专利名称：改变反馈敏感度的重组酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有改变的反馈敏感度的重组高丝氨琥珀酰基转移酶(MetA*)、以及最终具有降低活性的重组S-腺苷甲硫氨酸合成酶(MetK*)在生产甲硫氨酸、其前体或其衍生产物中的用途。
背景技术：
含硫化合物如半胱氨酸、高半胱氨酸、甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸对细胞代谢有关键作用，并且被工业制造用作食品或饲料添加剂以及药物。尤其是甲硫氨酸，是不能由动物合成的一种必需氨基酸，在很多身体功能中起到重要作用。除了在蛋白质生物合成中的作用以外，甲硫氨酸还参与转甲基化以及硒和锌的生物利用。甲硫氨酸还直接用作对变态反应和风湿热的治疗。然而大部分生产出来的甲硫氨酸被添加到了动物饲料中。
由于BSE和禽流感，对动物源蛋白质的使用减少，而对纯甲硫氨酸的需求增加。D，L-甲硫氨酸通常经化学方法由丙烯醛、甲基硫醇和氰化氢生产。然而，外消旋混合物表现不如纯L-甲硫氨酸，例如在禽饲料添加剂中(Saunderson，C.L.，(1985)BritishJournal of Nutrition 54，621-633)。纯甲硫氨酸可以由外消旋甲硫氨酸生产，如通过酰基转移酶处理外消旋N-乙酰-D，L-甲硫氨酸，但这显著增加了生产成本。对纯L-甲硫氨酸不断增长的需求以及环境考虑使微生物生产甲硫氨酸变得很有吸引力。
微生物已经形成了高度复杂的调节机制来精细调节细胞组分的生物合成，从而保证最大生长速率。所以，只有需要量的代谢物如氨基酸被合成，并且在野生株的培养上清中通常不能被检测到。细菌主要通过酶的反馈抑制以及基因转录来的阻遏或活化来控制氨基酸的生物合成。这些调节通路的效应子在大多数情况下是相关通路的终产物。从而在微生物中过量生产氨基酸的策略需要解除对这些控制机制的调节。
L-甲硫氨酸的合成通路在很多微生物中是公知的(
图1A/B)。甲硫氨酸衍生自氨基酸天冬氨酸，但是其合成还需要合并另两条通路，半胱氨酸生物合成和C1代谢(N-甲基四氢叶酸)。天冬氨酸通过连续三个反应转变成高丝氨酸。高丝氨酸随后可以进入苏氨酸/异亮氨酸或甲硫氨酸生物合成通路。在大肠杆菌(E.coli)中，进入甲硫氨酸通路需要将高丝氨酸酰化成琥珀酰高丝氨酸。该活化步骤允许随后与半胱氨酸缩合，产生含硫醚的胱硫醚，水解胱硫醚获得高半胱氨酸。最后导致甲硫氨酸生成的甲基转移步骤通过B12-依赖性或B12-非依赖性的甲基转移酶实现。
通过MetJ和MetR蛋白分别阻遏和活化甲硫氨酸生物合成基因来调节甲硫氨酸在大肠杆菌中的生物合成(见综述Neidhardt，F.C.(Ed.in Chief)，R.Curtiss III，J.L.Ingraham，E.C.C.Lin，K.B.Low，B.Magasanik，W.S.Reznikoff，M.Riley，M.Schaechter，and H.E.Umbarger(eds).1996.Escherichia coli and SalmonellaCellularand Molecular Biology.American Society for Microbiology；Weissbach et al.，1991 Mol.Microbiol.，5，1593-1597)。MetJ利用S-腺苷甲硫氨酸作为辅阻遏物，S-腺苷甲硫氨酸通过必需基因metK所编码的S-腺苷甲硫氨酸合成酶(EC 2.5.1.6)作用由甲硫氨酸制得。metA编码高丝氨酸琥珀酰基转移酶(EC 2.3.1.46)，甲硫氨酸合成所特有的第一个酶，它是甲硫氨酸生产中的另一个主要控制点。除了MetJ和MetR对metA的转录调节外，该酶还受终产物甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸的反馈调节(Lee，L.-W et al.(1966)Multimetabolite control of a biosynthetic pathway by sequential metabolites，JBC 241(22)，5479-5780)。这两种产物的反馈抑制具有协同作用，这意味着低浓度的单独每种代谢物仅有轻微的抑制，而其组合则表现出强的抑制作用。
氨基酸类似物通过合成异常多肽以及反馈抑制干扰来抑制细菌生长，导致细胞内的有害过程。已经获得了抗类似物的突变株，它显示改变的、解除调节的酶，这导致过量合成相应代谢物来与类似物竞争。多个小组已经使用甲硫氨酸类似物正亮氨酸、乙硫氨酸和α-甲基甲硫氨酸来获得过量生产甲硫氨酸的微生物株。这表明α-甲基甲硫氨酸是高丝氨酸琥珀酰基转移酶MetA的强效抑制剂(Rowbury RJ，(1968)The inhibitory effectofα-methylmethionine on Escherichia coli，J.gen.Microbiol.，52，223-230)。从鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)中分离出了定位到metA基因座的抗反馈突变体(Lawrence D.A.，(1972)Regulation of the methioninc feedback-sensitivc enzymc inmutants of Salmonella typhimurium；Lawrence，D.A.，Smith，D.A.，Rowbury，R.J.(1967)Regulation of methionine synthesis in Salmonella typhimuriumMutants resistant toinhibition by analogues of methionine，Genetics 58，473-492)。抗正亮氨酸的突变体显示定位到metK基因座(Chattopadhyay，M.K.，Ghosh，A.K.and Sengupta，S.(1991)，Control of methionine biosynthesis in Escherichia coli K12a closer study with analogueresistant mutants，Journal of General Microbiology，137，685-691)。相同作者已经报道分离了大肠杆菌的抗反馈metA突变体和抗正亮氨酸突变体，但还未见metA和metK中实际突变的描述。
已经证明了高丝氨酸琥珀酰基转移酶对细菌发酵生产甲硫氨酸的关键作用(Kumar，D.Garg，S.Bisaria V.S.，Sreekrishnan，T.R.and Gomes，J.(2003)Production ofmethionine by a multi-analogue resistant mutant of Corynebacterium lilium，ProcessBiochemistry 38，1165-1171)。专利申请JP2000139471描述了用基因metA和metK突变体生产L-甲硫氨酸的工艺。该案例中已经确定了突变的精确定位。MetA突变型酶部分丢失了对甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸的反馈抑制敏感度。然而和野生型酶相比，其起始活性下降到约25％，并且当甲硫氨酸浓度为1mM时对于有些突变体或者当SAM浓度为1mM时对于另一些突变体而言，丢失了25-90％的酶活。metK突变体没有对其进行酶学表征，但在发酵中用来提高甲硫氨酸的产量。
发明内容
本发明涉及在微生物发酵过程中制备甲硫氨酸、其前体或其衍生产物的方法，该过程中L-高丝氨酸经一种高丝氨酸琥珀酰基转移酶转变成O-琥珀酰-高丝氨酸，包括以下步骤在适宜介质上培养所述微生物，并回收所产生的甲硫氨酸、其前体或其衍生产物，其中高丝氨酸琥珀酰基转移酶是突变型高丝氨酸琥珀酰基转移酶，它对反馈抑制剂S-腺苷甲硫氨酸和甲硫氨酸的敏感度降低。
本发明还涉及应用微生物的相同方法，其中S-腺苷甲硫氨酸合成酶活性降低。
本发明还涉及突变型酶、编码具有降低敏感度或活性的所述酶的核苷酸序列以及包含如上及如下公开的所述核苷酸序列的微生物。
重组酶可以一起使用，也可以与相应微生物中多种其它改变联合使用，如基因的过表达或缺失。优选过表达编码天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶(metL或thrA)的基因，并删除编码甲硫氨酸阻遏物的基因metJ。
在本发明的说明书中，使用大肠杆菌中相应基因的命名来识别基因和蛋白质。但是，除非特别说明，根据本发明使用这些命名具有更一般性含义，并且涵盖其它生物、更具体地微生物中所有相应的基因和蛋白质。
PFAM(比对和隐Markov模型蛋白质家族数据库；http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)代表蛋白质序列比对的一个大集合。每PFAM能够显示多重比对、查看蛋白质结构域、评估在生物之间的分布、得以进入其它数据库以及显示已知蛋白质结构。
COGs(蛋白质直向同源组群；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)是通过比较来自43个全测序基因组的蛋白质序列而获得的，所述全测序基因组代表30个主要系统发生系。每个COG通过至少3个系定义，其允许识别先前的保守结构域。
识别同源序列及其同源性百分比的方法对于本领域技术人员而言是公知的，尤其包括BLAST程序，该程序可从网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/获得，使用网址给定的默认参数即可。获得的序列可以随后进一步研究(如比对)，如使用程序CLUSTALW(http://www.cbi.ac.uk/clustalw/)或MULTALIN(http://prodcs.toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl)，其中使用那些网址给定的默认参数即可。
本领域技术人员利用GenBank关于已知基因的参考，可以确定其它生物、细菌菌株、酵母、真菌、哺乳动物、植物等中对等的基因。用共有序列有利地完成该常规操作，共有序列可以如下确定与源自其它生物的基因进行序列比对，设计简并探针从另一生物中克隆相应的基因。对于本领域技术人员而言这些分子生物学常规方法是公知的，并且已有描述，例如，在Sambrook et al.(1989 Molecular Cloninga Laboratory Manual.2nded.Cold Spring Harbor Lab.，Cold Spring Harbor，New York.)。
具体实施例方式
根据本发明，与野生型酶相比，修饰的高丝氨酸琥珀酰基转移酶对甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸的反馈敏感度显示出降低，与野生型序列相比包含至少一个氨基酸突变。突变优选选自编码第24至30位氨基酸的保守区域或编码第58至65位氨基酸的区域或编码第292至298位氨基酸的区域，其中将甲酰甲硫氨酸之后的第一个氨基酸脯氨酸计为1号。
所有涉及氨基酸位置的参考都基于图2所示大肠杆菌的metA基因编码的高丝氨酸琥珀酰基转移酶。本领域技术人员利用以下列出的酶，通过如图3所示简单的序列比对可以发现来自不同生物的其它高丝氨酸琥珀酰基转移酶相应保守区域的相对位置-gi|20138683|sp|Q97I29|META Clostridium acetobutylicum高丝氨酸O-琥珀酰基转移酶-gi|12230304|sp|Q9PLV2|META Campylobacter jejuni高丝氨酸O-琥珀酰基转移酶-gi|12230277|sp|Q9KAK7|META Bacillus halodurans高丝氨酸O-琥珀酰基转移酶-gi|20138686|sp|Q97PM9|META Streptococcus pneumoniae高丝氨酸O-琥珀酰基转移酶-gi|20138715|sp|Q9CEC5|META Lactococcus lactis高丝氨酸O-琥珀酰基转移酶-gi|20138656|sp|Q92L99|META Sinorhizobium meliloti高丝氨酸O-琥珀酰基转移酶-gi|20138618|sp|Q8YBV5|META Brucella melitensis高丝氨酸O-琥珀酰基转移酶-gi|20141549|sp|P37413|META Salmonella typhimurium高丝氨酸O-琥珀酰基转移酶-gi|20138601|sp|Q8X610|META Escherichia coli O157H7高丝氨酸O-琥珀酰基转移酶-gi|12231004|sp|P07623|META Escherichia coli高丝氨酸O-琥珀酰基转移酶-gi|12230285|sp|Q9KRM5|META Vibrio cholerae高丝氨酸O-琥珀酰基转移酶-gi|38258142|sp|Q8FWG9|META Brucella melitensis biovar suis高丝氨酸O-琥珀酰基转移酶-gi|20138631|sp|Q8ZAR4|META Yersinia pestis高丝氨酸O-琥珀酰基转移酶-gi|12231010|sp|P54167|META Bacillus subtilis高丝氨酸O-琥珀酰基转移酶-gi|12230320|sp|Q9WZY3|META Thermotoga maritima高丝氨酸O-琥珀酰基转移酶-gi|20138625|sp|Q8ZIW1|META Salmonella typhi高丝氨酸O-琥珀酰基转移酶->gi|31340217|sp|Q8D937|META Vibrio vulnificus高丝氨酸O-琥珀酰基转移酶-gi|31340213|sp|Q87NW7|META Vibrio parahaemolyticus高丝氨酸O-琥珀酰基转移酶修饰的高丝氨酸琥珀酰基转移酶优选表现出在10mM甲硫氨酸和1mM S-腺苷甲硫氨酸存在时野生型酶活性至少10倍的比活性，和在10mM甲硫氨酸和0.1mM S-腺苷甲硫氨酸存在时野生型酶活性至少80倍的比活性。优选的酶在100mM甲硫氨酸和1mM S-腺苷甲硫氨酸存在时保留的活性至少是起始活性的2％。
