一种溶酶体靶向次氯酸分子荧光探针及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种快速检测细胞中溶酶体靶内次氯酸的荧光探针及其制备方法和 应用，属于分析化学技术领域。
【背景技术】
[0002] 活性氧（ROS)是生物体内在很多生理和病理过程起着非常重要作用的一些含氧自 由基(羟基自由基和超氧阴离子自由基等)和非自由基(次氯酸和次氯酸等)的总称。生物体 内在氧化应激、炎症等生理和病理情况下通过酶促和非酶促反应产生各种R0S。近代的生物 医学研究表明，体内产生的ROS与一些疾病的发生、发展和机体的老化有着密切的关系。次 氯酸，化学式为HC10,是一种不稳定的弱酸，在纯净的水中通入氯气即可形成次氯酸。在水 溶液中次氯酸可部分电离生成次氯酸根和氧离子，日常生活中次氯酸（一般是其钠盐）被 广泛用作漂白剂、除臭剂和消毒剂。在生物细胞（如嗜中性白细胞）中，次氯酸由次氯酸和 氯离子在髓过氧化物酶（MPO)的催化作用下产生。作为一种重要的活性氧物种，次氯酸在 维持细胞内的氧化还原平衡状态起着非常重要的作用，但是一旦细胞中次氯酸的浓度发生 异常，就会引起包括风湿性关节炎、心血管疾病和癌症在内的多种疾病，检测生物体系中次 氯酸的浓度已成为一个重要的课题。
[0003] 然而目前对次氯酸的检测缺少靶向性，不能对细胞内某一特定的细胞器内的次氯 酸进行检测，特别缺少对细胞内溶酶体靶向的次氯酸探针，从而缺少研究细胞病变过程中 对溶酶体中次氯酸浓度变化情况的检测工具。
【发明内容】
[0004] 针对目前次氯酸分子荧光探针检测所面临的问题的现状，本发明通过分子设计， 合成出一种具有响应时间快以及溶酶体靶向性的次氯酸荧光探针。
[0005] 本发明还提供了上述溶酶体靶向性的次氯酸荧光探针的制备方法和其在水环境 和生物细胞体系中的应用。
[0006] 本发明采用以下技术方案： 一种溶酶体靶向次氯酸分子荧光探针，其特征在于，该探针分子式为：C37H35N5O5S,结构 式如下：
[0007] 上述荧光探针的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤： 1)将I.Omg的4-二乙氨基酮酸与776mg的4-苯并噻唑-1，3-间苯二酸溶于5ml甲 基磺酸中，氮气保护，90°C加热回流，反应24h;用TCL板检测反应，反应完全后，将反应液 冷却至室温，将反应液缓慢倒入50ml冰水中，用甲醇/二氯甲烷=1:10萃取，无水硫酸钠干 燥，减压旋干溶剂得粗产品用硅胶柱进行洗脱分离，可得到化合物Lyso-1，Lyso-I结构式 如下：
2) 将300mg化合物Lyso-I溶于IOml无水乙醇中，加入2ml水合肼，氮气保护，100°C加 热回流，反应30min，用TCL板检测反应，反应完全后，将反应液冷却至室温，旋干，并用娃 胶柱进行洗脱分离，可以得到化合物Lyso-2,结构式如下：
3)将150mg化合物Lyso-2溶于5ml氯仿中，在0°C加入15ML三乙胺和64mg氯乙酰 氯，逐渐升至室温，在室温下搅拌24h，用TCL板检测反应，反应完全后，加入ImL水淬灭反 应，用50mL乙酸乙酯稀释反应，用水20mL*2洗涤后用20mL*l的饱和食盐水洗涤，无水 硫酸钠干燥，减压旋干溶剂得粗产品，并用硅胶柱进行洗脱分离，可以得到化合物Lyso-3， 结构式如下：
4) 将IOOmg化合物Lyso-3溶于5mlDMF后，加入34mg碳酸钾和41mg碘化钾，室温下 搅拌30min，然后逐滴加入43mg吗啉，在室温下搅拌过夜，用TCL板检测反应，反应完全后， 加入ImL水淬灭反应，用50mL二氯甲烧稀释反应，用水20mL*2洗涤后用20mL*l的饱和 食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂得粗产品，并用硅胶柱进行洗脱分离，可以得 到目标探针化合物，简记为Lys0-ClO0
[0008] 上述次氯酸荧光探针的合成路线如下：
所述步骤1)中硅胶柱洗脱剂配比为甲醇：二氯甲烷=1:30。
[0009] 所述步骤2)中硅胶柱洗脱剂配比为乙酸乙酯：石油醚=1:1。
[0010] 所述步骤3)中硅胶柱洗脱剂配比为甲醇：二氯甲烷=1:30。
[0011] 所述步骤4)中硅胶柱洗脱剂配比为甲醇：二氯甲烷=1:30。
