专利名称：一种人体唾液保存用组合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种唾液样本保存液，具体涉及一种人体唾液保存用组合物及其制备方法，适用于遗传分析与检测、医学检验等领域。
背景技术：
基于核酸扩增的分子技术已日益用于法医、军事、人类医药以及科学研究等方面。如在法医鉴定方面，通过提取家属的DNA以进行核酸扩增可对死者的身份进行辨认；在人类健康方面，通过对检测者的血液、其他体液或细胞中的DNA进行检测，并进行核酸扩增，收集其相关基因信息后，分析其所含有的各种基因情况，使人们了解自己的基因信息，预知身体患病的风险，从而通过改善自己的生活环境，养成良好生活习惯等方式，避免或延缓疾病的发生。一般用于提取基因组DNA的体液通常来自静脉血液中的白细胞，但使用血液作为检测来源具有很多缺点。首先，血液的采集需要经过训练的专业人员操作，其次，血液采集是侵入性方式，经常给供试者带来一定程度的不适和疼痛，此外，血液采集过程还需要避免一些血源性病原体造成的感染。而与其相比，唾液作为一种人体较易获得的体液，采集更为方便。唾液是主要由唾液腺分泌的透明无色液体。人体的唾液99%是水，有机物主要是唾液淀粉酶、粘多糖、粘蛋白及溶菌酶等，无机物有钠、钾、钙、氯等离子。纯净的唾液并不含有人体DNA，而由于口腔上皮细胞处于不断地新陈代谢与新老更替过程中，每时每刻都存在细胞脱落，因此，通过采集唾液可以得到细胞DNA。唾液的采集相比于血液，具体有如下明显的优势1，无刺痛，无伤害取样，避免了采血对供试者造成不必要的痛苦；2，廉价高效，采集人员不需要经过专业训练，也节省了注射器和抗凝管等耗材的费用；3，操作简便，唾液收集只需要供试者将唾液收集于唾液采集器即可；4，适用范围广，一些人群不适合采血，例如老人和小孩等，另外一些人群则抗拒采血，如晕血和精神疾病的患者。5，运输方便，若要大范围，长距离的采集运输样本，唾液显然更适合在实验室与各个收集地之间传递。但是，一旦采集后，样本必须迅速进行DNA抽提，否则口腔内的微生物容易对DNA进行降解。因此，如将唾液能够较好地保存起来，对于唾液作为基因组DNA的来源应用于基因检测中将具有至关重要的作用。专利申请号201010299215，名称为人体唾液保存固定液及其制备和应用的专利公开了一种唾液保存液，但其中涉及的MgCl2组分属于核酸酶的激活剂，不利于DNA的稳定性保存。而异硫氰酸胍虽属于变性裂解试剂，可以抑制核酸酶的活性，但会破坏细胞，使DNA处于游离状态，容易造成DNA的断裂损伤。而用于基因检测的DNA首先应保证纯度和完整性，如果DNA发生断裂等损伤，则势必会直接影响到PCR等后续试验，进而影响分析结果的准确性；另外唾液保存液作为唾液DNA的保存介质，也存在被氧化和微生物污染的风险。微生物会将DNA作为其营养材料，更甚者，这些微生物还可能分泌出促进DNA加速降解的酶，破坏DNA的完整性，同时唾液被微生物污染后，也很容易导致由此提取的DNA不纯，而最终导致DNA的完整性和纯度不能得到保证，进而导致后续试验的可信度大大降低。综上，唾液中所含的DNA量较少，很容易受到破坏。研究开发一种保存效果好、保存方便的人体唾液样本保存用保存液具有十分重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种人体唾液保存用组合物及其制备方法。为实现上述技术问题，本发明采取的技术方案为
一种人体唾液保存用组合物，其组分和含量如下pH为6-8. 5的Tris-HCl 5-20mmol/L ；EDTA O. 5-2mmol/L ；NaOAc 2. 5-3. 5mol/L ;蔗糖 0. 1-0. 4mol/L ；N-乙酰基 ~5~ 甲氧 基色胺l-3mmol/L ;对轻基苯甲酸丙酯l_4mg/mL ;重氮烧基咪唑脲l_3mg/mL ;蛋白酶ΚΙΟμ g/mL,体系 pH 7. 5-8. 5。上述人体唾液保存用组合物的制备方法，具体包括以下步骤
(1)分别配制EDTA、PH为6-8.5的Tris-HCl缓冲液、蔗糖的储存水溶液和N-乙酰基-5-甲氧基色胺的无水乙醇储存液，121°C灭菌30min后，室温保存；