根据本发明，修饰的高丝氨酸琥珀酰基转移酶的蛋白质序列优选在如下指定的至少1个保守区域序列内含有氨基酸突变。
优选地，至少1个突变存在于包含如下定义的氨基酸序列的保守区域1中，野生型高丝氨酸琥珀酰基转移酶的N-端部分中，其对应如SEQ ID NO 1所示的大肠杆菌MetA氨基酸序列中氨基酸24至30。该非突变保守区域1具有以下序列X1-X2-X3-A-X4-X5-Q其中X1代表E，D，T，S，L，优选T；X2代表D，S，K，Q，E，A，R，优选S；X3代表R，E，D，优选R；X4代表Y，I，F，A，K，S，V，优选S；X5代表H，S，N，G，T，R，优选G。
在一个优选实施方案中，未修饰的高丝氨酸琥珀酰基转移酶保守区域1具有如下氨基酸序列T-S-R-A-S-G-Q。
在本发明的另一个优选实施方案中，至少一个突变存在于保守区域2、也在野生型高丝氨酸琥珀酰基转移酶的N-端部分，其对应如SEQ ID NO 1所示的大肠杆菌MetA氨基酸序列中氨基酸58至65。非突变保守区域2具有下式X1-X2-X3-P-L-Q-X4-X5其中X1代表G，A，S，优选S；X2代表N，A，优选N；X3代表S，T，优选S；X4代表V，L，I，优选V；X5代表N，E，H，D，优选D。
在一个优选实施方案中，未修饰的高丝氨酸琥珀酰基转移酶保守区域2具有如下氨基酸序列S-N-S-P-L-Q-V-D。
本发明的再一个实施方案中，高丝氨酸琥珀酰基转移酶在其C-端部分的保守区域中至少包含1个突变，该区域对应如SEQ ID NO 1所示的大肠杆菌MetA氨基酸序列中氨基酸292至298。非突变保守区域3具有下式X1-Y-Q-X2-T-P-X3其中X1代表V，I，M，优选V；X2代表E，K，G，I，Q，T，S，优选I；X3代表F，Y，优选Y。
在一个优选实施方案中，未修饰的高丝氨酸琥珀酰基转移酶保守区域3具有如下氨基酸序列V-Y-Q-I-T-P-Y。
在一个优选实施方案中，将保守区域1中保守的丙氨酸替换为另一个氨基酸，更优选地替换为缬氨酸。修饰的保守区域最优选具有如下氨基酸序列T-S-R-V-S-G-Q。
在另一个优选实施方案中，将保守区域2中保守的氨基酸L和/或Q替换为其它氨基酸。优选地，亮氨酸替换为苯丙氨酸和/或谷氨酰胺替换为谷氨酸或天冬氨酸。最优选地，修饰的保守区域2具有如下氨基酸序列S-N-S-P-L-E-V-D。
另一个优选实施方案中，将保守区域3中保守氨基酸L和/或Q替换为其它氨基酸。
在一个优选应用中metA基因是指SEQ ID NO 1及其同源序列代表的大肠杆菌K12的高丝氨酸琥珀酰基转移酶，所述同源序列具有高丝氨酸琥珀酰基转移酶活性并与SEQ ID NO 1的氨基酸序列具有至少80％同源性，优选90％同源性。
例如，可通过选择在甲硫氨酸类似物如α-甲基甲硫氨酸、正亮氨酸或乙硫氨酸存在下生长的菌株获得修饰的高丝氨酸琥珀酰基转移酶。优选当在α-甲基甲硫氨酸存在下生长时选择这些菌株。
本发明还涉及编码如上限定的根据发明的突变型高丝氨酸琥珀酰基转移酶的核苷酸序列、DNA或RNA序列。在一个优选实施方案中，DNA序列的特征在于这种事实在由SEQ ID NO 1代表的野生型metA基因的保守区域1至3的编码区内包含至少1个突变，且所述突变不是沉默突变。
例如，可以通过在甲硫氨酸类似物存在下生长的菌株准备这些DNA序列。通过制备重组DNA的标准公知技术，将含有修饰的metA基因的起始DNA片段克隆到载体中。
例如，还可以通过非特异性或定向突变方法从携带编码野生型高丝氨酸琥珀酰基转移酶的DNA序列的菌株准备这些DNA序列。
例如，可以在特定条件下通过化学试剂(如亚硝基胍、甲磺酸乙酯等)和/或物理方法或PCR反应在所述DNA区域内产生非特异性突变。
向DNA片段内特定位置引入突变的方法是公知的，并且在Molecular CloningaLaboratory Manual，1989，2nded.Cold Spring Harbor Lab.，Cold Spring Harbor，NewYork中有描述。
利用前述方法可以向任何metA基因中所述DNA区域引入一个或多个突变，所述突变可导致修饰的高丝氨酸琥珀酰基转移酶具有引起甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸不敏感性的氨基酸序列。优选改变编码高丝氨酸琥珀酰基转移酶的DNA序列中的1个或多个核苷酸，使得该基因编码的氨基酸序列表现出至少1个突变。
另一个产生抗反馈metA等位基因的方法由导致反馈抗性的不同点突变的组合组成，从而产生具有新性状的多重突变。
与野生型酶相比，根据发明的修饰型S-腺苷甲硫氨酸合成酶活性降低，与野生型序列相比其蛋白质序列中具有至少一个突变。
突变优选在如下定义的保守区域之一中。
所有涉及氨基酸位置的参考都基于大肠杆菌metK基因编码的S-腺苷甲硫氨酸合成酶。本领域技术人员利用如下列出的酶，通过如图4所示简单的序列比对可以发现来自不同生物的其它S-腺苷甲硫氨酸合成酶相应保守区域的相对位置>gi|39574954|emb|CAE78795.1|甲硫氨酸腺苷转移酶Bdellovibrio bacteriovorus HD100]>gi|45657232|ref|YP_001318.1|S-腺苷甲硫氨酸合成酶蛋白Leptospira interrogansserovar Copenhageni str.Fiocruz L1-130>gi|28378057|ref|NP_784949.1|甲硫氨酸腺苷转移酶Lactobacillus plantarum WCFS1>gi|26453553|dbj|BAC43885.1|S-腺苷甲硫氨酸合成酶Mycoplasma penetrans>gi|24212014|sp|Q9K5E4|S-腺苷甲硫氨酸合成酶Corynebacterium glutamicum>gi|18145842|dbj|BAB81883.1|S-腺苷甲硫氨酸合成酶Clostridium perfringens str.13
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优选地，修饰型S-腺苷甲硫氨酸合成酶蛋白质序列含有至少一个以下指定序列的氨基酸突变。
在本发明的一个实施方案中，氨基酸序列变化涉及第89位半胱氨酸或第239位半胱氨酸，它们都降低MetK的活性(Reczkowski and Markham，1995，JBC 270，31，18484-18490)。
在一个优选实施方案中，在保守区域1中至少存在1个突变，对应SED ID NO 2所示大肠杆菌MetK的氨基酸序列中氨基酸54至59，非突变保守区域1包含以下限定的氨基酸序列G-E-X1-X2-X3-X4
其中X1代表I，V，L，T，优选I；X2代表T，K，S，R，优选T；X3代表T，S，G，优选T；X4代表S，N，T，K，E，R，P，N，A，优选S。
未修饰的S-腺苷甲硫氨酸合成酶保守区域1优选具有如下氨基酸序列G-E-I-T-T-S。
在本发明的另一个优选实施方案中，在保守区域2存在至少1个突变，对应SEQ IDNO2所示大肠杆菌MetK的氨基酸序列中氨基酸98至107，非突变保守区域2具有以下限定的氨基酸序列Q-S-X1-D-I-X2-X3-G-V-X4其中X1代表P，Q，A，S，优选P；X2代表A，N，Q，S，F，优选N；X3代表V，Q，Y，R，M，N，优选Q；X4代表K，D，N，T，S，A，E，优选D。
未修饰的S-腺苷甲硫氨酸合成酶的保守区域2优选具有如下氨基酸序列Q-S-P-D-I-N-Q-G-V-D。
在另一个优选实施方案中，在保守区域3中存在至少1个突变，对应SEQ ID NO 2所示大肠杆菌MetK的氨基酸序列中氨基酸114至121，非突变保守区域3包含如下限定的氨基酸序列X1-G-A-G-D-Q-G-X2其中X1代表Q，A，I，V，E，T，优选Q；X2代表L，I，S，V，M，优选L。
未修饰的S-腺苷甲硫氨酸合成酶保守区域3优选具有如下氨基酸序列Q-G-A-G-D-Q-G-L。
在另一个优选实施方案中，在保守区域4中存在至少1个突变，对应SEQ ID NO 2所示大肠杆菌MetK的氨基酸序列中氨基酸137至144，非突变保守区域4包含如下限定的氨基酸序列X1-I-X2-X3-X4-H-X5-X6其中X1代表S，P，T，A，优选P；X2代表A，T，W，Y，F，S，N，优选T；X3代表M，Y，L，V，优选Y；X4代表S，A，优选A；X5代表K，R，E，D，优选R；X6代表L，I，优选L。
未修饰的S-腺苷甲硫氨酸合成酶保守区域4优选具有如下氨基酸序列P-I-T-Y-A-H-R-L。
在另一个优选实施方案中，在保守区域5中存在至少1个突变，对应SEQ ID NO 2所示大肠杆菌MetK的氨基酸序列中氨基酸159至163，非突变保守区域5包含如下限定的氨基酸序列X1-L-X2-X3-D其中X1代表W，F，Y，V，E，优选W；X2代表R，G，L，K，优选RX3代表P，L，H，V，优选P。
未修饰的S-腺苷甲硫氨酸合成酶保守区域5优选具有如下氨基酸序列W-L-R-P-D。
优选在保守区域6中存在至少1个突变，对应SEQ ID NO 2所示大肠杆菌MetK的氨基酸序列中氨基酸183至189，非突变保守区域6包含如下限定的氨基酸序列X1-X2-X3-S-X4-Q-H其中
X1代表V，I，优选V；X2代表V，L，I，优选V；X3代表V，L，I，M，优选L；X4代表T，V，A，S，H，优选T。
在一个优选实施方案中，未修饰的S-腺苷甲硫氨酸合成酶保守区域6具有如下氨基酸序列V-V-L-S-T-Q-H。
优选在保守区域7中引入突变，对应SEQ ID NO 2所示大肠杆菌MetK的氨基酸序列中氨基酸224至230，非突变保守区域7包含如下限定的氨基酸序列X1-N-P-X2-G-X3-F其中X1代表I，V，优选I；X2代表T，G，S，优选T；X3代表R，T，Q，K，S，优选R。
在一个优选实施方案中，未修饰的S-腺苷甲硫氨酸合成酶保守区域7具有如下氨基酸序列I-N-P-T-G-R-F。
优选在保守区域8中引入突变，对应SEQ ID NO 2所示大肠杆菌MetK的氨基酸序列中氨基酸231至237，非突变保守区域8包含如下限定的氨基酸序列X1-X2-G-X3-P-X4-X5其中X1代表T，V，I，Y，E，优选V；X2代表V，I，L，N，优选I；X3代表G，S，优选G；X4代表M，I，Q，A，H，D，优选M；X5代表G，S，A，H，优选G。
在一个优选实施方案中，未修饰的S-腺苷甲硫氨酸合成酶保守区域8具有如下氨基酸序列V-I-G-G-P-M-G。
优选在保守区域9中引入突变，对应SEQ ID NO 2所示大肠杆菌MetK的氨基酸序列中氨基酸246至253，非突变保守区域9包含如下限定的氨基酸序列X1-X2-D-T-Y-G-G其中X1代表M，I，优选I；X2代表V，I，优选I。
在一个优选实施方案中，未修饰的S-腺苷甲硫氨酸合成酶保守区域9具有如下氨基酸序列I-V-D-T-Y-G-G。
优选在保守区域10中引入突变，对应SEQ ID NO 2所示大肠杆菌MetK的氨基酸序列中氨基酸269至275，非突变保守区域10包含如下限定的氨基酸序列K-V-D-R-S-X1-X2其中X1代表A，G，优选A；X2代表A，S，L，优选A。
在一个优选实施方案中，未修饰的S-腺苷甲硫氨酸合成酶保守区域10具有如下氨基酸序列K-V-D-R-S-A-A。
在本发明的另一个优选应用中，在保守区域11中至少存在1个突变。未修饰的S-腺苷甲硫氨酸合成酶在其C-末端部分有保守区域，该保守区域具有如下氨基酸序列X1-X2-Q-X3-X4-Y-A-I-G-X5-X6其中X1代表L，E，I，Q，T，优选E；X2代表V，I，L，优选I；X3代表V，L，I，优选V；X4代表A，S，优选S；X5代表V，I，R，K，A，优选V；X6代表A，V，T，S，优选A。
该区域对应SEQ ID NO 2所示大肠杆菌MetK的氨基酸序列中氨基酸295至305。
在一个优选实施方案中，未修饰的S-腺苷甲硫氨酸合成酶保守区域11具有如下氨基酸序列E-I-Q-V-S-Y-A-I-G-V-A。
