一种α-淀粉酶AmyASS及其在生淀粉降解中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种α-淀粉酶，该酶的基因序列如SEQ?ID?NO:2所示；该基因序列编码的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示；该基因序列SEQ?ID?NO:2能够在大肠杆菌中成功的表达出包涵体形式的α-淀粉酶。通过本发明包涵体复性方法获得的α-淀粉酶，蛋白纯度达到85%以上，复性率达到50%以上；本发明α-淀粉酶可用于快速降解生淀粉，尤其适用于降解大米生淀粉。
【专利说明】—种Ct -淀粉酶AmyASS及其在生淀粉降解中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体地说是一种海洋细菌来源的α -淀粉酶AmyASS的包涵体形式的重组表达、包涵体复性获取具有催化活性的α -淀粉酶及其在大米生淀粉降解中的应用。
【背景技术】
[0002]α-淀粉酶是一种在α-1,4糖苷键上切断糖链，降解淀粉的酶。α -淀粉酶在各个工业领域如酿造、纤维、制药、洗涤剂和食品工业有着广泛的应用。天然的生淀粉颗粒具有复杂致密的结构。葡萄糖分子通过糖苷键形成长链，长链折叠成结晶和无定型两种结构，然后这两种结构交织形成天然的生淀粉颗粒。因此，天然的生淀粉颗粒不能被普通的淀粉降解酶直接降解。传统的淀粉降解都需要包括淀粉糊化和淀粉酶解两步。只有先利用高温糊化破坏生淀粉颗粒的结构，促使生淀粉的结晶结构打开，也就是生淀粉变为熟淀粉，淀粉长链才能被淀粉降解酶有效切断。淀粉糊化是一个非常耗能的过程，因此，如果采用一种特殊的能直接降解生淀粉的淀粉酶对淀粉进行降解，省去淀粉糊化环节，可以极大的节约能耗，降低生产成本，还能将传统工艺合二为一，缩短处理时间。约10%的α-淀粉酶具有这种独特的生淀粉降解活性，它们绝大多数来自陆地生物。这些目前为止只有三个来自海洋细菌的α -淀粉酶被报道具有生淀粉降解活性，分别为来自Bacillus sp.ALSHL3和B.aquimaris MKSC6.2以及来自海洋宏基因组文库的属于最新建立的糖苷水解酶亚家族GHl3 — 37 的 α -淀粉酶(AmyP)。
[0003]尽管已经发现了不少具有生淀粉降解能力的α-淀粉酶，但是这些α-淀粉酶都主要是对生小麦淀粉和生玉米淀粉具有良好的降解能力。大米是我们东南亚国家的主要粮食作物，大米淀粉在食品、化工和医药等行业具有广泛的应用价值。但是大米淀粉的降解研究和实际应用远没有小麦淀粉和玉米淀粉深入。一个重要的原因是具有生大米淀粉降解能力的α-淀粉酶比较少见。目前文献报道中，一共仅有10个α-淀粉酶能够直接降解天然的大米生淀粉。但是这些酶的降解效率低，而且需要24小时以上的长时间反应。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种能够优势降解大米生淀粉的α -淀粉酶，以弥补现有技术存在的不足之处。
[0005]本发明提供了编码所述α -淀粉酶的基因序列，序列为SEQ ID NO: 2 ;该基因序列编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。该氨基酸序列仅比NCBI中序列号ΥΡ_001143410的氨基酸序列少了 N端26个氨基酸，相似性为98.8% ;但是基因序列SEQ ID NO:2与NCBI中序列号ΥΡ_001143410的氨基酸序列对应的基因序列相似性仅为64.5%。该基因序列SEQ IDNO:2能够在大肠杆菌中成功的表达出包涵体形式的α -淀粉酶。
[0006]本发明提供了表达上述α-淀粉酶包涵体的重组质粒，是将基因序列为SEQ IDNO: 2的核苷酸片段插入到表达载体pColdIII中。[0007]本发明提供了携带表达上述α -淀粉酶包涵体的重组菌。