[0012] 本发明还提供了上述荧光探针的应用，其特征在于，该探针用于水环境中和生物 细胞体系中次氯酸的含量传感检测；所述的传感检测包含荧光检测，目视定性检测，细胞成 像检测。
[0013] 该荧光探针用于检测生物体系中细胞内溶酶体中的次氯酸的检测，与商业化溶酶 体绿进行共定位实验，其共定位系数为〇. 98,因而此探针可以作为细胞内溶酶体内次氯酸 检测探针。
[0014] 本发明的优点是：（1)探针的合成比较容易，且后处理过程相对简单；（2)本发明 实现了次氯酸分子探针的选择性快速检测，并且选择性好，抗其他分子干扰能力强。此外， 用肉眼就可以观察到溶液颜色的变化，伴随着紫外灯下同样可以观察到荧光颜色变化，是 一种具有生色传感功能的荧光探针。（3)此探针可以应用于检测生物体系中细胞内溶酶体 中的次氯酸的检测，通过与商业化溶酶体染料进行比较，发现此荧光探针对溶酶体内次氯 酸成像的重合率高，两种染料的共定位系数为〇. 98,说明此探针可以作为细胞内溶酶体内 次氯酸检测探针。基于此探针的特异性且显著的颜色变化，其试剂也可作为显示水溶液中 次氯酸分子存在的专一性指示剂，可进行实时定性及定量的目视比色法检测。故而，本发明 是一种简单，快速，灵敏的次氯酸分子特异性检测试剂，在生物分子检测领域具有广阔的应 用前景。
【附图说明】
[0015] 图1是实施例1中探针Lyso-ClO的1HNMR图谱； 图2是探针Lyso-ClO随次氯酸的加入荧光谱图的变化情况； 图3是探针Lyso-ClO对不同离子和分子的选择性荧光谱图； 图4是探针Lyso-ClO对不同离子和分子的选择性柱状图数据，其中1、空白；2、Co2+; 3、Cu2+; 4、Ni2+; 5.Br; 6.I-，； 7.NO2; 8.NO32; 9.OH; 10、S2;ll、Cys; 12、GHS; 13、Hcy; 14、过氧叔丁醇；15、过氧叔丁醚；16、H2O2; 17、NO; 18、HC10; 图5是探针Lyso-ClO溶液在次氯酸加入前后溶液颜色的变化图； 图6是探针Lyso-ClO溶液在次氯酸加入前后溶液用紫外灯照射后荧光颜色的变化 图； 图7是探针Lyso-ClO次氯酸荧光探针检测外源性次氯酸荧光成像图，其中a)只有探 针离子Lyso-ClO(5yM)荧光成像明场图；b)只有探针离子Lyso-ClO(5yM)蓝通道成 像图；c)只有探针离子Lyso-ClO红通道成像图，d)明场与荧光成像图重叠图；e)探针浓 度为5yM加入到SiHa细胞中培养30min后加入20yM次氯酸3min后明场图，f)对加入 次氯酸后蓝通道荧光成像图；g)对加入次氯酸后红通道荧光成像图；h)明场e与荧光成像 h，g图重置图片； 图8是探针Lyso-ClO次氯酸荧光探针检测外源性次氯酸荧光成像图与商业化染料 溶酶体红的共定位成像图，其中a)探针浓度为5yM与溶酶绿红加入到A549细胞中培养 30min后明场图，b)商业染料溶酶体绿荧光成像图c)加入次氯酸后探针分子红荧光成像 图，d)绿通道与红通道叠加图，e)绿通道与红通道叠加箭头部分荧光强度比较，f)绿通 道与红通道叠加强度散点图。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。
[0017] 实施例1 目标探针化合物Lyso-ClO的制备 (1) 化合物Lyso-I的合成 4-二乙氨基酮酸（1.0g，3. 19mmol,Ieq)与4-苯并噻唑-1,3-间苯二酸（776mg， 3. 19mmol, 2eq)溶于5mL甲基磺酸溶液中，氮气保护，90°C加热，反应24h。用TCL板 检测反应，反应完全后，将反应液冷却至室温，将反应液缓慢倒入50mL冰水中，用甲醇/二 氯甲烷=1:10萃取，无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂得粗产品，并用硅胶柱进行分离，硅胶 颗粒大小为200-300目，洗脱剂配比为甲醇/二氯甲烷=1:30,产率为64%。合成路线如下：
(2) 化合物Lyso-2的合成 化合物Lyso-I(300mg，0. 574mmol,Ieq)溶于IOmL无水乙醇中，加入2mL水合肼， 氮气保护，100°C加热回流，反应30min，用TCL板检测反应，反应完全后，将反应液冷却至 室温，旋干，并用硅胶柱进行分离，硅胶颗粒大小为200-300目，洗脱剂配比为乙酸乙酯/石 油醚=1:1，产率为85%。合成路线如下：
(3) 化合物Lyso-3的合成 化合物Lys〇-2(150mg，0. 41mm