专利名称：淀粉生物合成酶的热稳定突变体的制作方法
淀粉生物合成酶的热稳定突变体
本申请是中国专利申请03805735.2的分案申请，原申请的申请曰是 2003年2月18日，发明名称是"淀粉生物合成酶的热稳定突变体"。
本发明是在国家科学基金项目号9316887的政府支持下进行的。政府 在本发明中享有一定权利。
相关申请的交叉参考
本申请是1999年5月14日提交的共同待决的美国申请号09/312,433 的部分继续申请，而美国申请号09/312,433是1997年11月18日提交的 共同待决的美国申请号08/972,545，现美闺专利号6,069,300的部分继 续申请。本申请也要求1998年5月14日提交的美国临时申请号60,085,460 和1996年11月18日提交的美国临时申请号:60/031，045的优先权。
背景技术：
植物生命的固着特性使其持续暴露于环境因素，所述环境因素对植物 的生长和发育产生积极和消极作用。现代农业面临的一个主要障碍就是不 利的环境条件。引起重大作物损失的一个重要因素是热胁迫。温度胁迫使 许多谷类作物如玉米、小麦和大麦的粮食产量大大减少。由于热胁迫造成 的产量下降在世界重要谷物中占7到35% 。
许多研究已经鉴定了热胁迫的可能生理学后果。Hunter等人的早期工 作(Hunter, R. B" Tollenaar， M.和Breuer， C. M. [1977加拿大植物科学 杂志(Ow. /.尸/"WSd.) 57:1127-1133)利用生长室条件证实温度可减少 玉米籽粒的灌浆持续时间。Tollenaar和Bruulsema (Tollenaar， M.和 Brmilsema， T. W.1988]加拿大植物科学杂志(/ /V"W ) 68:935-940)得到了相似结果，在他们的结果中籽粒灌浆时间受温度升高的不 利影响。Badu-Apraku等人(Badu画Apraku， B，， Hunter, R. B.和Tollenaar， M. [1983]加拿大植物科学杂志(Om./ P/fl/^^/,)63: 357-363)测定出，与 生长在昼/夜温度为25/15。C的玉米相比，生长在35/15。C条件下的玉米植物 的产量显著减少。由于温度升高引起的产量减少也被历史上和气候学上的 研究所支持(Thompson， L. M. [1986JgnVm. /78: 649-653; Thompson, L. M. [1975科学() 188: 535-541; Chang,丄1981JgWcw/. M"er汰24: 253-262; 以及Conroy， J. P., Seneweera， S,， Basra, A. S.， Rogers, G.和 Nissen-Wooller， B. [1994澳大利亚植物生理学杂志(/.尸/fl似 /. ) 21: 741-758).
利用体外谷粒培养系统的研究已经证明，热胁迫对发育中的种子的生 理学过程施以负面影响(Jones, R. J.， Gengenbach， B. G,和Cardwell， V. B. [1981作物科学(CW /; S"e脏)21: 761-766; Jones, R. J" Ouattar， S.和 Crookston, R. K. [1984J作物科学(Oo /7 5We"ce )24: 133-137;以及Cheikh， N.和Jones, R.丄[1995]植物生理学(尸A",W.尸/fl/it ) 95: 59-66)。在大于
最适温度的3sx:下培养的玉米粒重量显著减少。
在小麦中的工作已经鉴定出，小麦胚乳对热胁迫的反应的一个特点是
可溶性淀粉合成酶(SSS )活性的丧失。(Hawker, J. S.和Jenner, C. F. [1993