[0008]本发明提供了上述重组菌表达出α-淀粉酶包涵体的诱导表达条件。
[0009]本发明提供了上述α -淀粉酶包涵体复性方法。使无生物活性的α -淀粉酶包涵体转变为具有催化活性的α-淀粉酶，即以可溶性淀粉为底物时能检测到酶活。包括包涵体的洗涤液，溶解液和透析液的组成，以及整个复性过程中的温度和复性前α -淀粉酶的浓度。
[0010]复性方法:
[0011]I)将α-淀粉酶包涵体用洗涤液洗涤1-2次，去离子水洗涤I次，所述洗涤液组成为 ρΗ8.0 的终浓度 50mM Tris-HCl buffer、终浓度 5mM EDTA，和终浓度 1% (v/v)TritonX-100 ；
[0012]2)将经步骤I)洗漆后的α -淀粉酶包涵体用溶解液溶解,使包涵体溶解后的蛋白浓度为280-320 μ g/ml，所述溶解液的组成为终浓度6M GdmCl, pH6.0的终浓度IOOmMTris-HCl buffer,终浓度 IOOmM NaCl,终浓度 IOOmM dithiothreitol 和终浓度 ImM EDTA ；然后在4°C条件下放置24小时，其间每隔3小时震荡一次，以促进包涵体的溶解；溶解后，12000r/min离心20分钟，去除少量依旧无法溶解的包涵体沉淀，取上清液；
[0013]3) 将步骤2)所获得的上清液装入透析袋，进行透析复性；透析采用4种不同的透析液，每隔12小时更换一种透析液，整个透析过程在4°C进行；第一次使用的透析液组成为pH8.0的终浓度50mM Tris-HCl buffer，终浓度10%(v/v)甘油、终浓度50mM NaCl、终浓度0.5mM EDTA和终浓度4M GdmCl ;第二次使用的透析液组成为pH8.0的终浓度50mM Tris-HCl buffer、终浓度 10%(v/v)甘油、终浓度 50mM NaCl、终浓度 0.5mM EDTA 和终浓度2M GdmCl ;第三次使用的透析液组成为pH8.0的终浓度50mM Tris-HCl buffer、终浓度10%(v/v)甘油、终浓度50mM NaCl、终浓度0.5mM EDTA、终浓度IM GdmCl、终浓度2%L-arginine、终浓度ImM GSSG和终浓度5mM GSH ;第四次使用的透析液组成为pH8.0的终浓度50mM Tris-HCl buffer、终浓度 10%(v/v)甘油、终浓度50mM NaCl、终浓度0.5mM EDTA、终浓度2%L-arginine、终浓度ImM GSSG和终浓度5mM GSH ;透析结束后，将透析袋中的蛋白液体取出，12000r/min、4°C离心20分钟,去除少量依旧无法复性的包涵体沉淀,取上清即为恢复了催化活性的α-淀粉酶。
[0014]本发明上述α -淀粉酶可用于降解各种生淀粉，如生大米淀粉、生小麦淀粉、生玉米淀粉、生土豆淀粉、生豌豆淀粉和生绿豆淀粉，在降解生大米淀粉时，其活性高于其他种类生淀粉活性的一倍以上。
[0015]本发明α-淀粉酶降解生淀粉时:降解生淀粉反应体系的pH值为4.5-9.5，最适pH为6.0 ;生淀粉的浓度为12-25%，最适浓度为12% ;反应温度为10_70°C，最适温度为40°C;反应时间为6小时。当反应体系中含有终浓度5mM的CaCl2时，底物为大米生淀粉时，其酶活显著提高为230%。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1表示了本发明的α -淀粉酶的pColdll1-AmyASS质粒图谱
[0017]图2表示了本发明的α-淀粉酶的反应pH曲线
[0018]图3表示了本发明的α-淀粉酶的反应温度曲线[0019]图4表示了本发明的α -淀粉酶的40°C时的温度稳定性曲线
[0020]图5表示了本发明的α -淀粉酶对各种生淀粉的降解活性比较图
[0021]图6表示了本发明的α -淀粉酶对不同浓度的生大米淀粉的降解活性比较图
[0022]图7表示了本发明的α-淀粉酶降解12%生大米淀粉的时间曲线