(2)在无菌条件下，根据预配制的人体唾液保存用组合物的总体积，结合体系中各组分的含量要求，选用相应体积的EDTA、PH6-8. 5的Tris-HCl缓冲液、蔗糖的储存水溶液和N-乙酰基-5-甲氧基色胺的无水乙醇储存液混合，并加入相应量的NaOAc、对羟基苯甲酸丙酯、重氮烷基咪唑脲和蛋白酶K后，补加无菌水至所预设定配制的人体唾液保存用组合物的总体积，得到体系PH满足要求的人体唾液保存用组合物。按上述方案，步骤(2 )中的体系pH值在需要时可通过加入调节剂进行调节。其中调节剂的加入量很少，对体系中各组分浓度的影响可忽略不计。本发明人体唾液保存用组合物的具体使用过程为将该用于保存人体唾液样本的组合物与人体唾液I: I混合后，于设定温度保存，优选为4°c。本发明中提供的人体唾液保存用组合物中引入的EDTA组分可以螯合唾液中自身含有的Mg、Ga等二价阳离子，抑制核酸酶的活性，保证DNA不被降解；引入的蛋白酶K可以有效降解蛋白质，消化核酸酶，进一步避免核酸酶解；引入的醋酸钠可以沉淀部分裂解细胞释放出的DNA，防止悬浮断裂，同时可以提供保证DNA稳定的弱碱性环境；更主要地是其引入的N-乙酰基-5-甲氧基色胺作为迄今发现的最强的内源性自由基清除剂，很容易进入细胞而担任起保护细胞核DNA、防止其抗氧化而发生断裂的任务，且其作用温和，用量少，效果好；另外，同时引入的对羟基苯甲酸丙酯，相比于其他酸性防腐剂，特别适宜于在该人体唾液保存用组合物构成的弱碱性保护环境(PH7. 5-8. 5)中发挥作用，而达到较好地抑制微生物细胞的呼吸酶系与电子传递酶系的活性以及破坏微生物的细胞膜结构，使其细胞内的蛋白质变性，以此抑制微生物菌落的生长，同时也不会破坏DNA，而便于唾液样本的保存，且将其与重氮烷基咪唑脲复配使用，能构成极其良好的广谱抗菌体系，有效抑菌杀菌，更好地防止微生物的污染，除此在该组合物中引入蔗糖，还可以起到增加体系粘度，维持适当的渗透压达到防止DNA受机械力损伤的作用。综上，本发明通过引入上述特定组分，按设定配比配合使用，达到了使人体唾液样本中的DNA即不会被体系内固有酶如核酸酶等或受外界污染后的微生物分泌产生的酶进行酶解，或氧化而导致DNA链不完整，甚至被污染而导致的DNA纯度差的问题，同时也能维持唾液样本处于适宜的条件包括pH，体系粘度等而使唾液样本DNA能稳定存在，达到较好保存唾液样本的目的。本发明的有益效果
本发明的人体唾液保存用组合物用于保存人体唾液样本，可以抑制核酸酶活性，并避免其受到外界微生物的污染或自身氧化，而保证基因组DNA的完整性和纯度，保存时间长，适用保存温度广，能够保证唾液样本在各采集地之间运输过程中的稳定性，适用于基因检测及相关科学研究。相关唾液保存及基因组DNA抽提检测试验表明，本发明的人体唾液保存用组合物在室温条件下可以稳定保存唾液样本4个月以上；在高温(40°C)条件下，可以稳定保存唾液样本7d以上；且在有温差条件上，也可以稳定保存唾液样本7d以上。
图I为从用实施例I制备的人体唾液保存用组合物于室温保存不同时间后的唾液样本中抽提的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图，图中
M λDNA/HindIII Marker
1:室温放置7d
2:室温放置14d
3:室温放置I个月
4:室温放置2个月
5:室温放置3个月 6:室温放置4个月；
图2为从用实施例I制备的人体唾液保存用组合物于不同温度条件下保存7d后的唾液样本中抽提的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图，图中
MλDNA/HindIII Marker
1:4°C放置 7d，
2:温变条件下放置7d
3:40°C放置 7d ；
图3为从用实施例I制备的人体唾液保存用组合物于室温保存4个月，_20°C，存在温变条件下和40°C保存7d后的唾液样本中抽提的基因组DNA为模板，PCR扩增β -actin基因片段的琼脂糖凝胶电泳图，图中