在本发明的另一个优选应用中，突变被引入该蛋白质的N-末端，导致移框和最后6个氨基酸的改变。
在具有降低活性的S-腺苷甲硫氨酸合成酶中优选将保守区域1中的丝氨酸替换为另一个氨基酸。在本发明的一个优选应用中，将丝氨酸替换为天冬酰胺。
在一个优选实施方案中，修饰的S-腺苷甲硫氨酸合成酶保守区域1具有如下氨基酸序列G-E-I-T-T-N。
在具有降低活性的S-腺苷甲硫氨酸合成酶中优选将保守区域2中的保守性甘氨酸替换为另一个氨基酸。在本发明的一个优选应用中，将保守甘氨酸替换为丝氨酸。
在一个优选实施方案中，修饰的S-腺苷甲硫氨酸合成酶在保守区域2具有如下氨基酸序列Q-S-P-D-I-N-Q-S-V-D。
在具有降低活性的S-腺苷甲硫氨酸合成酶中优选将保守区域3中的保守甘氨酸替换为另一个氨基酸。在本发明的一个优选应用中，将保守甘氨酸替换为丝氨酸。
在一个优选实施方案中，修饰的S-腺苷甲硫氨酸合成酶在保守区域3具有如下氨基酸序列Q-S-A-G-D-Q-G-L。
在具有降低活性的S-腺苷甲硫氨酸合成酶中优选将保守区域4中的保守性组氨酸和/或半保守性脯氨酸替换为其它氨基酸。在本发明的一个优选应用中，将保守组氨酸替换为酪氨酸和/或将半保守脯氨酸替换为亮氨酸。
在一个优选实施方案中，修饰的S-腺苷甲硫氨酸合成酶在保守区域4具有如下氨基酸序列之一P-I-T-Y-A-Y-R-L，L-I-T-Y-A-H-R-L，L-I-T-Y-A-Y-R-L。
在具有降低活性的S-腺苷甲硫氨酸合成酶中优选将保守区域5中的半保守性精氨酸替换为另一个氨基酸。在本发明的一个优选应用中，将精氨酸替换为半胱氨酸。
在一个优选实施方案中，修饰的S-腺苷甲硫氨酸合成酶在保守区域5具有如下氨基酸序列W-L-C-P-D。
在具有降低活性的S-腺苷甲硫氨酸合成酶中优选将保守区域6中的保守性组氨酸或半保守性缬氨酸替换为另一个氨基酸。在本发明的一个优选应用中，将保守性组氨酸替换为酪氨酸和/或缬氨酸替换为天冬氨酸。
在一个优选实施方案中，修饰的S-腺苷甲硫氨酸合成酶在保守区域6具有如下三个氨基酸序列之一V-V-L-S-T-Q-Y，V-D-L-S-T-Q-H，V-D-L-S-T-Q-Y。
在具有降低活性的S-腺苷甲硫氨酸合成酶中优选将保守区域7中的半保守性苏氨酸替换为另一个氨基酸。在本发明的一个优选应用中，将苏氨酸替换为异亮氨酸。
在一个优选实施方案中，修饰的S-腺苷甲硫氨酸合成酶在保守区域7具有如下氨基酸序列I-N-P-I-G-R-F。
在具有降低活性的S-腺苷甲硫氨酸合成酶中优选将保守区域8中的保守性脯氨酸替换为另一个氨基酸。在本发明的一个优选应用中，将脯氨酸替换为丝氨酸。
在一个优选实施方案中，修饰的S-腺苷甲硫氨酸合成酶在保守区域8具有如下氨基酸序列V-I-G-G-S-M-G。
在具有降低活性的S-腺苷甲硫氨酸合成酶中优选将保守区域9中的第二个保守性甘氨酸替换为另一个氨基酸。在本发明的一个优选应用中，将甘氨酸替换为天冬氨酸。
在一个优选实施方案中，修饰的S-腺苷甲硫氨酸合成酶在保守区域9具有如下氨基酸序列I-V-D-T-Y-G-D。
在具有降低活性的S-腺苷甲硫氨酸合成酶中优选将保守区域10中的保守性丝氨酸替换为另一个氨基酸。在本发明的一个优选应用中，将丝氨酸替换为苯丙氨酸。
在一个优选实施方案中，修饰的S-腺苷甲硫氨酸合成酶在保守区域10具有如下氨基酸序列K-V-D-R-F-A-A。
在具有降低活性的S-腺苷甲硫氨酸合成酶中优选将保守区域11中的保守性异亮氨酸替换为另一个氨基酸。在本发明的一个优选应用中，将异亮氨酸替换为亮氨酸。
在一个优选实施方案中，修饰的S-腺苷甲硫氨酸合成酶在保守区域11具有如下氨基酸序列E-I-Q-V-S-Y-A-L-G-V-A。
本发明还涉及编码如上限定的根据发明的突变型S-腺苷甲硫氨酸合成酶的核酸序列，DNA或RNA序列。在一个优选的实施方案中，这些DNA序列的特征在于这种事实它们在由SEQ ID NO 2中野生型代表的野生型metK基因的保守区域1至11的编码DNA序列区中包含至少1个突变，且所述突变不是沉默突变。
在一个优选应用中metK基因是大肠杆菌K12的S-腺苷甲硫氨酸合成酶，其代表为SEQ ID NO 2以及与该序列同源的序列，其具有S-腺苷甲硫氨酸合成酶活性并同SEQID NO 2的氨基酸序列具有至少80％同源性，优选具有90％同源性。
可以通过如上以及如下公开的本领域技术人员已知的常规技术获得上述突变型S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因，这些常规技术包括随机或定向突变或合成DNA构建。
编码修饰的高丝氨酸琥珀酰基转移酶的metA基因和/或编码修饰的S-腺苷甲硫氨酸合成酶的metK基因可以是染色体编码的或者是染色体外编码的。如果是染色体上的，则可在基因组上有一个或几个拷贝，所述拷贝可以通过本领域技术人员公知的重组方法引入。如果是染色体外编码的，则两个基因都可以由不同类型的质粒所携带，质粒的复制起始不同并且因而它们在细胞中的拷贝数也不同。质粒可以存在1-5个拷贝、约20或多至500个拷贝，分别对应紧密复制的低拷贝数质粒(pSC101、RK2)、低拷贝数质粒(pACYC、pRSF1010)或高拷贝数质粒(pSK bluescript II)。
可用不同强度的启动子表达metA和/或metK基因，这需要或不需要用诱导分子诱导。实例如启动子Ptrc、Ptac、Plac、lambda启动子cI或本领域公知的其它启动子。
稳定或去稳定相应信使RNA(Carrier and Keasling(1998)Biotechnol.Prog.15，58-64)或蛋白质(如GST标签、Amersham Biosciences)的元件可以促进或降低MetA和/或MetK的表达。
本发明还涉及含有根据发明的抗反馈metA等位基因以及最终根据发明具有降低活性的metK等位基因的微生物。
这种菌株的特征在于这种事实通过至少一个抗反馈metA等位基因和/或通过由降低活性的MetK酶引起的SAM生成减少而解除它们对甲硫氨酸代谢的调节。
可从任何微生物来制备新菌株，其中甲硫氨酸代谢经历相同的代谢通路。
革兰氏阴性菌，尤其大肠杆菌，特别适合。
为了表达修饰的高丝氨酸琥珀酰基转移酶和S-腺苷甲硫氨酸合成酶，用常规方法将活性降低的抗反馈metA和metK等位基因转化入宿主菌株。筛选具有修饰的高丝氨酸琥珀酰基转移酶和S-腺苷甲硫氨酸合成酶特性的菌株，例如用酶检验来实现这种筛选。
例如，可以在以高丝氨酸和琥珀酰-CoA作为底物的酶检验中确定高丝氨酸琥珀酰基转移酶活性。通过加入含高丝氨酸琥珀酰基转移酶的蛋白质提取物来启动反应，蛋白质沉淀蛋白质并用硅烷化试剂衍生之后，用GC-MS监测O-琥珀酰高丝氨酸的形成。在反应混合物中存在甲硫氨酸以及S-腺苷甲硫氨酸的条件下检测反馈抑制。
可以在以甲硫氨酸和ATP作底物的酶检验中测定S-腺苷甲硫氨酸合成酶的活性。通过加入含S-腺苷甲硫氨酸合成酶的蛋白质提取物来启动反应，用FIA-MS/MS监测S-腺苷甲硫氨酸的形成。
优选使用大肠杆菌株，其中内源性metA和metK基因被灭活并用新的重组基因补充。
活性降低的抗反馈metA等位基因和metK等位基因使之有可能解除在重要的生物合成控制点的控制，因此扩大处于天冬氨酸下游的大量化合物的生产。这些包括，尤其是高丝氨酸、O-琥珀酰高丝氨酸、胱硫醚、高半胱氨酸、甲硫氨酸以及S-腺苷甲硫氨酸。
本发明尤其涉及通过培养新型微生物的方式制备L-甲硫氨酸、其前体或衍生化合物。上述产物如下分类为化合物(I)。
通过改变表达水平或者删除参与天冬氨酸即化合物(I)前体生产的以下基因可以增加化合物(I)的生产。
基因genbank登记号 名称ackAg1788633 乙酸激酶pta g1788635 磷酸转乙酰酶acs g1790505 乙酸合酶aceAg1790445 异柠檬酸裂解酶aceBg1790444 苹果酸合酶aceEg1786304 丙酮酸脱氢酶E1aceFg1786305 丙酮酸脱氢酶E2lpd g1786307 丙酮酸脱氢酶E3aceKg1790446 异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶sucCg1786948 琥珀酰-CoA合成酶，β亚基sucDg1786949 琥珀酰-CoA合成酶，α亚基ppc g1790393 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶pck g1789807 磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶pykAg1788160 丙酮酸激酶IIpykFg1787965 丙酮酸激酶IpoxBg1787096 丙酮酸氧化酶pps g1787994 磷酸烯醇式丙酮酸合酶ilvBg1790104 乙酰羟酸合酶I，大亚基ilvNg1790103 乙酰羟酸合酶I，小亚基ilvGg1790202 乙酰羟酸合酶II，大亚基g1790203ilvMg1790204 乙酰羟酸合酶II，小亚基ilvIg1786265 乙酰羟酸合酶III，大亚基ilvHg1786266 乙酰羟酸合酶III，小亚基aroFg1788953 DAHP合成酶aroGg1786969 DAHP合成酶aroHg1787996 DAHP合成酶aspCg1787159 天冬氨酸转氨酶此外，可以通过遗传工程将源自Rhizobium etli.(登记号U51439)的丙酮酸羧化酶引入大肠杆菌并且进行过表达。
通过过表达赖氨酸/甲硫氨酸/通路中的基因可以实现进一步提高化合物(I)的生产，例如由基因thrA(高丝氨酸脱氢酶/天冬氨酸激酶，g1786183)或metL(高丝氨酸脱氢酶/天冬氨酸激酶，g1790376)或lysC(天冬氨酸激酶，g1790455)或asd(天冬氨酸半醛脱氢酶，g1789841)或者它们的组合编码的合成高丝氨酸的酶。
过表达参与硫酸同化和半胱氨酸生成的基因有可能进一步提高(I)的产量。为此，可以通过过表达如下基因(见下)、或者通过经引入Colyer和Kredich(1994 MolMicrobiol 13 797-805)所述的组成型cysB等位基因和经引入编码对其抑制剂L-半胱氨酸敏感度降低的丝氨酸乙酰基转移酶的cysE等位基因(美国专利申请US 6,218,168，Denk & Bock 1987 J Gen Microbiol 133 515-25)来解除对通路的调节而实现。以下基因需要被过表达。
CysAgl788761硫酸通透酶CysUg1788764半胱氨酸转运系统CysWg1788762膜结合硫酸转运系统CysZg1788753cysK上游的ORFcysNg1789108ATP硫酸化酶cysDg1789109硫酸腺苷酰基转移酶cysCg1789107腺苷酰基硫酸激酶cysHg1789121腺苷酰基硫酸还原酶cysIg1789122亚硫酸还原酶，α亚基cysJg1789123亚硫酸还原酶，β亚基cysEg1790035丝氨酸乙酰基转移酶cysKg1788754半胱氨酸合酶cysMg2367138O-乙酰基-硫醇化酶此外，通过过表达下列基因可增强参与C1(甲基)基团的生产serAg1789279磷酸甘油酸脱氢酶serBg1790849磷酸丝氨酸磷酸酶serCg1787136磷酸丝氨酸转氨酶glyAg1788902丝氨酸羟甲基转移酶metFg17903775，10-亚甲基四氢叶酸还原酶此外，直接参与甲硫氨酸生产的基因可以被过表达metBg1790375胱硫醚γ-合酶metCg1789383胱硫醚β-裂解酶metHg1790450B12-依赖性高半胱氨酸-N5-甲基四氢叶酸转甲基酶metEg2367304四氢蝶酰三谷氨酸转甲基酶metFg17903775，10-亚甲基四氢叶酸还原酶metRg1790262metE和metH以及自调节的正调节基因此外，可降低通路中基因的表达或删除这些基因，所述通路是指降解甲硫氨酸的通路或衍生自甲硫氨酸生产通路。
speDg1786311S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶speCg1789337鸟氨酸脱羧酶thrBg1786184高丝氨酸激酶astAg1788043精氨酸琥珀酰基转移酶dapAg1788823二氢吡啶二羧酸合酶通过删除阻遏蛋白MetJ基因的方式有可能进一步提高(I)的生产，如JP2000157267-A/3所建议，MetJ负责下调甲硫氨酸调节元(也见GenBank g1790373)。
通过使用一种改变的metB等位基因可进一步提高(I)的产量，如专利申请PCT N°PCT/FR04/00354所述，该等位基因优选或独占性地利用H2S并因而由O琥珀酰高丝氨酸生成高丝氨酸，所述专利申请的内容并入此处作为参考。
在另一个优选实施方案中，在本发明的微生物中以及在用于根据本发明方法的微生物中，过表达编码天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶的基因和/或删除编码甲硫氨酸阻遏物metJ的基因。
