. Sci,24:125-164(1998))〇
[0009] 在生物柴油的生产、试验和使用方面的初期努力是采用精制的可食用植物油 (通过油籽的溶剂提取被排出或回收）和动物脂肪（例如牛脂）作为原料进行燃料合 成的（例如，参见 Krawczyk，T.，INFORM, 7:800-815 (1996);和 Peterson, C. L.等人， Applied Engineering in Agriculture，13:71-79 (1997)。该方法的进一步改进已经 使得能够从更便宜的、未经高度精制的脂质原料例如废弃的餐馆油脂和大豆皂脚中生产 脂肪酸甲酯（FAME)(例如，参见 Mittelbach，M.和 P.Tritthart，J Am Oil Chem.Soc·， 65(7) :1185-1187(1988), Graboski，M. S.等人，生物柴油组合物对DDC系列60柴油机的 弓I擎排放的影口向（The Effect of Biodiesel Composition on Engine Emissions from a DDC Series 60Diesel Engine), Final Report to USDOE/National Renewable Energy Laboratory，合约号 ACG-8-17106-02 (2000)。
[0010] 几十年来，已经提出藻类的光能自养生长是自藻类制造生物柴油的一种有吸 引力的方法，参见〈回顾美国能源部的水生生物种计划：来自藻类的生物柴油〉A Look Back at the U S Department of Energy's Aquatic Species Program ：Biodiesel from Algae, NREL/TP 580-24190, John Sheehan, Tern Dunahay, John Benemann 和 Paul Roessler (1998)。很多研究人员认为，由于阳光是"免费的"资源，所以藻类的光能自养生 长是培养微藻（microalgae)作为生物燃料生产原料的最理想方法（例如，参见Chisti， Biotechnol Adv. 2007年5-6月，25(3) :294-306 :"异养生产不如使用光合性微藻更有 效，……因为异养微生物生长所需的可再生有机碳源最终由通常在农作物中发生的光合 作用产生"）。其它研究不仅认为光能自养生长是生长微藻用于生物燃料的最好方法，而 且认为没必要在引入到柴油引擎中之前对来自微藻生物质的任何物质都进行转酯（参见 Screagg 等人，Enzyme and Microbial Technology，Vol. 33:7, 2003,第 884-889 页）。 toon] 在最近几十年间光合生长方法一直是大量研究的焦点，部分地受到美国能源部燃 料开发办公室的鼓励，其在1978?1996年期间资助了从藻类中开发可再生运输燃料的计 划。该主要生产设计的中心是一系列户外阳光驱动的浅池塘，被设计成"跑道（raceway)"， 其中藻类、水和营养物环绕着临近废C02源（例如以化石物燃料为动力的发电厂）的圆形 池塘循环。
[0012] 常规通过在催化剂（例如强酸或强碱）的存在下将三酰基甘油（"TAG"）与低级 烷基醇（例如甲醇）反应以产生脂肪酸烷基酯（例如，脂肪酸甲酯或"FAME"）和甘油来进 行提取的/精制的植物油的转酯。
[0013] 如上文所述，传统的生物柴油生产依赖于提取的和/或精制的油（通过溶剂提取 油籽而被排出或回收的油）作为原料用于转酯过程。油来源，包括大豆、棕榈、椰子和芸苔 (canola)，是通常使用的，提取通过干燥植物材料和预处理该材料（例如，通过薄片化）以 促进溶剂（如己烷）渗透植物结构而进行。对用作起始材料的这些油的提取是传统生物柴 油生产成本的显著影响因素。
[0014] 类似于用于从干植物材料中提取油的溶剂提取工艺，在有机溶剂的存在下从微生 物生物质进行油的溶剂提取。在此处，溶剂提取需要使用与水基本上不混溶的溶剂（例如 己烷）以产生溶剂相（油在其中是可溶的），以及需要水相（保留生物质的大量非脂质部 分）。不幸的是，在工业规模生产中，为了有效提取而必须使用的挥发性（可能是致癌的）易 燃有机溶剂的体积造成了危险的操作条件（同时在环境安全和工人安全性两方面）。而且， 溶剂提取工艺产生大量的溶剂废流，它们需要正确的处置，因而增加了总体的生产成本。
[0015] 作为备选方案，已报导了"无溶剂"提取工艺，这些工艺采用包含不超过约5%有 机溶剂的水性溶剂从微生物提取脂质作为原料用在转酯工艺中生产生物柴油。简而言之， "无溶剂"提取工艺包括将裂解的细胞混合物与含有不超过约5%有机溶剂（例如己烷）的 水性溶剂接触以产生相分离的混合物。该混合物包含较重的水层和含有乳化的脂质的较轻 层。对较轻的脂质层重复进行提取工艺，直至获得非乳化的脂质层。不幸的是，脂质层的重 复分离和洗涤使得"无溶剂"工艺特别费工。