MDL2000 Marker
1:室温放置4个月
2:-20 O 放置 7d
3:有温变条件下放置7d
4:40°C放置 7d ；
图4为从用实施例I制备的人体唾液保存用组合物于室温保存4个月，存在温变条件下和保存7d后的唾液样本中抽提的基因组DNA为模板，PCR扩增16Sr DNA片段的琼脂糖凝胶电泳图，并相应以PCR扩增β-actin基因片段作为对照，图中
I:室温放置4个月，扩增16Sr DNA片段2:温变条件下放置7d，扩增16Sr DNA片段 M DL2000 Marker
3:室温放置4个月，扩增β -actin基因片段
4:温变条件下放置7d，扩增β -actin基因片段；
图5为从用实施例1-3制备的人体唾液保存用组合物于？保存？后的唾液样本中抽提的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图，图中
M λDNA/HindIII Marker
1:实施例I制备的人体唾液保存用组合物保存的唾液样品； 2:实施例2制备的人体唾液保存用组合物保存的唾液样品；
3:实施例3制备的人体唾液保存用组合物保存的唾液样品。
具体实施例方式以下列举的具体实施例，仅为进一步阐述本发明，并非用于限制本发明的实施方法与应用范围。实施例I
人体唾液保存用组合物，其组分和含量为EDTA lmmol/L ； Tris-HCl (pH为8)10mmol /I,;鹿糖 O. 3mol/L ； NaOAc 3mol/L ； N-乙酸基 _5_ 甲氧基色胺 2mmo1 /I,;对轻基苯甲酸丙酯3mg/mL ;重氮烧基咪唑脲2mg/mL;蛋白酶K 10 μ g/mL,体系pH值8。制备方法如下
(1)分别配制EDTA、TriS-HCl缓冲液(pH为8)、蔗糖的储存水溶液和N-乙酰基-5-甲氧基色胺的无水乙醇储存液，得到lOmmol/L的EDTA水溶液，O. lmol/L的Tris-HCl缓冲液，3mol/L的蔗糖水溶液，20mmol/L的N-乙酰基-5-甲氧基色胺的无水乙醇溶液，121°C灭菌30min后，室温保存；
(2)在无菌条件下，根据各组分终含量，将步骤(I)制得的各组分储存液与无菌水按比例混合
IOmmo I/L 的 EDTA 水溶液 IOml
O.lmol/L 的 Tris-HCl 缓冲液 IOml
3mol/L的鹿糖水溶液IOml
20mmol/L的N-乙酰基-5-甲氧基色胺IOml
配制得到各组分含量符合规定浓度的混合液，最后加入NaOAc 24. 6g，对羟基苯甲酸丙酯0. 3g,重氮烧基咪唑脲0. 2g,蛋白酶K Img,使其终浓度分别为3mol/L, lmg/mL, 2mg/mL和10 μ g/mL,加入无菌水并搅拌使其充分溶解,后补加无菌水至总体积为IOOmL,得人体唾
液保存用组合物，室温放置。上述人体唾液保存用组合物的保存效果试验
在收集唾液样本前30分钟受试者需清洁口腔(建议刷牙)，并保持口腔洁净，清洁口腔后请勿进食、吸烟、嚼口香糖。开始收集唾液之前，放松脸颊，并用手指轻轻按摩脸颊15 30秒以产生唾液。向唾液采集管中轻轻吐入唾液，尽量避免出现过多的泡沫。收集得到2mL唾液即收集管中唾液与上层泡沫之间的分层界面在收集管的2mL刻度线处，然后与2mL实施例I的人体唾液保存用组合物涡旋混合后，根据下述保存条件进行保存，备用。
(I)用人体唾液保存用组合物保存的唾液样本在室温放置不同时间后的稳定性检测
将上述用人体唾液保存用组合物保存的唾液样本分别于室温下放置7天、14天、I个月、2个月、3个月、4个月后，利用“天根”公司的唾液基因组DNA抽提试剂盒抽提得到各唾液样本基因组DNA，分别编号为1-6，备用。琼脂糖凝胶电泳
取上述各唾液样本DNA 3 μ L加样于1%琼脂糖凝胶，用λ DNA/HindIII Marker作标记，电泳。电泳后，用SYBR Green I将琼脂糖凝I父染色后，在285nm透照下，使用凝I父成像系统拍照，具体见图I。浓度和纯度检测 另将上述各唾液样本DNA取2μ L，用NanoDrop Lite检测其浓度和纯度，具体见表I。
