ol,Ieq)溶于5mL三氯甲烧中，在0°C下加入三乙 胺15ML和氯乙酰氯（64mg，0. 62mmol，1.5eq)，逐渐升至室温，在室温下搅拌24h，TLC 检测反应完全，加入ImL水淬灭反应，用50mL乙酸乙酯稀释反应，用水20mL*2洗涤后用 20mL*l的饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂得粗产品，并用硅胶柱进行分 离，硅胶颗粒大小为200-300目，洗脱剂配比为甲醇/二氯甲烷=1:30,得化合物Lyso-3,产 率为72%。合成路线如下：
(4) 化合物Lyso-ClO的合成 化合物Lys〇-3 (100mg，0.164mmol,Ieq)溶于 5mLDMF中，在室温下加入K2CO3 (34mg，0.245mmol，1.5eq)和KI(41mg，0.245mmol，1.5eq)在室温下揽摔 30min后加 入吗啉（43mg，0. 49mmol，3eq)在室温下搅拌过夜。TLC检测反应完全，加入ImL水淬 灭反应，用50mL二氯甲烧稀释反应，用水20mL*2洗涤后用20mL*l的饱和食盐水洗涤， 无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂得粗产品，并用硅胶柱进行分离，硅胶颗粒大小为200-300 目，洗脱剂配比为甲醇/二氯甲烷=1:30,得化合物Lyso-CIO,产率67%。合成路线如下：
实施例2 化合物Lys0-ClO次氯酸荧光探针随次氯酸加入当量的增加荧光谱图的变化 取实施例1制备的Lyso-ClO次氯酸荧光探针溶于二甲亚砜（DMSO)中，制成lmmol/L储备液。从储备液中取出30yL加入到5mL的离心管当中，加入不同当量（0-30eq)的次 氯酸标准溶液，用PBS缓冲溶液（0.lmol/L，pH=7. 5)与DMSO体积比为1:1的溶液稀释至3 mL，以365nm为激发光，测量其荧光性质。荧光光谱如图2所示。由图2可见，随着次氯酸 加入当量的增加在450nm处的荧光逐渐减弱而在585nm处的荧光逐渐增强。
[0018] 实施例3 化合物Lyso-ClO次氯酸荧光探针对不同分子或离子的选择性 从实施例2中荧光探针储备液中取出30yL加入到5mL的离心管当中，分别加入 等摩尔量的竞争分子标准溶液，其中一个加入等摩尔量的次氯酸标准溶液，30min后以 PBS=DMF(1:1)为溶剂，365nm为激发光，检测溶液的荧光发射光谱变化，结果如图3所示。 同时还研究了其他金属离子对本发明探针荧光强度的影响，在以PBS:DMF(1:1)为溶剂， 410nm为激发光，结果如图4所示。由图3和图4综合看可以发现，其他金属离子对化合 物Lyso-ClO在585nm处的荧光几乎没有影响，而次氯酸溶液的加入使化合物Lyso-ClO在 585nm处的焚光显著增强。
[0019] 实施例4 化合物Lyso-ClO荧光探针对次氯酸的可视化检测 从实施例2中荧光探针储备液中取出30yL加入到5mL的样品管当中，加入80摩尔 量的次氯酸标准溶液，次氯酸可以使合物Lys0-ClO荧光探针的PBS:DMS0体积比为1:1的 缓冲溶液溶液发生明显的颜色变化，溶液颜色从无色变成红色，如图5所示。伴随着紫外灯 下肉眼可视化的次氯酸诱导的荧光探针由浅蓝光转变成明亮的红色荧光（图6)，说明是一 种具有生色传感功能的荧光探针。
[0020] 实施例5 化合物Lys0-ClO次氯酸荧光探针对细胞外源性次氯酸荧光成像 我们将本发明探针应用于SiHa细胞中对外源性的次氯酸进行荧光成像。具体操作步 骤如下：将5yMLyso-ClO次氯酸探针DMSO溶液加入到育有HeLa细胞的培养液中在二氧 化碳培养箱中培养30min后用共聚焦显微镜进行成像。成像结果如图7所示。首先进行 明场成像，可以看到细胞大致的轮廓。然后用蓝光进行激发观察在未加入次氯酸前的荧光 成像情况，此时观察不到荧光发射。向体系中加入20yM的次氯酸水溶液后，等待5min后 在用蓝光进行激发可以观察到有绿光发出，说明此荧光探针可以对外源性的次氯酸进行荧 光成像。
[0021] 实施例6 化合物Lys0-ClO次氯酸荧光探针对细胞外源性次氯酸荧光成像与商业溶酶体染料共 定位比较 我们将本发明探针应用于A549细胞中与商业化的溶酶体染料进行共定位实验，说明 本探针可以定位到溶酶体中，并对溶酶体内的外源性的次氯酸进行荧光成像应用（图8)。具 体操作步骤如下：将5yMLyso-ClO次氯酸探针DMSO溶液和商业化溶酶体染料-溶酶体红 5yM加入到育有A549细胞的培养液中在二氧化碳培养箱中培养30min后，向体系中加入 20yM的次氯酸水溶液后，再等待10min后用共聚焦显微镜进行成像，此时用（Ex=405nm) 进行激发可以观察到有蓝光发出，此为Lys0-ClO次氯酸探针与次氯酸响应后发射的光，用 光（Ex= 561nm)进行激发可以观察到有红光发出，此为商业化染料溶酶体红发出的红光， 用软件进行处理可以得出两种染料的共定位系数为〇. 98。