优选地，由解除反馈调节的ThrA等位基因编码天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶。可通过向ThrA酶引入突变Phe318Ser来获得这种解除反馈调节。此处通过参考genebank登记号V00361.1(g1786183)中公开的ThrA序列给出酶位置。
上述metA和metK等位基因可用于原核或真核生物。所用的生物优选是原核生物。在一个优选应用中生物既可以是大肠杆菌也可以是C.glutamicum。
本发明还涉及化合物(I)的生产方法。通常通过预先设计的细菌株发酵来制备化合物(I)。
根据本发明，术语“培养”和“发酵”用于无区分地表示微生物在含有简单碳源的适宜培养基上生长。
根据本发明，简单碳源是一种能由本领域技术人员用来获得微生物尤其是细菌正常生长的碳源。具体而言，它可以是可被同化的糖如葡萄糖、半乳糖、蔗糖、乳糖或糖蜜、或这些糖的副产物。尤为优选的简单碳源是葡萄糖。另一种优选的简单碳源是蔗糖。
本领域技术人员能够定义根据发明微生物的培养条件。具体而言，在温度20℃至55℃之间发酵细菌，优选在25℃至40℃之间，更具体地，对C.glutamicum来说约30℃，对大肠杆菌来说约37℃。
通常使用适于所用细菌的已知限定组分的无机培养基在发酵罐中进行发酵，其中包含至少一种简单碳源，并且如有必要还包含代谢物生产所必需的共底物。
具体而言，大肠杆菌的无机培养基可以与以下培养基相同或相似M9培养基(Anderson，1946，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 32120-128)、M63培养基(Miller，1992；AShort Course in Bacterial GeneticsA Laboratory Manual and Handbook forEscherichia coli and Related Bacteria，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，New York)或例如由Schaefer et al.(1999，Anal.Biochem.27088-96)所定义的培养基。
类似地，C.glutamicum的无机培养基可以与以下培养基相同或是相似组合物BMCG培养基(Liebl et al.，1989，Appl.Microbiol.Biotechnol.32205-210)或例如Riedelet al.(2001，J.Mol.Microbiol.Biotechnol.3573-583)所述的培养基。培养基可以补偿突变所导致的营养缺陷。
发酵之后回收化合物(I)，如果需要并进行纯化。回收和纯化培养基中的化合物(I)如甲硫氨酸的方法是本领域技术人员公知的。
-图1A/B大肠杆菌中的甲硫氨酸代谢。
-图2野生型和经α-甲基甲硫氨酸筛选获得的重组metA基因的比对。保守性残基用浅灰色框表示，突变残基用白色框表示。
-图3来自不同微生物的MetA序列的比对。
-图4来自不同微生物的MetK序列的比对。
-图5大肠杆菌MetK蛋白质的氨基酸替换。连线上的氨基酸指示位置和替换氨基酸。
实施例实施例1含有对甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸显示反馈敏感度降低的高丝氨酸琥珀酰基转移酶的大肠杆菌突变体的分离分离生长在α-甲基甲硫氨酸上的大肠杆菌株
α-甲基甲硫氨酸是甲硫氨酸的生长抑制性类似物，在非常低浓度(最低抑菌浓度为1μg/ml，最大抑制作用的最低浓度为5μg/ml，Rowbery et al.，1968)下就对大肠杆菌的生长速率产生立即效应。类似物可以在高丝氨酸琥珀酰基转移酶的反馈抑制中模拟甲硫氨酸并干扰蛋白质的合成而不被代谢掉。只有突变株才能在含有该类似物的培养基上生长。
常规地，大肠杆菌在37℃下在LB中通气培养，需要时LB中补充适合的抗生素。用作抗α-甲基甲硫氨酸类似物的培养基是含有如下组分的基本培养基(每升)K2HPO48g，Na2HPO42g，(NH4)2SO40.75g，(NH4)2HPO48g，NH4Cl 0.13g，柠檬酸6.55g，MgSO42.05g，CaCl240mg，FeSO440mg，MnSO420mg，CoCl28mg，ZnSO44mg，(NH4)2Mo2O72.8mg，CuCl22mg，H3BO31mg。pH调到6.7，并进行培养基灭菌。用之前，加入10g/l葡萄糖和10mg/l硫胺素。
购自Sigma的α-甲基甲硫氨酸粉末含有痕量甲硫氨酸。对不添加甲硫氨酸则不能生长的大肠杆菌株(MG1655 ΔmetE)进行过夜液体培养，以便从基本培养基中消耗掉甲硫氨酸(来自α-甲基甲硫氨酸)。将培养物在7000rpm下离心10分钟并过滤上清(Sartorius 0.2μm)。将15g/l琼脂加入该基本培养基中。
无菌水洗涤4步后，将野生型菌株(MG1655)基本培养基中1*108细胞/ml的过夜培养物涂布到基本培养基和α-甲基甲硫氨酸的平板上。在37℃下培养平板直至出现菌落。
编码高丝氨酸琥珀酰基转移酶的metA基因在编码序列中突变的证据LB培养基培养后，从生长在4mg/mlα-甲基甲硫氨酸上的4个克隆制备基因组DNA。用无菌水洗涤一次细胞沉淀，重悬于30μl无菌水中。95℃下加热5分钟破碎细胞，沉淀细胞碎片。用Taq酶和如下引物对metA基因进行PCR扩增MetAF(SEQ ID NO 3)tcaccttcaacatgcaggctcgacattggc(4211759-4211788)MetAR(SEQ ID NO 3)ataaaaaaggcacccgaaggtgcctgaggt(4212857-4212828)在3个克隆中检测到了导致氨基酸替换的点突变。在克隆metA11中CAG替换为GAG，引起E替换Q。在克隆metA*13中TTG替换为TTT，引起F替换L。在克隆metA*14中GCG替换为GTG，引起V替换A(见图2)。
从图3所示的比对可见，各种物种中的MetA蛋白质中所有三个被替换的氨基酸都是高度保守的。
突变型高丝氨酸琥珀酰基转移酶显示对甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸的反馈敏感度降低体外确定高丝氨酸琥珀酰基转移酶的活性。在含2.5g/l葡萄糖的丰富培养基中培养携带有野生型或突变型酶的大肠杆菌株，在晚对数期收获。细胞重悬于冷的磷酸钾缓冲液中，冰上超声破碎(Branson sonifier，70W)。离心之后对上清中含有的蛋白质进行定量(Bradford，1976)。
十微升提取物与30mM高丝氨酸和4mM琥珀酰-CoA一起在25℃孵育30分钟。按指示加入甲硫氨酸和/或S-腺苷甲硫氨酸。经叔丁基二甲基硅烷基三氟乙酰胺(TBDMSTFA)衍生化之后，用GC-MS对由高丝氨酸琥珀酰基转移酶产生的琥珀酰高丝氨酸进行定量。加入L-丝氨酸[1-13C]作为内标。
高丝氨酸琥珀酰基转移酶活性的结果报告于下表1
表1.加入抑制剂L-甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸时野生型和突变型高丝氨酸琥珀酰基转移酶的比活性因此，突变型高丝氨酸琥珀酰基转移酶对甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸表现出降低的反馈敏感度。
实施例2分离含有活性降低的S-腺苷甲硫氨酸合成酶的大肠杆菌株分离在正亮氨酸上生长的大肠杆菌株正亮氨酸是甲硫氨酸的一种生长抑制剂类似物，在较高浓度(50mg/l)的条件下只有突变株才能生长在含该类似物的培养基上。这些突变中多数作图定位到metK和metJ基因座。
常规地，大肠杆菌在37℃下在LB中通气培养，需要时LB中补充适合的抗生素。用作抗正亮氨酸类似物的培养基是含有如下组分的基本培养基(每升)K2HPO48g，Na2HPO42g，(NH4)2SO40.75g，(NH4)2HPO48g，NH4Cl 0.13g，柠檬酸6.55g，MgSO42.05g，CaCl240mg，FeSO440mg，MnSO420mg，CoCl28mg，ZnSO44mg，(NH4)2Mo2O72.8mg，CuCl22mg，H3BO31mg。pH调到6.7，并进行培养基灭菌。用之前，加入10g/l葡萄糖和10mg/l硫胺素。
无菌水洗涤4步后，将野生型菌株(MG1655)基本培养基中1*108细胞/ml的过夜培养物涂布到基本培养基和正亮氨酸(50至200g/l)的平板上。在37℃下孵育平板直至出现菌落。
编码S-腺苷甲硫氨酸合成酶的metK基因在编码序列中突变的证据从LB液体培养的培养物制备基因组DNA。用无菌水洗涤一次细胞沉淀物，重悬于30μl无菌水中。95℃下加热5分钟破碎细胞，提取细胞碎片。
用Taq酶和如下引物进行PCR扩增MetKpFcccggctggaagtggcaacacg(3084372-3084393)(SEQ ID NO 05)MetARgccggatgcggcgtgaacgcctatcc(3085956-3085931)(SEQ ID NO 06)。
测序metK基因。在10个克隆中检测到了导致氨基酸替换的点突变。在克隆metK*59/105中AGC替换为AAC，引起N替换S(59位)以及GGC替换为AGC，引起S替换G(105位)。在克隆metK*105中GGC替换为AGC，引起S替换G。在克隆metK*115中GGC替换为AGC，引起S替换G。在克隆metK*137中CCT替换为CTT，引起L替换P。在克隆metK*142中CAC替换为TAC，引起Y替换H。在克隆metK*161/235中CGC替换为TGC，引起C替换R以及CCA替换为TCA，引起S替换P。在克隆metK*189中CAC替换为TAC，引起Y替换H。在克隆metK*227中ACC替换为ATC，引起I替换T。在克隆metK*253中GGC替换为GAC，引起D替换G。在克隆metK*273中TCC替换为TTC，引起F替换S(见图5)。
从图4所示的比对可见，各种物种中的MetK蛋白质所有被替换的氨基酸都是保守的。
活性降低的重组S-腺苷甲硫氨酸合成酶体外确定S-腺苷甲硫氨酸合成酶的活性。在含5g/l葡萄糖的基本培养基中培养携带有野生型或突变型酶的大肠杆菌株，在晚对数期收获。细胞重悬于冷的磷酸钾缓冲液中，冰上超声破碎(Branson sonifier，70W)。离心之后对上清中含有的蛋白质进行定量(Bradford，1976)。
一百微升提取物与10mM甲硫氨酸和10mM ATP一起在37℃下孵育30分钟。加入氯化钾将酶活化。用FIA-MS/MS对由甲硫氨酸腺苷转移酶生成的腺苷甲硫氨酸进行定量。
S-腺苷甲硫氨酸合成酶活性的结果报告于下表2
表2WT和MetK*突变体的S-腺苷甲硫氨酸合成酶活性(MAT)
实施例3通过过表达改变的高丝氨酸琥珀酰基转移酶和甲硫氨酸生物合成通路中其它酶来生产O-琥珀酰高丝氨酸或甲硫氨酸的大肠杆菌菌株的构建为了构建生产O-琥珀酰高丝氨酸的大肠杆菌株，将过表达metL基因的质粒引入到携带有不同的metA等位基因的菌株中，所述metL基因编码高丝氨酸脱氢酶和天冬氨酸激酶。过表达metL基因的质粒如下构建所用的两条寡核苷酸如下-具有32个碱基的MetLF(SEQ ID NO 7)TATTCatgagtgtgattgcgcaggcaggggcg其具有-与基因metL(序列4127415至4129847，网站上的参考序列http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)的序列(4127415至4127441)同源的区域(小写)，-与metL有关的序列一起构成酶BspHI的限制性位点(下划线)的区域(大写)，-具有38个碱基的MetBLAR(SEQ ID NO 8)TATAAGCTTccataaacccgaaaacatgagtaccgggc其具有-与基因metL的序列(4129894至4129866)同源的区域(小写)-具有限制性酶切位点HindIII的区域(大写)。
用寡核苷酸MetLF和MetBLAR对基因metL进行PCR扩增，并且在metL基因的N-端和C-端分别引入限制性酶切位点BspHI和HindIII。所得PCR片段用BspHI和HindIII限制性消化，并克隆入预先用NcoI和HindIII切割的载体pTRC99A(Stratagene)中。
检验质粒制备物是否存在大小正确的插入片段。验证metL的DNA序列，所得质粒pTRCmetL转化入携带等位基因metA*11和metA*13的菌株中。
体外确定高丝氨酸脱氢酶II(HDH)的活性。在含10g/l葡萄糖的基本培养基中培养大肠杆菌株，在晚对数期收获。细胞重悬于冷的磷酸钾缓冲液中，冰上进行超声(Branson sonifier，70W)。离心之后对上清中含有的蛋白质进行定量(Bradford，1976)。
三十微升提取物与25mM高丝氨酸和1mM NADP+一起在分光光度计中在30℃下孵育。加入氯化钾来活化酶。由于大肠杆菌具有第二个编码高丝氨酸脱氢酶活性(thrA)的基因，加入苏氨酸抑制该活性。在340nm下持续30分钟监测NADPH的出现。
当与具有该质粒的相似菌株相比时，从Ptrc启动子表达metL大大增加了HDH活性。
表3具有metA*11突变的MG1655大肠杆菌株中MetL蛋白质的高丝氨酸脱氢酶活性，其中存在或不存在Ptrc启动子启动的metL过表达。