表I室温放置不同时间的唾液样本DNA检测
释苯编号 I浓度(ng/yL) |Aa6(1/Aa8(1 ~93~1.92
2~87~1.89
~89~1.94
~95~1.92
~921.90
6~丨88|l. 95
总结
如图I和表I所示，该唾液样本室温放置7天直至4个月，DNA没有发生氧化断链，其DNA均是稳定的，而且基因组DNA完整性良好，没有出现断裂片段。(2)用人体唾液保存用组合物保存的唾液样本在不同温度条件下的稳定性检测 将上述用人体唾液保存用组合物保存的唾液样本分别放置于_20°C、高温(40°C)以及
存在温变条件下(温变温度为_20°C、室温和40°C )保存7天，后利用“天根”公司的唾液基因组DNA抽提试剂盒抽提得到于不同温度下保存的各唾液样品基因组DNA。琼脂糖凝胶电泳和DNA的浓度、纯度检测同上，结果分别见图2和表2。表2-不同温度放置7d的唾液样本DNA检测_
释苯编号 I浓度(ng/yL) |Aa6(1/Aa8(1 ~87~1.92
F921.88
~丨84|l. 89
总结
如图2和表2所示，该唾液样本与在_20°C、高温(40°C )、以及存在温变条件下放置7天后,其DNA均是稳定的。另，将从上述于-20°C、高温(40°C )以及变温条件下及室温下保存7天的唾液样本中抽提得到的各唾液样本DNA做模板，扩增β -actin基因的337bp片段。引物如下
primer-F 5’ -TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3’primer-R 5’ -CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3’
PCR 扩增程序如下95 °C 5min ；94 °C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 40s，循环 35 次；72 °CIOmin ;4°C冷却。
结果见图3。总结
如图3所示，于不同温度及存在温变条件下保存的唾液样本中抽提的DNA均能稳定扩增出明显条带，且与预期片段大小一致，说明该唾液样本于_20°C、高温(40°C )以及存在变温条件下和室温下保存后，从中所抽提的基因组DNA均适用于PCR实验，表明DNA保存完整，没有断裂。(3)用人体唾液保存用组合物保存的唾液样本室温放置4个月，以及在有温变条件下(温变温度为_20°C、室温和40°C)放置7天后的样本中提取的唾液DNA作为模版用于微生物16SrRNA扩增
扩增引物如下 primer-F 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3’primer-R 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’
PCR 扩增程序如下95 °C 5min ；94°C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 2min，循环 35 次；72 °CIOmin ;4°C冷却。具体结果见图4，并以上述同等条件保存的唾液样本中抽提的DNA扩增β-actin基因的片段作为正对照。总结
如图4所示，将用人体唾液保存用组合物保存的唾液样本室温放置4个月，以及在有温变条件下放置7天后的唾液样本中提取的唾液DNA作为模板用于微生物16SrRNA扩增，没有明显条带产生，说明该唾液样本用发明的唾液保存用组合物保存后没有受到微生物的污染，抽提得到的DNA纯度很高，适用于基因检测实验。实施例2
人体唾液保存用组合物，其组分和含量为EDTA O. 5mmol/L ；Tris-HCl (pH为6)5mmol/L ;鹿糖 O. 2mol/L ；NaOAc 2. 5mol/L ;N_ 乙酸基-5-甲氧基色胺 3mmol/L ;对轻基苯甲酸丙酯4mg/mL ;重氮烧基咪唑脲lmg/mL;蛋白酶K 10 μ g/mL,体系pH值7. 5。制备方法如下