[0023]图8表示了本发明的α -淀粉酶在不同浓度的CaCl2时降解12%生大米淀粉的活性比较图
【具体实施方式】
[0024]以下实施例中所使用的化学试剂均为现有公知试剂，化学试剂缩写表如下:EDTA(乙二胺四乙酸二钠盐)；Triton X-100 (聚乙二醇辛基苯基醚)GdmCl (盐酸胍)；NaCl (氯化钠)；dithiothreitol (DTT, 二硫苏糖醇)L - arginine (L-精氨酸)；GSSG (氧化型谷胱甘肽)；GSH (还原型谷胱甘肽)。
[0025]实施例1
[0026]α -淀粉酶AmyASS的基因合成
[0027]根据NCBI中公布的海洋鱼类的病原菌杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(Aeromonassalmonicida ssp.salmonicida)的全基因组信息，找到一个“假定糖苷水解酶家族蛋白”(氨基酸序列号YP_001143410)。该AmyASS蛋白的氨基酸与已经实验鉴定的α -淀粉酶AmyP(Liu et al.2012)相似性为50%，被推测为一个α -淀粉酶。将AmyASS蛋白N端的预测为信号肽的26个氨基酸去除，并根据大肠杆菌的`密码子偏好性重新设计了基因序列。该基因序列与“假定糖苷水解酶家族蛋白”在NCBI中公布的基因序列(基因序列号NC_009348.1)相似性仅为64.5%。在该基因两端加NdeI和XhoI限制酶切位点。将该基因的文本序列送至生物公司(上海生工生物科技有限公司)合成。合成的AmyASS基因序列克隆在载体pUC57上，插入位点为T-A克隆，受体菌为大肠杆菌DH5a菌株。其中本发明的α-淀粉酶AmyASS的核苷酸序列为SEQ ID NO:2，氨基酸序列为SEQ ID N0:1。
[0028]实施例2
[0029]a -淀粉酶AmyASS包涵体的重组表达
[0030]将包含a -淀粉酶AmyASS基因的pUC57载体和冷激休克表达载体pCold III分别进行了 NdeI和XhoI位点的双酶切后，将AmyASS基因连接到pCold親体上，获得重组表达质粒pColdll1-AmyASS,如图1所示。将质粒pColdlll-AmyASS转入大肠杆菌BL21细胞,在含有50ug/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，200r/min，37°C培养。当大肠杆菌培养液的0D600达到0.5左右时，将培养液急骤降温至16°C，并加入ImM IPTG，然后在16°C、120rpm过夜培养。在该培养过程中将产生包涵体形式的α-淀粉酶AmyASS。8000r/min离心5分钟收集16°C过夜培养的大肠杆菌细胞，将大肠杆菌重悬于50mM Tris-HCl buffer(pH8.0),超声破碎，直至浑浊的大肠杆菌细胞悬液变为清亮的液体。3000r/min离心5分钟，取上清弃沉淀。上清液体在12000r/min离心20分钟，获得的沉淀即为a -淀粉酶AmyASS包涵体。
[0031]尝试过各种优化重组表达的方法，均无法实现该a -淀粉酶AmyASS的基因序列在大肠杆菌中表达为具有催化活性的可溶性蛋白。该基因序列只能表达为无催化活性的包涵体。另外，“假定糖苷水解酶家族蛋白”在NCBI中公布的基因序列(基因序列号NC_009348.1)克隆到表达载体pET20b和pColdIII中，均无法在大肠杆菌中表达出任何蛋白。
[0032]实施例3
[0033]α -淀粉酶AmyASS包涵体的复性