在另一个应用中，具有metA*11、metA*13和metA*14等位基因的菌株中删除甲硫氨酸调节基因metJ。为了灭活metJ基因，使用如Datsenko和Wanner(2000)所述的同源重组策略。该策略允许插入氯霉素抗性盒，同时删除所关注基因的大部分。为此，所用的两条寡聚核苷酸如下-具有100个碱基的DmetJF(SEQ ID NO 9)CaggcaccagagtaaacattgtgttaatggacgtcaatacatctggacatctaaacttctttgcgtatagattgagcaaaCATATGAATATCCTCCTTAG具有-与基因metJ(序列4125658至4125975，网站上的参考序列http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)的序列(4126216至4126137)同源的区域(小写)，-用于扩增氯霉素抗性盒的区域(大写)(Datsenko，K.A.& Wanner，B.L.，2000，PNAS，976640-6645中的参考序列)-具有100个碱基的DmetJR(SEQ ID NO 10)tgacataggcctgataagcgtagcgcatcaggcgattccactccgcgccgctcttttttgctttagtattcccacgtctcTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG具有-与基因metJ的序列(4125596至4125675)同源的区域(小写)
-用于扩增氯霉素抗性盒的区域(大写)。
用寡核苷酸DmetJR和DmetJF从质粒pKD3中扩增氯霉素抗性盒。用电穿孔将PCR产物引入到MG1665(pKD46)中，其中Red重组酶的表达使得同源重组得以实现。然后筛选氯霉素抗性的转化体，抗性盒的插入用如下限定的寡聚核苷酸MetJR和MetJF经PCR分析验证。保留的菌株命名为MG1655(ΔmetJ::Cm)metA*。
MetJR(SEQ ID NO 11)ggtacagaaaccagcaggctgaggatcagc(与4125431至4125460的序列同源)。
MetBR(SEQ ID NO 12)ttcgtcgtcatttaacccgctacgcgcactgc(与4126305至4126276的序列同源)。
然后删除氯霉素抗性盒。用电穿孔将携带有作用于氯霉素抗性盒FRT位点的重组酶FLP的质粒pCP20引入到重组株。在42℃下经过一系列培养，用同样的寡聚核苷酸经PCR分析验证氯霉素抗性盒的缺失。保留的菌株被称为MG1655(ΔmetJ)metA*。
随后将携带metL基因的质粒pTRCmetL引入这些菌株，从而获得ΔmetJ metA*11pTRCmetL，ΔmetJ metA*13 pTRCmetL和ΔmetJ metA*14 pTRCmetL。
实施例4表达反馈敏感度进一步降低的酶的高丝氨酸琥珀酰基转移酶等位基因的构建为了进一步降低高丝氨酸琥珀酰基转移酶对反馈抑制剂甲硫氨酸和SAM的敏感度，通过位点定向突变构建了其它metA突变株。
首先，将metA和metA*11等位基因克隆到载体pTRC99A(Stratagene)中。所用的两条寡聚核苷酸如下-具有49个碱基的MetA-NcoI(SEQ ID NO 13)TATTAAATTACCatggcaccgattcgtgtgccggacgagctacccgccg具有-与基因metA(序列4211859至4212788，网站上的参考序列http://genolist.pasteur.fr/colibri/)的序列(4211862至4211892)同源的区域(小写)，-与metA有关的序列一起构成酶NcoI的限制性位点(下划线)的区域(大写)，
-具有47个碱基的MetA-EcoRI(SEQ ID NO 14)TATTAAATTAGaattccgactatcacagaagattaatccagcgttgg具有-与基因metA的序列(4212804至42127774)同源的区域(小写)-具有限制性位点EcoRI的区域(大写)。
用寡聚核苷酸MetAF和MetAR对等位基因metA和metA*11进行PCR扩增。并且在metA基因的N-端和C-端分别引入限制性酶切位点NcoI和EcoRI。所得PCR片段用NcoI和EcoRI限制性消化，并克隆到用NcoI和EcoRI预先切割的载体pTRC99A(Stratagene)中。
检验质粒制备物是否存在大小正确的插入片段，测序验证metA和metA*11的DNA序列。
酶法分析表达metA和metA*11的克隆，表现非常低的MetA活性。我们推测，将metA克隆至载体pTRC99A中需要而在氨基酸1M和2P之间引入的丙氨酸，导致了这种活性丢失。因此，利用位点定向突变(Stratagene)，用如下寡聚核苷酸将丙氨酸去除metA-alaF(AflIII)(SEQ ID NO 15)cacacaggaaacagaccatgccgatacgtgtgccggacgagctacccmetA-alaR(AflIII)(SEQ ID NO 16)gggtagctcgtccggcacacgtatcggcatggtctgtttcctgtgtg随后用更正后metA序列作为基础，通过位点定向突变(Stratagene)构建突变体metA*15(A27V+Q64E)、metA*16(Q64D)和metA*17(A27V+Q64D)。为了构建pTRCmetA*15(A27V+Q64E)，使用了如下寡聚核苷酸MetAA28VF(XbaI)(SEQ ID NO 17)GtgatgacaacttctagagtgtctggtcaggaaattcgtccMetAA28VR(XbaI)(SEQ ID NO 18)Ggacgaatttcctgaccagacactctagaagttgtcatcac以及用pTRCmetA*11作为基础。
为了构建pTRCmetA*16(Q64D)，使用了如下寡聚核苷酸MetAQ64DF(EcoRV)(SEQ ID NO 19)GctttcaaactcacctttggatgtcgatatccagctgttgcMetAQ64DR(EcoRV)(SEQ ID NO 20)gcaacagctggatatcgacatccaaaggtgagtttgaaagc以及用pTRCmetA作为基础。
为了构建pTRCmetA*17(A27V+Q64D)，使用了如下寡聚核苷酸MetAA28VF(XbaI)(SEQ ID NO 17)和MetAA28VR(XbaI)(SEQ ID NO 18)；以及用pTRCmetA*16作为基础。
测序验证质粒。
为了将等位基因metA*15、metA*16和metA*17转化到染色体的metA基因座上，采用与删除metJ相同的策略在ΔmetJ背景下删除metA。为了删除metA使用如下寡聚核苷酸DmctAF(4211866-4211945)(SEQ ID NO 21)ttcgtgtgccggacgagctacccgccgtcaatttcttgcgtgaagaaaacgtctttgtgatgacaacttctcgtgcgtctTGTAGGCTGGAGCTGCTTCGDmetAR(4212785-4212706)(SEQ ID NO 22)AtccagcgttggattcatgtgccgtagatcgtatggcgtgatctggtagacgtaatagttgagccagttggtaaacagtaCATATGAATATCCTCCTTAG小写所示区域对应metA和yjaB之间的序列。大写所示区域用于扩增卡那霉素抗性盒(Datsenko & Wanner，2000)。(括号内的数字对应网站上的参考序列http://genolist.pasteur.fr/colibri/)。
用如下寡聚核苷酸验证所得删除。(括号内的数字对应网站上的参考序列http://genolist.pasteur.fr/colibri/)。
MetAF(SEQ ID NO 3)和MetAR(SEQ ID NO 4)。
用所得菌株DmetJ DmetA将等位基因metA*15、metA*16和metA*17引入染色体上。为此，将质粒pKD46引入DmetJ DmetA株(Datsenko & Wanner，2000)。用如下寡聚核苷酸从载体pTRC metA*15、pTRC metA*16和pTRC metA*17中扩增等位基因MetArcF(421786-4211884)(SEQ ID NO 23)GgcaaattttctggttatcttcagctatctggatgtctaaacgtataagcgtatgtagtgaggtaatcaggttatgccgattcgtgtgccggacgagcMctArcR(4212862-4212764)(SEQ ID NO 24)Cggaaataaaaaaggcacccgaaggtgcctgaggtaaggtgctgaatcgcttaacgatcgactatcacagaagattaatccagcgttggattcatgtgc粗体的序列与基因metA的序列同源；其余序列邻近metA。
为进行PCR验证，使用如下寡聚核苷酸MetAF(SEQ ID NO 3)和MetAR(SEQID NO 4)。
如上所述，在基本培养基中培养所得菌株，制备粗提物并确定MetA活性。从表4可见，新构建的等位基因对甲硫氨酸和SAM抑制的敏感度比上述等位基因小。特别有趣的是，等位基因metA*15具有的内在活性高，不能为SAM和甲硫氨酸所抑制。
表4存在和缺少100mM甲硫氨酸和1mM SAM时MetA突变体的高丝氨酸琥珀酰基转移酶的活性。括号内的百分比值表示受抑制时残余活性的量。
实施例5通过组合抗反馈MetA等位基因和活性降低的MetK等位基因而用于生产O-琥珀酰高丝氨酸或甲硫氨酸的大肠杆菌株的构建为了将重组metK等位基因转化到含有抗反馈抑制metA基因的菌株中，卡那霉素抗性盒被引入到metK和galP基因中间。
为了引入此盒，使用如Datsenko和Wanner(2000)所述的同源重组策略。该策略允许插入卡那霉素抗性盒，而删除所关注基因的大部分。为此，所用的两条寡聚核苷酸如下-具有100个碱基的DmetKFscr(SEQ ID NO 25)ccgcccgcacaataacatcattcttcctgatcacgtttcaccgcagattatcatcacaactgaaaccgattacaccaaccTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG具有-与metK和galP(序列3085964至3086043，网站上的参考序列http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)之间区域的序列同源的区域(小写)，-用于扩增卡那霉素抗性盒的区域(大写)(Datsenko，K.A.& Wanner，B.L.，2000，PNAS，976640-6645中的参考序列)-具有100个碱基的DmetKRscr(SEQ ID NO 26)gagttatatcatcatagattaaacgctgttatctgcaattaagactttactgaaaagaaatgtaacaactgtgaaaaccgCATATGAATATCCTCCTTAG具有-与基因metK和galP之间区域的序列同源的区域(小写)(3086162至3086083)-用于扩增卡那霉素抗性盒的区域(大写)。
用寡聚核苷酸DmetKFscr和DmetKRscr从质粒pKD4中扩增卡那霉素抗性盒。然后用电穿孔将PCR产物引入MG1665(pKD46)中，其中Red重组酶的表达使得同源重组得以实现。然后筛选卡那霉素抗性盒的转化体，抗性盒的插入用如下限定的寡聚核苷酸MetKFscr和MetKRscr经PCR分析验证。保留菌株命名为MG1655(metK，Km)。(此处插入原文28页序列27)MetKFscr(SEQ ID NO 27)gcgcccatacggtctgattcagatgctgg(与3085732至3085760的序列同源)。
MctKRscr(SEQ ID NO 28)gcgccagcaattacaccgatatccaggcc(与3086418至3086390的序列同源)。
为了转移等位基因metK，使用了噬菌体P1转导的方法。如下操作方案经2个步骤进行，制备菌株MG1655(metK，Km)的噬菌体裂解物然后转导入菌株MG1655ΔmetJmetA*11pTRCmetL。
如下描述菌株(metK，Km)的构建噬菌体裂解物P1的制备-从10ml LB+Km 50μg/ml+葡萄糖0.2％+CaCl25mM的菌株MG1655(metK，Km)过夜培养物中接种100μl-37℃下振摇培养30分钟-加入100μl在野生型菌株MG1655制备的噬菌体裂解物P1(约1*109噬菌体/ml)-37℃下振摇3小时，直至所有细胞裂解-加入200μl氯仿，漩涡振荡