(1)分别配制EDTA、Tris-HCl缓冲液(pH为6)、蔗糖的储存水溶液和N-乙酰基-5-甲氧基色胺的无水乙醇储存液，得到lOmmol/L的EDTA水溶液，O. lmol/L的Tris-HCl缓冲液，3mol/L的蔗糖水溶液，20mmol/L的N-乙酰基-5-甲氧基色胺的无水乙醇溶液，121°C灭菌30min后，室温保存；
(2)在无菌条件下，根据预配制的人体唾液保存用组合物的总体积，结合体系中各组分的含量，选用相应体积的EDTA、PH6的Tris-HCl缓冲液、蔗糖的储存水溶液和N-乙酰基-5-甲氧基色胺的无水乙醇储存液混合，并加入相应量的NaOAc、对羟基苯甲酸丙酯、重氮烷基咪唑脲和蛋白酶K后，补加无菌水至近IOOmL,然后加入少量NaOH调节得到总体积IOOmU体系pH为7. 5的人体唾液保存用组合物。实施例3
人体唾液保存用组合物，其组分和含量为EDTA 2mmol/L ；Tris-HCl (pH为8. 5)20mmol/L ;鹿糖 0. 4mol/L ；NaOAc 3 mol/L ;N_ 乙酸基-5-甲氧基色胺 lmmol/L ;对轻基苯甲酸丙酯lmg/mL ;重氮烧基咪唑脲3mg/mL;蛋白酶K 10 μ g/mL,体系pH值8.5。
其配制方法参考实施例I进行。参考实施例1，将采用本实施例2-3制得的人体唾液保存用组合物保存的唾液样本分别于室温保存7天后，利用“天根”公司的唾液基因组DNA抽提试剂盒抽提得到保存后的各唾液样品基因组DNA。琼脂糖凝胶电泳和DNA的浓度、纯度检测同上，结果分别见图5和表3。表3实施例1-3的人体唾液保存用组合物保存的唾液样本DNA的检测
权利要求
1.一种人体唾液保存用组合物，其组分和含量如下pH为6-8. 5的TriS-HCl5-20mmol/L ；EDTA O.5_2mmol/L ；NaOAc 2.5-3. 5mol/L;蔗糖 0.1-0. 4mol/L；N-乙酰基-5-甲氧基色胺l_3mmol/L ;对轻基苯甲酸丙酯l_4mg/mL ;重氮烧基咪唑脲l_3mg/mL ;蛋白酶 K 10 μ g/mL，体系 pH 7. 5-8. 5。
2.根据权利要求I所述的人体唾液保存用组合物的制备方法，其特征在于具体包括以下步骤 Cl)分别配制EDTA、PH 6-8. 5的Tris-HCl缓冲液、蔗糖的储存水溶液和N-乙酰基-5-甲氧基色胺的无水乙醇储存液，121°C灭菌30min后，室温保存； (2)在无菌条件下，根据预配制的人体唾液保存用组合物的总体积，结合体系中各组分的含量要求，选用相应体积的EDTA、PH6-8. 5的Tris-HCl缓冲液、蔗糖的储存水溶液和N-乙酰基-5-甲氧基色胺的无水乙醇储存液混合，并加入相应量的NaOAc、对羟基苯甲酸丙酯、重氮烷基咪唑脲和蛋白酶K后，补加无菌水至所预设定配制的人体唾液保存用组合物的总体积，得到体系PH满足要求的人体唾液保存用组合物。
3.根据权利要求2所述的人体唾液保存用组合物的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中的体系pH值在需要时可通过加入调节剂进行调节。
全文摘要
本发明涉及一种人体唾液保存用组合物及其制备方法。其组分和含量如下pH为6-8.5的Tris-HCl5-20mmol/L；EDTA0.5-2mmol/L；NaOAc2.5-3.5mol/L；蔗糖0.1-0.4mol/L；N-乙酰基-5-甲氧基色胺1-3mmol/L；对羟基苯甲酸丙酯1-4mg/mL；重氮烷基咪唑脲1-3mg/mL；蛋白酶K10μg/mL，体系pH7.5-8.5。其用于保存人体唾液样本可抑制核酸酶活性，并避免其受到外界微生物的污染或自身氧化，而保证基因组DNA完整性和纯度，保存时间长，适用保存温度广，适用于基因检测及相关科学研究。
文档编号A01N1/02GK102919218SQ201210473690
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月21日 优先权日2012年11月21日
发明者徐谋胜, 王宁, 王珊, 袁雅燕 申请人:湖北维达健基因技术有限公司