【主权项】
1. 一种溶酶体靶向次氯酸分子荧光探针，其特征在于，该探针分子式为：C37H35N505S，结 构式如下：2. -种权利要求1所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤： 1) 将1.Omg的4-二乙氨基酮酸与776mg的4-苯并噻唑-1，3-间苯二酸溶于5ml甲 基磺酸中，氮气保护，90°C加热回流，反应24h;用TCL板检测反应，反应完全后，将反应液 冷却至室温，将反应液缓慢倒入50ml冰水中，用甲醇/二氯甲烷=1:10萃取，无水硫酸钠干 燥，减压旋干溶剂得粗产品用硅胶柱进行洗脱分离，可得到化合物Lyso-1，Lyso-1结构式 如下：2) 将300mg化合物Lyso-1溶于10ml无水乙醇中，加入2ml水合肼，氮气保护，100°C加 热回流，反应30min，用TCL板检测反应，反应完全后，将反应液冷却至室温，旋干，并用娃 胶柱进行洗脱分离，可以得到化合物Lyso-2,结构式如下：3)将150mg化合物Lyso-2溶于5ml氯仿中，在0°C加入15 ML三乙胺和64mg氯乙酰 氯，逐渐升至室温，在室温下搅拌24 h，用TCL板检测反应，反应完全后，加入lmL水淬灭反 应，用50 mL乙酸乙酯稀释反应，用水20 mL*2洗涤后用20 mL*l的饱和食盐水洗涤，无水 硫酸钠干燥，减压旋干溶剂得粗产品，并用硅胶柱进行洗脱分离，可以得到化合物Lyso-3， 结构式如下：4)将lOOmg化合物Lyso-3溶于5mlDMF后，加入34mg碳酸钾和41mg碘化钾，室温下 搅拌30min，然后逐滴加入43mg吗啉，在室温下搅拌过夜，用TCL板检测反应，反应完全后， 加入lmL水淬灭反应，用50mL二氯甲烧稀释反应，用水20mL*2洗涤后用20mL*l的饱和 食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂得粗产品，并用硅胶柱进行洗脱分离，可以得 到目标探针化合物。3. 根据权利要求2所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中硅胶柱洗 脱剂配比为甲醇：二氯甲烷=1:30。4. 根据权利要求2所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中硅胶柱洗 脱剂配比为乙酸乙酯：石油醚=1:1。5. 根据权利要求2所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中硅胶柱洗 脱剂配比为甲醇：二氯甲烷=1:30。6. 根据权利要求1所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中硅胶柱洗 脱剂配比为甲醇：二氯甲烷=1:30。7. -种权利要求1所述的荧光探针的应用，其特征在于，该探针用于水环境中和生物 细胞体系中次氯酸的含量传感检测；所述的传感检测包含荧光检测，目视定性检测，细胞成 像检测。
【专利摘要】本发明公开了一种溶酶体靶向次氯酸分子荧光探针及其制备方法和应用，属于分析化学技术领域。该荧光探针分子式为：C37H35N5O5S，具有示（Ⅰ）所示结构：？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？。该探针的合成包括四个步骤，且后处理过程相对简单；实现了次氯酸分子探针的选择性快速检测，并且选择性好，抗其他分子干扰能力强。此外，用肉眼就可以观察到溶液颜色的变化，伴随着紫外灯下同样可以观察到荧光颜色变化，是一种具有生色传感功能的荧光探针。此探针可以应用于检测生物体系中细胞内溶酶体中的次氯酸的检测，作为细胞内溶酶体内次氯酸检测探针。本发明是一种简单，快速，灵敏的次氯酸分子特异性检测试剂，在生物分子检测领域具有广阔的应用前景。
【IPC分类】G01N21/64, C07D491/107, C09K11/06
【公开号】CN105086998
【申请号】CN201510565576
【发明人】林伟英, 任明光, 邓贝贝, 周凯, 王建勇, 刘展榕
【申请人】济南大学
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年9月8日