-4500g离心10分钟除去细胞碎片-将上清转移到无菌管中，加入200μl氯仿-裂解物保存于4℃转导-将LB培养基中的菌株MG1655ΔmetJ metA*11 pTRCmetL的过夜培养物1500g离心10分钟-细胞沉淀物悬浮于2.5ml 10mM MgSO4、5mM CaCl2中-对照管100μl细胞100μl菌株MG1655(ΔmetK，Km)的噬菌体P1-测试管100μl细胞+100μl菌株MG1655(ΔmetK，Km)的噬菌体P1-37℃下不振荡孵育30分钟-向各管加入100μl 1M柠檬酸钠，漩涡振荡-加入1ml LB-37℃下振荡孵育1小时-管子在7000rpm离心3分钟后涂布到LB+Km 50μg/ml的平板上-37℃下孵育过夜菌株验证然后筛选卡那霉素抗性的转化体，含(metK，Km)区域的插入用寡聚核苷酸MetKFscr和MetKRscr经PCR分析验证。保留菌株命名为MG1655 ΔmetJ metA*11pTRCmetL metK*。
然后去除卡那霉素抗性盒。用电穿孔将携带有作用于卡那霉素抗性盒FRT位点的FLP重组酶的质粒pCP20引入到重组部位。在42℃下经过一系列培养，用同样的寡聚核苷酸经PCR分析验证卡那霉素抗性盒的缺失(MetKFscr和MetKRscr)。
实施例6大肠杆菌生产株的发酵以及产量分析用补充有5g/l MOPS和5g/l葡萄糖的改进M9培养基(Anderson，1946，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 32120-128)，首先在小Erlenmeyer瓶培养物中分析生产株。如果需要，以100mg/l的浓度加入羧苄青霉素。将过夜培养物接种到30ml培养基中，直至OD600值为0.2。当培养物OD600达到4.5至5时，加入1.25ml 50％葡萄糖溶液和0.75ml 2MMOPS(PH6.9)，持续搅拌培养物1小时。如果需要随后加入IPTG。
在分批阶段期间分析细胞外代谢物。经过OPA/Fmoc衍生化之后，用HPLC对氨基酸进行定量，其它相关代谢物硅烷化处理后用GC-MS分析。
对于菌株MG1655、MG1655 pTRCmetL、MG1655 metA*11 pTRCmetL、MG1655metA*13 pTRCmetL、MG1655 metA*11 ΔmetJ pTRCmetL、MG1655 metA*11 ΔmetJpTRCmetLmetK*H142Y，获得以下结果。
表5分批(Erlenmeyer瓶)发酵后细胞外代谢物的比浓度(mmol/g干重)。ND表示未检测。
为进一步增强高丝氨酸的生产，用Ptrc启动子从质粒pCL1920表达对苏氨酸的反馈抗性降低的天冬氨酸激酶/高丝氨酸a thrA*等位基因(Lerner&Inouye，1990，NAR18，15p 4631)。为构建质粒pME107，用如下寡聚核苷酸从基因组DNA中对thrA进行PCR扩增BspHlthrA(SEQ ID NO 29)ttaTCATGAgagtgttgaagttcggcggtacatcagtggcSmalthrA(SEQ ID NO 30)ttaCCCGGGccgccgccccgagcacatcaaacccgacgcPCR扩增片段用限制性内切酶BspHI和SmaI切割，并克隆至载体pTRC99A(Stratagene)的NcoI/SmaI位点。为了从低拷贝载体中表达，按如下步骤构建质粒pME101。用寡聚核苷酸PME101F和PME101R对质粒pCL1920进行PCR扩增，将来自载体pTRC99A并且含有lacI基因和Ptrc启动子的BstZ171-XmnI片段插入到扩增的载体中。所得载体以及含有thrA基因的载体用ApaI和SmaI进行限制性切割，将包含thrA的片段克隆至载体pME101中。为了缓解对ThrA的反馈抑制，用寡聚核苷酸ThrAF F318S和ThrAR F318S经定向突变(Stratagene)引入突变F318S，从而获得载体pME107。将载体pME107引入到具有不同的metK*等位基因的ΔmetJ metA*11菌株。
PME101F(SEQ ID NO 31)CcgacagtaagacgggtaagcctgPME101R(SEQ ID NO 32)AgcttagtaaagccctcgctagThrAF F318S(SmaI)(SEQ ID NO 33)CcaatctgaataacatggcaatgtccagcgtttctggcccgggThrAR F318S(SmaI)(SEQ ID NO 34)Cccgggccagaaacgctggacattgccatgttattcagattgg用流加分批培养方案，在300ml发酵罐(DASGIP)中在生产条件下随后对产生实质量感兴趣代谢物的菌株进行测试。
为此，发酵罐装入145ml改进的基本培养基，接种5ml预培养物至光密度值(OD600nm)在0.5至1.2之间。
培养温度维持恒定在37℃，用NH4OH溶液将pH的值持续调节在6.5至8之间。分批培养期间搅拌速率维持在200和300rpm之间，而流加分批培养期结束时增加到1000rpm。通过气体控制器将溶解氧浓度维持在30至40％饱和度之间。当光密度的值到达3至5之间时，以0.3和0.5ml/h之间的流速开始进行流加，并将流速逐步递增至2.5和3.5ml/h之间。在此稳定流速维持恒定24到48小时。流加的培养基是基于含葡萄糖的基本培养基，其中葡萄糖浓度介于300到500g/l之间。
表6表示操作约75个小时以后，和参考菌株ΔmetJ metA*11 pME107相比，ΔmetJmetA*11 pME107 metK*H142Y和ΔmetJ metA*11 pME107 metK*T227I菌株的甲硫氨酸浓度。和参考菌株相比，这两种携带metK*等位基因的菌株都提高了甲硫氨酸浓度。因此，metK突变通过增加菌株生产率，给甲硫氨酸生产带来了工业上的优势。
表6指定操作(包括分批培养和流加培养)时间后，参考菌株ΔmetJ metA*11 pME107以及两个携带metK*突变的菌株中甲硫氨酸产量。
序列表<110>代谢探索者公司<120>改变反馈敏感度的重组酶<130>347 921<150>PCT/IB2004/001901<151>2004-05-12<160>34<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>930<212>DNA<213>大肠杆菌<220>
<221>CDS<222>(1)..(930)<223>高丝氨酸琥珀酰基转移酶<400>1atg ccg att cgt gtg ccg gac gag cta ccc gcc gtc aat ttc ttg cgt 48Met Pro Ile Arg Val Pro Asp Glu Leu Pro Ala Val Asn Phe Leu Arg1 5 10 15gaa gaa aac gtc ttt gtg atg aca act tct cgt gcg tct ggt cag gaa 96Glu Glu Asn Val Phe Val Met Thr Thr Ser Arg Ala Ser Gly Gln Glu20 25 30att cgt cca ctt aag gtt ctg atc ctt aac ctg atg ccg aag aag att 144Ile Arg Pro Leu Lys Val Leu Ile Leu Asn Leu Met Pro Lys Lys Ile35 40 45gaa act gaa aat cag ttt ctg cgc ctg ctt tca aac tca cct ttg cag 192Glu Thr Glu Asn Gln Phe Leu Arg Leu Leu Ser Asn Ser Pro Leu Gln50 55 60gtc gat att cag ctg ttg cgc atc gat tcc cgt gaa tcg cgc aac acg 240Val Asp Ile Gln Leu Leu Arg Ile Asp Ser Arg Glu Ser Arg Asn Thr65 70 75 80ccc gca gag cat ctg aac aac ttc tac tgt aac ttt gaa gat att cag 288Pro Ala Glu His Leu Asn Asn Phe Tyr Cys Asn Phe Glu Asp Ile Gln85 90 95gat cag aac ttt gac ggt ttg att gta act ggt gcg ccg ctg ggc ctg 336Asp Gln Asn Phe Asp Gly Leu Ile Val Thr Gly Ala Pro Leu Gly Leu100 105 110gtg gag ttt aat gat gtc gct tac tgg ccg cag atc aaa cag gtg ctg 384Val Glu Phe Asn Asp Val Ala Tyr Trp Pro Gln Ile Lys Gln Val Leu115 120 125gag tgg tcg aaa gat cac gtc acc tcg acg ctg ttt gtc tgc tgg gcg 432Glu Trp Ser Lys Asp His Val Thr Ser Thr Leu Phe Val Cys Trp Ala130 135 140
gta cag gcc gcg ctc aat atc ctc tac ggc att cct aag caa act cgc 480Val Gln Ala Ala Leu Asn Ile Leu Tyr Gly Ile Pro Lys Gln Thr Arg145 150 155 160acc gaa aaa ctc tct ggc gtt tac gag cat cat att ctc cat cct cat 528Thr Glu Lys Leu Ser Gly Val Tyr Glu His His Ile Leu His Pro His165 170 175gcg ctt ctg acg cgt ggc ttt gat gat tca ttc ctg gca ccg cat tcg 576Ala Leu Leu Thr Arg Gly Phe Asp Asp Ser Phe Leu Ala Pro His Ser180 185 190cgc tat gct gac ttt ccg gca gcg ttg att cgt gat tac acc gat ctg 624Arg Tyr Ala Asp Phe Pro Ala Ala Leu Ile Arg Asp Tyr Thr Asp Leu195 200 205gaa att ctg gca gag acg gaa gaa ggg gat gca tat ctg ttt gcc agt 672Glu Ile Leu Ala Glu Thr Glu Glu Gly Asp Ala Tyr Leu Phe Ala Ser210 215 220aaa gat aag cgc att gcc ttt gtg acg ggc cat ccc gaa tat gat gcg 720Lys Asp Lys Arg Ile Ala Phe Val Thr Gly His Pro Glu Tyr Asp Ala225 230 235 240caa acg ctg gcg cag gaa ttt ttc cgc gat gtg gaa gcc gga cta gac 768Gln Thr Leu Ala Gln Glu Phe Phe Arg Asp Val Glu Ala Gly Leu Asp245 250 255ccg gat gta ccg tat aac tat ttc ccg cac aat gat ccg caa aat aca 816Pro Asp Val Pro Tyr Asn Tyr Phe Pro His Asn Asp Pro Gln Asn Thr260 265 270ccg cga gcg agc tgg cgt agt cac ggt aat tta ctg ttt acc aac tgg 864Pro Arg Ala Ser Trp Arg Ser His Gly Asn Leu Leu Phe Thr Asn Trp275 280 285ctc aac tat tac gtc tac cag atc acg cca tac gat cta cgg cac atg 912Leu Asn Tyr Tyr Val Tyr Gln Ile Thr Pro Tyr Asp Leu Arg His Met290 295 300aat cca acg ctg gat taa 930Asn Pro Thr Leu Asp305<210>2<211>1155<212>DNA<213>大肠杆菌<220>
<221>CDS<222>(1)..(1155)<223>S-腺苷甲硫氨酸合成酶<400>2atg gca aaa cac ctt ttt acg tcc gag tcc gtc tct gaa ggg cat cct 48Met Ala Lys His Leu Phe Thr Ser Glu Ser Val Ser Glu Gly His Pro1 5 10 15gac aaa att gct gac caa att tct gat gcc gtt tta gac gcg atc ctc 96Asp Lys Ile Ala Asp Gln Ile Ser Asp Ala Val Leu Asp Ala Ile Leu