[0016] 仍然需要更廉价、更有效的方法用于从微生物产生的脂质提取有价值的生物分 子。本发明满足了这种需求。
[0017] 发明概述
[0018] 在第一方面，本发明涉及如下发现：对含脂质的微生物生物质进行直接化学修饰 可以急剧增加自那些脂质获得有价值物质的效率和降低成本。因此，在第一实施方案中，本 发明提供了化学修饰含脂质微生物生物质的方法，其包括下述步骤：培养微生物群体，收获 含有按干细胞重量计（DCW)至少5%脂质的微生物生物质，和使生物质进行化学反应，该化 学反应导致共价修饰至少I %的脂质。在一些实施方案中，该方法还包括从所述生物质的其 它组分中分离共价修饰的脂质。
[0019] 在各种实施方案中，共价修饰的脂质与和其分离的生物质的比率按干重计为10% 脂质对90 %生物质至90 %生物质对10 %脂质。某些实施方案中，从生物质的其它组分中分 离脂质的步骤包括相分离步骤，其中共价修饰的脂质形成较轻的非水相，而生物质的组分 形成一个或多个较重相。在一些实施方案中，不经使脂质与非脂质物质的比率增加按重量 计50%以上的预先富集步骤，使生物质进行化学反应。在其它实施方案中，使生物质进行化 学反应，并进行使脂质与微生物干重的比率增加的预先富集步骤。在一些实施方案中，在化 学反应前，收获的生物质不进行除了去除水和/或裂解细胞之外的任何处理。在一些实施 方案中，进行化学反应的生物质以与细胞培养物相同的相对比例包含除水之外的组分。在 一些实施方案中，生物质的脂质含量少于进行化学反应的生物质的90%。
[0020] 在一个实施方案中，化学修饰含脂质微生物生物质包括：对生物质进行转酯以产 生含有脂肪酸烷基酯的亲脂相和含有细胞物质与甘油的亲水相。在一些实施方案中，该方 法还包括在使生物质进行转酯化学反应之前从所述生物质中去除水。在其它实施方案中， 该方法还包括在从生物质中去除水之前破碎生物质。在一些实施方案中，使用选自下组的 方法从生物质中去除水：对生物质进行冷冻干燥、转鼓干燥和烘箱干燥。
[0021] 在其中化学修饰含脂质微生物生物质包括对生物质进行转酯的一些实施方案中， 该方法还包括在对生物质实行转酯之前破碎生物质。在一些实施方案中，在破碎生物质之 前从生物质中去除水。在一些实施方案中，破碎生物质包括加热生物质以产生裂解物。在 其它实施方案中，破碎生物质包括将生物质与足以产生裂解物的酸或碱接触。在另外其它 的实施方案中，破碎生物质包括将生物质与一种或多种酶接触以产生裂解物。在一些实施 方案中，将生物质与至少一种蛋白酶和至少一种多糖降解酶接触。在一些实施方案中，破碎 生物质包括机械裂解微生物群体以产生裂解物。在其它实施方案中，破碎生物质包括对生 物质进行渗压震扰（osmotic shock)以产生裂解物。在另外其它的实施方案中，破碎生物 质包括用裂解性病毒感染微生物群体以产生裂解物。在其它实施方案中，破碎生物质包括 诱导裂解基因在微生物群体内表达以促进自裂解和裂解物的产生。
[0022] 在其中化学反应包括转酯的化学修饰方法的一些实施方案中，脂肪酸烷基酯为脂 肪酸甲酯或脂肪酸乙酯。在一些实施方案中，将生物质转酯包括将生物质与醇和碱接触。在 一些实施方案中，醇选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇及其混合物。在一些实施方案中，碱选自 Na0H、K0H及其混合物。在一个实施方案中，醇为甲醇，且碱为NaOH。在一些实施方案中，将 生物质转酯包括将生物质与醇和脂肪酶接触。在一些实施方案中，脂肪酶在微生物群体中 由外源性脂肪酶基因表达。在一些实施方案中，通过将生物质与刺激物接触以激活控制外 源性脂肪酶基因表达的诱导型启动子，从而诱导外源性脂肪酶基因表达。
[0023] 在各种实施方案中，亲脂相中I丐和镁的组合量按重量计不大于5ppm(parts per million,百万分比）。在一些实施方案中，亲脂相中磷的量按质量计不大于0.001 %。在一 些实施方案中，亲脂相中硫的量不大于15ppm。在一些实施方案中，亲脂相中钾和钠的组合 量按重量计不大于5ppm。在一些实施方案中，亲脂相的总类胡萝卜素含量不大于100微克 类胡萝卜素每克。在一些实施方案中，亲脂相中的总叶绿素含量不大于〇. lmg/kg。
[0024] 在一些实施方案中，使生物质进行化学反应包括将生物质与酶接触以催化该化学 反应。在一些实施方案中，所述酶为脂肪酶。在一个实施方案中，该方法还包括将含有共价 修饰的脂质