[0034]包涵体复性是指在将无生物活性的包涵体形式的蛋白转化成有生物活性的蛋白。将 α -淀粉酶AmyASS包涵体用洗涤液(50mM Tris-HCl buffer,pH8.0,5mM EDTA, l%TritonX-100)洗涤2次,去离子水洗涤I次,用溶解液溶解包涵体,要求包涵体溶解后的蛋白浓度约为300 μ g/ml，根据此蛋白浓度要求，加入一定量的溶解液。溶解液的成分为6M GdmCl,IOOmM Tris-HCl buffer, pH6.0, pH6.0,IOOmM NaCl,IOOmM dithiothreitol,ImM EDTA。然后在4°C条件下放置24小时，其间每隔3小时震荡一次，以促进包涵体的溶解。溶解后，12000r/min离心20分钟，去除少量依旧无法溶解的包涵体沉淀，取上清，装入透析袋，进行透析复性。一共采用了 4种不同的透析液，每隔12小时更换一种透析液，整个透析过程在4°C进行。第一次使用的透析液成分为50mM Tris-HCl buffer (pH8.0)、10%(v/v)甘油、50mM NaCl、0.5mM EDTA 和 4M GdmCl ;第二次使用的透析液成分为 50mM Tris-HCl buffer(pH8.0),10%(v/v)甘油、50mM NaCl、0.5mM EDTA 和 2M GdmCl ;第三次使用的透析液成分为 50mM Tris-HCl buffer (pH8.0),10%(v/v)甘油、50mM NaCl、0.5mM EDTAUM GdmCl、2%L-arginine、lmM GSSG 和 5mM GSH ;第四次使用的透析液成分为 50mM Tris-HCl buffer(pH8.0),10%(v/v)甘油、50mM NaCl、0.5mM EDTA、2%L_arginine、ImM GSSG 和 5mM GSH。透析结束后，将透析袋中的蛋白液体取出，12000r/min、4°C离心20分钟，去除少量依旧无法复性的包涵体沉淀，取上清即为恢复了催化活性的α -淀粉酶AmyASS。
[0035] 采用上述方法获得的α -淀粉酶AmyASS，蛋白纯度达到至少85%以上，复性率达到至少50%以上。
[0036]实施例4
[0037]α -淀粉酶的活性测定
[0038]α-淀粉酶的活性采用3，5_ 二硝基水杨酸(DNS)法测定。该方法是检测淀粉水解后释放出的还原糖量，标准曲线以还原糖葡萄糖为标准测定。一个标准反应体系包括40 μ I酶液和560 μ I的1%可溶性淀粉或生淀粉(生淀粉浓度依据不同情况设置)。淀粉均配置在IOOmM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(ρΗ6.0)中。酶与淀粉在40°C反应10分钟，立即加入300 μ IDNS溶液，置于预冷的0.3Μ Na2CO3溶液中5分钟。当底物为可溶性淀粉时，直接在沸水中煮15分钟，然后在A540nm测定吸光值。当底物为生淀粉时，需要先4°C 12000r/min离心5分钟，取上清在沸水中煮15分钟，然后在A540nm测定吸光值。一个标准酶活单位(U)定义为每分钟释放出I μ mol还原糖所需的酶量。以1%可溶性淀粉为底物时，酶的比活为45U/mg ;以12%生大米淀粉为底物时，酶的比活为30U/mg。
[0039]实施例5
[0040]α -淀粉酶AmyASS对各种生淀粉的降解活性比较
[0041]将生大米淀粉、生小麦淀粉、生玉米淀粉、生土豆淀粉、生豌豆淀粉和生绿豆淀粉配置在IOOmM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(ρΗ6.0)中，浓度为4%。根据实施例4描述的方法测定酶活，结果如图6所示。α -淀粉酶AmyASS可以降解生大米淀粉、生小麦淀粉和生绿豆淀粉，不能降解生玉米淀粉、生土豆淀粉和生豌豆淀粉。α -淀粉酶AmyASS对生大米淀粉的活性最高，至少是生小麦淀粉的5倍和生绿豆淀粉的2.5倍。[0042]实施例6
[0043]α -淀粉酶AmyASS对生大米淀粉的降解
[0044](I)作用pH范围和最适作用pH