20 25 30gaa cag gat ccg aaa gca cgc gtt gct tgc gaa acc tac gta aaa acc 144Glu Gln Asp Pro Lys Ala Arg Val Ala Cys Glu Thr Tyr Val Lys Thr35 40 45ggc atg gtt tta gtt ggc ggc gaa atc acc acc agc gcc tgg gta gac 192Gly Met Val Leu Val Gly Gly Glu Ile Thr Thr Ser Ala Trp Val Asp50 55 60atc gaa gag atc acc cgt aac acc gtt cgc gaa att ggc tat gt cat 240Ile Glu Glu Tle Thr Arg Asn Thr Val Arg Glu Ile Gly Tyr Val His65 70 75 80tcc gac atg ggc ttt gac gct aac tcc tgt gcg gtt ctg agc gct atc 288Ser Asp Met Gly Phe Asp Ala Asn Ser Cys Ala Val Leu Ser Ala Ile85 90 95ggc aaa cag tct cct gac atc aac cag ggc gtt gac cgt gcc gat ccg 336Gly Lys Gln Ser Pro Asp Tle Asn Gln Gly Val Asp Arg Ala Asp Pro100 105 110ctg gaa cag ggc gcg ggt gac cag ggt ctg atg ttt ggc tac gca act 384Leu Glu Gln Gly Ala Gly Asp Gln Gly Leu Met Phe Gly Tyr Ala Thr115 120 125aat gaa acc gac gtg ctg atg cca gca cct atc acc tat gca cac cgt 432Asn Glu Thr Asp Val Leu Met Pro Ala Pro Ile Thr Tyr Ala His Arg130 135 140ctg gta cag cgt cag gct gaa gtg cgt aaa aac ggc act ctg ccg tgg 480Leu Val Gln Arg Gln Ala Glu Val Arg Lys Asn Gly Thr Leu Pro Trp145 150 155 160ctg cgc ccg gac gcg aaa agc cag gtg act ttt cag tat gac gac ggc 528Leu Arg Pro Asp Ala Lys Ser Gln Val Thr Phe Gln Tyr Asp Asp Gly165 170 175aaa atc gtt ggt atc gat gct gtc gtg ctt tcc act cag cac tct gaa 576Lys Ile Val Gly Ile Asp Ala Val Val Leu Ser Thr Gln His Ser Glu180 185 190gag atc gac cag aaa tcg ctg caa gaa gcg gta atg gaa gag atc atc 624Glu Tle Asp Gln Lys Ser Leu Gln Glu Ala Val Met Glu Glu Ile Ile195 200 205aag cca att ctg ccc gct gaa tgg ctg act tct gcc acc aaa ttc ttc 672Lys Pro Ile Leu Pro Ala Glu Trp Leu Thr Ser Ala Thr Lys Phe Phe210 215 220atc aac ccg acc ggt cgt ttc gtt atc ggt gcc cca atg ggt gac tgc 720Ile Asn Pro Thr Gly Arg Phe Val Ile Gly Gly Pro Met Gly Asp Cys225 230 235 240ggt ctg act ggt cgt aaa att atc gtt gat acc tac ggc ggc atg gcg 768Gly Leu Thr Gly Arg Lys Ile Ile Val Asp Thr Tyr Gly Gly Met Ala245 250 255cgt cac ggt ggc ggt gca ttc tct ggt aaa gat cca tca aaa gtg gac 816Arg His Gly Gly Gly Ala Phe Ser Gly Lys Asp Pro Ser Lys Val Aap260 265 270cgt tcc gca gcc tac gca gca cgt tat gtc gcg aaa aac atc gtt gct 864Arg Ser Ala Ala Tyr Ala Ala Arg Tyr Val Ala Lys Asn Ile Val Ala275 280 285gct ggc ctg gcc gat cgt tgt gaa att cag gtt tcc tac gca atc ggc 912Ala Gly Leu Ala Asp Arg Cys Glu Ile Gln Val Ser Tyr Ala Ile Gly
290 295300gtg gct gaa ccg acc tcc atc atg gta gaa act ttc ggt act gag aaa960Val Ala Glu Pro Thr Ser Ile Met Val Glu Thr Phe Gly Thr Glu Lys305 310 315 320gtg cct tct gaa caa ctg acc ctg ctg gta cgt gag ttc ttc gac ctg1008Val Pro ser Glu gln Leu Tnr Leu Leu Val Arg Glu Phe Phe Asp Leu325 330 335cgc cca tac ggt ctg att cag atg ctg gat ctg ctg cac ccg atc tac1056Arg Pro Tyr Gly Leu Ile Gln Met Leu Asp Leu Leu His Pro Ile Tyr340 345 350aaa gaa acc gca gca tac ggt cac ttt ggt cgt gaa cat ttc ccg tgg 1104Lys Glu Thr Ala Ala Tyr Gly His Phe Gly Arg Glu His Phe Pro Trp355 360 365gaa aaa acc gac aaa gcg cag ctg ctg cgc gat gct gcc ggt ctg aag 1152Glu Lys Thr Asp Lys Ala Gln Leu Leu Arg Asp Ala Ala Gly Leu Lys370 375 380taa 1155<210>3<211>30<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>3tcaccttcaa catgcaggct cgacattggc 30<210>4<211>30<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>4ataaaaaagg cacccgaagg tgcctgaggt 30<210>5<211>22<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>5cccggctgga agtggcaaca cg 22<210>6<211>26<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>6gccggatgcg gcgtgaacgc ctatcc 26<210>7<211>32<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>7tattcatgag tgtgattgcg caggcagggg cg32<210>8<211>38<212>DNA<213>合成寡核苷酸
<400>8tataagcttc cataaacccg aaaacatgag taccgggc38<210>9<211>100<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>9caggcaccag agtaaacatt gtgttaatgg acgtcaatac atctggacat ctaaacttct 60ttgcgtatag attgagcaaa catatgaata tcctccttag 100<210>10<211>100<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>10tgacgtaggc ctgataagcg tagcgcatca ggcgattcca ctccgcgccg ctcttttttg60ctttagtatt cccacgtctc tgtaggctgg agctgcttcg 100<210>11<211>30<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>11ggtacagaaa ccagcaggct gaggatcagc 30<210>12<211>30<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>12ttcgtcgtca tttaacccgc tacgcactgc 30<210>13<211>49<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>13tattaaatta ccatggcacc gattcgtgtg ccggacgagc tacccgccg49<210>14<211>47<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>14tattaaatta gaattccgac tatcacagaa gattaatcca gcgttgg 47<210>15<211>47<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>15cacacaggaa acagaccatg ccgatacgtg tgccggacga gctaccc 47<210>16<211>47<212>DNA<213>合成寡核苷酸
<400>16gggtagctcg tccggcacac gtatcggcat ggtctgtttc ctgtgtg 47<210>17<211>41<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>17gtgatgacaa cttctagagt gtctggtcag gaaattcgtc c 41<210>18<211>41<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>18ggacgaattt cctgaccaga cactctagaa gttgtcatca c 41<210>19<211>41<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>19gctttcaaac tcacctttgg atgtcgatat ccagctgttg c 41<210>20<211>41<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>20gcaacagctg gatatcgaca tccaaaggtg agtttgaaag c 41<210>21<211>100<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>21ttcgtgtgcc ggacgagcta cccgccgtca atttcttgcg tgaagaaaac gtctttgtga 60tgacaacttc tcgtgcgtct tgtaggctgg agctgcttcg 100<210>22<211>100<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>22atccagcgtt ggattcatgt gccgtagatc gtatggcgtg atctggtaga cgtaatagtt 60gagccagttg gtaaacagta catatgaata tcctccttag 100<210>23<211>97<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>23gcaaattttc tggttatctt cagctatctg gatgtctaaa cgtataagcg tatgtagtga60ggtaatcagg ttatgccgat tcgtgtgccg gacgagc 97<210>24<211>99