[0045]将可溶性淀粉分别用不同pH的缓冲液配置，浓度为PkpM.0-6.0采用的是IOOmM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液；pH7.0-8.0采用的是IOOmM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液；pH9.0-10.0采用的是IOOmM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。在40°C根据实施例4描述的方法测定酶活，结果如图2所示。α -淀粉酶AmyASS在ρΗ4.5-9.5起作用，最适作用pH为6.0。
[0046](2)作用温度范围和最佳作用温度
[0047]根据实施例4描述的方法，在10_70°C分别测定α -淀粉酶AmyASS的活性，结果如图3所示。α-淀粉酶AmyASS在10-70°C范围内均起作用，最适作用温度为40°C。
[0048](3)温度稳定性
[0049]将α -淀粉酶AmyASS加入IOOmM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(ρΗ6.0)中，在40°C孵育24小时，在此期间，每隔一定时间取出40 μ I酶液，根据实施例4描述的方法测定酶活，结果如图4所示。α -淀粉酶AmyASS在40°C非常稳定，24小时孵育后它表现出不低于70%的剩余酶活。
[0050](4)大米生淀粉的浓度
[0051]将大米生淀粉配置在IOOmM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH6.0)中，浓度分别为4、
8、12、16和20%，根据实施例4描述的方法测定酶活，结果如图6所示。在较低的大米生淀粉浓度时，α -淀粉酶AmyASS的活性`随着大米生淀粉浓度的增加而增加，最佳降解浓度为12%。大米生淀粉浓度超过12%后，α-淀粉酶AmyASS的活性出现下降，表现出高底物浓度的抑制效应。α -淀粉酶AmyASS能降解的最高大米生淀粉浓度为25%。
[0052](5)反应时间
[0053]将大米生淀粉配置在8ml IOOmM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH6.0)中，浓度为12%，加入0.2%甲苯防止微生物污染，加入600 μ I酶液，在40°C反应8小时，在此期间，每隔一定时间取出600 μ I反应液，立即加入300 μ I DNS溶液，根据实施例4描述的方法测定酶活，结果如图7所示。在反应的初始阶段，降解大米生淀粉产生的还原糖量随着时间急剧增加；30分钟后，还原糖量的增加速度明显减缓；6小时后，还原糖量维持不变。这表明，α-淀粉酶AmyASS在6小时内完成对生大米淀粉的水解。
[0054](6)添加 CaCl2
[0055]将大米生淀粉配置在IOOmM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(ρΗ6.0)中，浓度为12%，在反应体系中分别添加0、3、5、8、10mM CaCl2，根据实施例4描述的方法测定酶活，结果如图8所示。CaCl2的存在可以显著提高α-淀粉酶AmyASS降解大米生淀粉的活性，CaCl2的最佳添加浓度为5mM，α -淀粉酶AmyASS的活性至少提高为无添加时的2.3倍。
[0056](7)作用
[0057]用IOOmM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(ρΗ6.0)配置12%的大米生淀粉溶液，加入0.2%甲苯防止微生物污染，加入酶液，在40°C反应6小时。8000r/min离心5分钟，取上清即为大米生淀粉的水解产物。水解产物的分析采用薄层层析法进行。展层体系为体积比3:1:1的异丙醇:乙酸乙酯:H20。层析结束后，均匀喷上苯胺-二苯胺磷酸，在85°C烤板10分钟。结果表明α -淀粉酶AmyASS水解大米生淀粉的产物为葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖。
【权利要求】
1.一种α-淀粉酶，其特征在于，所述淀粉酶的基因序列如SEQ ID Ν0:2所示。
2.编码权利要求1所述α-淀粉酶基因序列的氨基酸，其特征在于，所述氨基酸序列如SEQ ID NO:1 所示。
3.一种用于表达α-淀粉酶的重组表达质粒，该质粒至少包括权利要求1所述的基因。
4.根据权利要求3所述重组质粒，其特征是该重组质粒的载体为pColdIII。
5.一种产生α-淀粉酶包涵体的重组菌，该重组菌内导入了权利要求2所述的基因。
6.根据权利要求5所述重组菌，其特征是该重组菌为大肠杆菌BL21菌株。
7.一种α-淀粉酶包涵体的复性方法，其特征是将权利要求5中获得的α-淀粉酶包涵体按如下步骤进行: 1)将α-淀粉酶包涵体用洗涤液洗涤1-2次，去离子水洗涤I次，所述洗涤液组成为 ρΗ8.0 的终浓度 50mM Tris-HCl buffer、终浓度 5mM EDTA，和终浓度 1% (v/v) TritonX-1OO ； 2)将经步骤I)洗涤后的α-淀粉酶包涵体用溶解液溶解，使包涵体溶解后的蛋白浓度为280-320 μ g/ml，所述溶解液的组成为终浓度6M GdmCl，pH6.0的终浓度IOOmM Tris-HClbuffer,终浓度 IOOmM NaCl,终浓度 IOOmM dithiothreitol 和终浓度 ImM EDTA ;然后在4°C条件下放置24小时，其间每隔3小时震荡一次，以促进包涵体的溶解；溶解后，12000r/min离心20分钟，去除少量依旧无法溶解的包涵体沉淀，取上清液； 3)将步骤2)所获得的上清液装入透析袋，进行透析复性；透析采用4种不同的透析液，每隔12小时更换一种透析液，整个透析过程在4°C进行；第一次使用的透析液组成为pH8.0的终浓度50mM Tris-HCl buffer，终浓度10%(v/v)甘油、终浓度50mM NaCl、终浓度0.5mMEDTA和终浓度4M GdmCl ;第二次使用的透析液组成为pH8.0的终浓度50mM Tris-HClbuffer、终浓度10%(v/v)甘油、终浓度50mM NaCl、终浓度0.5mM EDTA和终浓度2M GdmCl ；第三次使用的透析液组成为PH8.0的终浓度50mM Tris-HCl buffer、终浓度10%(v/v)甘油、终浓度50mM NaCl、终浓度0.5mM EDTA、终浓度IM GdmCl、终浓度2%L_arginine、终浓度ImM GSSG和终浓度5mM GSH ;第四次使用的透析液组成为pH8.0的终浓度50mMTris-HCl buffer、终浓度 10%(v/v)甘油、终浓度 50mM NaCl、终浓度 0.5mM EDTA、终浓度2%L-arginine、终浓度ImM GSSG和终浓度5mM GSH ;透析结束后，将透析袋中的蛋白液体取出，12000r/min、4°C离心20分钟，去除少量依旧无法复性的包涵体沉淀，取上清即为恢复了催化活性的α-淀粉酶。
8.根据权利要求1所述的α-淀粉酶或根据权利要求7所述的具有催化活性的α-淀粉酶在生淀粉降解中的应用。
9.根据权利要求8所获得的具有催化活性的α-淀粉酶在生淀粉降解中的应用，其特征是，所述生淀粉包括生大米淀粉、生小麦淀粉和生绿豆淀粉。
10.根据权利要求7所获得的具有催化活性的α-淀粉酶降解生淀粉的方法，其特征是:降解生淀粉反应体系的pH值为4.5-9.5 ;生淀粉的浓度为12-25% ;反应温度为10-700C ;反应时间不超过6小时；反应体系中含有终浓度5mM的CaCl2。
【文档编号】C12N9/28GK103710325SQ201410005765
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2014年1月6日 优先权日:2014年1月6日
【发明者】彭惠, 王敏, 陈茂娇, 郑昀昀, 高毅 申请人:安徽大学