<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>24cggaaataaa aaaggcaccc gaaggtgcct gaggtaaggt gctgaatcgc ttaacgatcg 60actatcacag aagattaatc cagcgttgga ttcatgtgc99<210>25<211>100<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>25ccgcccgcac aataacatca ttcttcctga tcacgtttcaccgcagatta tcatcacaac 60tgaaaccgat tacaccaacc tgtaggctgg agctgcttcg 100<210>26<211>100<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>26gagttatatc atcatagatt aaacgctgtt atctgcaatt aagactttac tgaaaagaaa 60tgtaacaact gtgaaaaccg catatgaata tcctccttag 100<210>27<211>29<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>27gcgcccatac ggtctgattc agatgctgg 29<210>28<211>29<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>28gcgccagcaa ttacaccgat atccaggcc 29<210>29<211>40<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>29ttatcatgag agtgttgaag ttcggcggta catcagtggc 40<210>30<211>39<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>30ttacccgggc cgccgccccg agcacatcaa acccgacgc39<210>31<211>24<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>31ccgacagtaa gacgggtaag cctg24
<210>32<211>22<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>32agcttagtaa agccctcgct ag 22<210>33<211>43<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>33ccaatctgaa taacatggca atgtccagcg tttctggccc ggg43<210>34<211>43<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>34cccgggccag aaacgctgga cattgccatg ttattcagat tgg4权利要求
1.在用微生物发酵过程中制备甲硫氨酸、其前体或其衍生产物的方法，在此过程中L-高丝氨酸经高丝氨酸琥珀酰基转移酶转化为O-琥珀酰高丝氨酸，所述方法包括以下步骤在适宜培养基上培养所述微生物并回收生成的甲硫氨酸、其前体或其衍生产物，其中所述高丝氨酸琥珀酰基转移酶是突变型高丝氨酸琥珀酰基转移酶，该突变型高丝氨酸琥珀酰基转移酶对反馈抑制剂S-腺苷甲硫氨酸和甲硫氨酸的敏感度降低。
2.权利要求1的方法，其中修饰型高丝氨酸琥珀酰基转移酶表现的比活性，当存在10mM甲硫氨酸和1mM S-腺苷甲硫氨酸时是野生型酶活性的至少10倍，当存在10mM甲硫氨酸和0.1mM S-腺苷甲硫氨酸时是野生型酶活性的至少80倍。
3.权利要求1或2之一的方法，其中，和野生型序列相比，修饰型高丝氨酸琥珀酰基转移酶在以下非突变保守区域之一及其组合中包含至少1个氨基酸突变保守区域1，包含以下序列X1-X2-X3-A-X4-X5-Q其中X1代表E，D，T，S，L，优选T；X2代表D，S，K，Q，E，A，R，优选S；X3代表R，E，D，优选R；X4代表Y，I，F，A，K，S，V，优选S；X5代表H，S，N，G，T，R，优选G；保守区域2，包含以下序列X1-X2-X3-P-L-Q-X4-X5其中X1代表G，A，S，优选S；X2代表N，A，优选N；X3代表S，T，优选S；X4代表V，L，I，优选V；X5代表N，E，H，D，优选D；保守区域3，包含以下序列X1-Y-Q-X2-T-P-X3其中X1代表V，I，M，优选V；X2代表E，K，G，I，Q，T，S，优选I；X3代表F，Y，优选Y。
4.权利要求3的方法，其中修饰型高丝氨酸琥珀酰基转移酶包含以下突变中至少一个及其组合将保守区域1中的保守性丙氨酸替换为缬氨酸，将保守区域2中的保守性氨基酸L和/或Q替换为其它氨基酸，优选将亮氨酸替换为苯丙氨酸和/或将谷氨酰胺替换为谷氨酸或天冬氨酸，以及将保守区域3中的保守性氨基酸L和/或Q替换为另一种氨基酸。
5.权利要求4的方法，其中修饰的保守区域1包含氨基酸序列T-S-R-V-S-G-Q，和/或修饰的保守区域2包含选自S-N-S-P-F-Q-V-D、S-N-S-P-F-E-V-D、S-N-S-P-F-D-V-DD、S-N-S-P-L-E-V-D以及S-N-S-P-L-D-V-D的氨基酸序列。
6.权利要求1至5中任一项的方法，其中微生物包含一种S-腺苷甲硫氨酸合成酶，该酶的S-腺苷甲硫氨酸合成酶活性降低。
7.权利要求6的方法，其中修饰型S-腺苷甲硫氨酸合成酶含有以下指出的至少一个序列中的至少一个突变第89位半胱氨酸和/或第239位半胱氨酸保守区域1，包含以下序列的非突变区域1G-E-X1-X2-X3-X4其中X代表I，V，L，T，优选I；X2代表T，K，S，R，优选T；X3代表T，S，G，优选T；X4代表S，N，T，K，E，R，P，N，A，优选S；保守区域2，包含以下序列的非突变保守区域2Q-S-X1-D-I-X2-X3-G-V-X4其中X1代表P，Q，A，S，优选P；X2代表A，N，Q，S，F，优选N；X3代表V，Q，Y，R，M，N，优选Q；X4代表K，D，A，N，T，S，E，优选D；保守区域3，包含以下序列的非突变保守区域3X1-G-A-G-D-Q-G-X2其中X1代表Q，A，I，V，E，T，优选Q；X2代表L，I，S，V，M，优选L；保守区域4，包含以下序列的非突变保守区域4X1-I-X2-X3-X4-H-X5-X6其中X1代表S，P，T，A，优选P；X2代表A，T，W，Y，F，S，N，优选T；X3代表M，Y，L，V，优选Y；X4代表S，A，优选A；X5代表K，R，E，D，优选R；X6代表L，I，优选L；保守区域5，包含以下序列的非突变保守区域5X1-L-X2-X3-D其中X1代表W，F，Y，V，E，优选W；X2代表R，G，L，K，优选R；X3代表P，L，H，V，优选P；保守区域6，包含以下序列的非突变保守区域6X1-X2-X3-S-X4-Q-H其中X1代表V，I，优选V；X2代表V，L，I优选V；X3代表V，L，I，M，优选L；X4代表T，V，A，S，H，优选T；保守区域7，包含以下序列的非突变保守区域7X1-N-P-X2-G-X3-F其中X1代表V，I，优选I，X2代表T，G，S，优选T，X3代表R，T，Q，K，S，优选R，保守区域8，包含以下序列的非突变保守区域8X1-X2-G-X3-P-X4-X5其中X1代表T，V，I，Y，E，优选V；X2代表V，I，L，N，优选I；X3代表G，S，优选GX4代表M，I，Q，A，H，D，优选MX4代表G，S，A，H，优选G保守区域9，包含以下序列的非突变保守区域9X1-X2-D-T-Y-G-G其中X1代表M，I，优选I；X2代表V，I，优选I；保守区域10，包含以下序列的非突变保守区域10K-V-D-R-S-X1-X2其中X1代表A，G，优选A；X2代表A，S，L，优选A；保守区域11，包含以下序列的非突变保守区域11X1-X2-Q-X3-X4-Y-A-I-G-X5-X6其中X1代表L，E，I，Q，T，优选E；X2代表V，I，L，优选I；X3代表V，L，I，优选V；X4代表A，S，优选S；X5代表V，I，R，K，A，优选V；X6代表A，V，T，S，优选A。
8.权利要求7的方法，其中活性降低的修饰型S-腺苷甲硫氨酸合成酶包含以下突变中至少1个及其组合保守区域1中保守丝氨酸替换为另一个氨基酸，优选替换为天冬氨酸，保守区域2中保守甘氨酸替换为另一个氨基酸，优选替换为丝氨酸，保守区域3中保守甘氨酸替换为另一个氨基酸，优选替换为丝氨酸，保守区域4中保守组氨酸和/或半保守脯氨酸替换为另一个氨基酸，优选将保守组氨酸替换为酪氨酸和/或将保守脯氨酸替换为亮氨酸，保守区域5中半保守精氨酸替换为另一个氨基酸，优选替换为半胱氨酸，保守区域6中保守组氨酸和/或半保守缬氨酸替换为另一个氨基酸，优选将保守组氨酸替换为酪氨酸和/或将缬氨酸替换为天冬氨酸，保守区域7中半保守苏氨酸替换为另一个氨基酸，优选替换为异亮氨酸，保守区域8中保守脯氨酸替换为另一个氨基酸，优选替换为丝氨酸，保守区域9中第二个保守甘氨酸替换为另一个氨基酸，优选替换为天冬氨酸，保守区域10中保守丝氨酸替换为另一个氨基酸，优选替换为苯丙氨酸，以及保守区域11中保守异亮氨酸替换为另一个氨基酸，优选替换为亮氨酸。
9.权利要求8的方法，其中修饰的区域1包含氨基酸序列G-E-I-T-T-N和/或修饰的保守区域2包含氨基酸序列Q-S-P-D-I-N-Q-S-V-D和/或修饰的保守区域3包含氨基酸序列Q-S-A-G-D-Q-G-L和/或修饰的保守区域4包含选自P-I-T-Y-A-Y-R-L、L-I-T-Y-A-H-R-L和L-I-T-Y-A-Y-R-L的氨基酸序列，和/或修饰的保守区域5包含氨基酸序列W-L-C-P-D和/或修饰的保守区域6包含选自V-V-L-S-T-Q-Y、V-D-L-S-T-Q-H和V-D-L-S-T-Q-Y的氨基酸序列，和/或修饰的保守区域7包含氨基酸序列I-N-P-I-G-R-F和/或修饰的保守区域8包含氨基酸序列V-I-G-G-S-M-G和/或修饰的保守区域9包含氨基酸序列I-V-D-T-Y-G-D和/或修饰的保守区域10包含氨基酸序列K-V-D-R-F-A-A和/或修饰的保守区域11包含氨基酸序列E-I-Q-V-S-Y-A-L-G-V-A。
10.权利要求1至9中任一项的方法，其中修饰的微生物选自原核和真核生物，优选原核生物，更具体地大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌。
11.权利要求2至5中任一项所限定的突变型高丝氨酸琥珀酰基转移酶，对反馈抑制剂S-腺苷甲硫氨酸和甲硫氨酸的敏感度降低。
12.编码权利要求11所限定的突变型高丝氨酸琥珀酰基转移酶的核苷酸序列，所述酶对反馈抑制剂S-腺苷甲硫氨酸和甲硫氨酸的敏感度降低。
13.权利要求6至9中任一项所限定的突变型S-腺苷甲硫氨酸合成酶。
14.编码权利要求13所限定的突变型S-腺苷甲硫氨酸合成酶的核苷酸序列。
15.包含权利要求12的核苷酸序列的微生物。
16.权利要求15的微生物，还包含权利要求14的核苷酸序列。
17.权利要求15或16的微生物，其中所述微生物选自原核和真核生物，优选原核生物，更具体地大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌。
18.权利要求15至17之一的微生物，其中过表达编码天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶的基因和/或删除编码甲硫氨酸阻遏物metJ的基因。
19.权利要求15至17之一的微生物，其中天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶由解除反馈调节的thrA等位基因所编码。
20.权利要求19的微生物，其中ThrA酶的反馈调节被Phe318Ser突变所解除。
全文摘要
本发明涉及具有改变的反馈敏感度的重组高丝氨琥珀酰基转移酶(MetA
文档编号C12N9/00GK1954067SQ200580015315
公开日2007年4月25日 申请日期2005年5月12日 优先权日2004年5月12日
发明者格韦奈莱·贝斯泰尔-科尔, 米歇尔·沙托, 赖纳·马丁·菲格, 塞利娜·雷诺, 菲利普·诺埃尔·保罗·苏卡耶 申请人:代谢探索者公司