澳大利亚植物生理学杂志(/ 尸/做f TV^wW. ) 20: 197-209; Denyer， K.， Hylton， C. M.和Smith, A. M. [1994澳大利亚植物生理学杂志(爿m" /. /^/^T^jw'o/. ) 21: 783-789; Jenner， C. F. [1994澳大利亚植物生理学杂志 U组/ Pto尸一》/. )21: 791-806)。另外的研究显示小麦胚乳SSS是热 不稳定的(Rijven， A. H. G. C. [1986植物生理学(/Vfl",尸/^wo/. ) 81: 448-453; Keeling, P. L" Bacon, P. J" Holt， D. C. [1993J植物(ZV做似.)191: 342-348; Jenner， C. F.， Denyer， K.和Guerin， J. [1995澳大利亚才直物生理 学杂志(/ 尸/做/尸/^w》/. ) 22: 703-709)。玉米中SSS和ADP葡萄糖焦磷酸化酶(AGP)在热胁迫条件下的作 用还不甚清楚。AGP催化ATP和a-葡萄糖-l-礴酸生成ADP-葡萄糖和焦 礴酸。ADP-葡萄糖作为植物淀粉生物合成和细菌糖原生物合成中糖基的供 体。对玉米(Z^/zmyw)淀粉缺陷突变体胚乳的研究表明，作为关键酶，ADP-葡萄糖焦磷酸化酶在淀粉生物合成的调节中具有重要作用(Tsai， C. Y.和 Nelson, Jr., O. E. [1966j科学(5We聰)151: 341-343; Dickinson, D. B" J. Preiss[1969j植物生理学(尸/^w'o/.) 44:1058-1062)。
Ou-Lee和Setter (Ou-Lee， T.和Setter, T. L. [1985植物生理学(尸/"W 尸/i，戸Zo/. ) 79: 852-855)检测了温度对玉米穗顶端区域的影响。在淀粉集中 积累期，当温度升高时，与基部谷粒相比，顶端谷粒中的AGP活性较低。 相反，在这一时期正常温度下发育的谷粒中，顶端和基部谷粒中AGP活 性相似。然而，温度对这一时期顶端和基部谷粒中淀粉合成酶活性的影响 并无差异。而且，热处理的顶端谷粒的淀粉合成酶活性与对照相比有所增 加。在AGP活性上没有观察到这种现象。Singletary等人(Singletary， G. W., Banisadr， R.和Keeling, P. L. [1993]植物生理学(尸/fl^i^只,W. )102: 6 (增 刊)；Singletary， G. W.， Banisadra， R.， Keeling, P. L, [1994澳大利亚植物生 理学杂志(/.尸/朋f) 21: 829-841)利用体外培养系统对籽粒灌 浆期中不同温度的影响进行定量，随温度从22增加到种重稳步下 降。Duke和Doehlert的工作也支持了 AGP在产量损失中的作用(Duke， E. R.和Doehlert， D. C. [1996]环境实验植物学(E"Wraw. Ex/;. 36: 199-208)。
Keeling等人(1994，前述引文)的工作通过Q10分析法对玉米和小麦中 的SSS活性进行定量，并且证实SSS是碳流入淀粉的重要控制点。
AGP和SSS的体外生化研究清楚地显示两种酶都是热不稳定的。当 57。C加热5分钟时，玉米胚乳AGP丧失96。/。的活性(Hannah， L. C.， Tuschall, D, M.和Mans, R. J. [1980]遗传学() 95: 961-970)。这 与马铃薯AGP不同，后者在70r完全稳定(Sowokinos， J. R.和Preiss， J.[19821植物生理学(尸/""f /V^wo/,) 69: 1459-1466; Okita, T. W., Nakata, P. A., Anderson, J. M.， Sowokinos， J.， Morell， J.和Preiss， J. [1990植物生理 学(尸/""f/^戸,》/. ) 93: 785-卯)。SSS的热失活研究显示其在高温下也是不 稳定的，并且动力学研究确定当温度从25。C升高到45t:时，对支链淀粉的 Km值呈指数升高(Jenner等人，1995，前述引文)。
生物化学和遗传学证据已经表明，AGP是高等植物淀粉生物合成和大 肠杆菌糖原生物合成中的关键酶(Preiss， J.和Romeo， T. [1994j核酸研究 和分子生物学进展(/rt TV"c. J"V/i M. ) 47: 299-329;
Preiss，J.和Sivak， M. [1996!"库和源中的淀粉合成"，见植物和作物中 的光同化物分酉己源_库关系(photoassimilate distribution in plants and crops:source-sink relationships ) ， Zamski， E.主编，Marcil Dekker公司, 139-168页)。AGP催化的步骤据认为是淀粉生物合成途径的起始步骤，其 反应产物为活化的糖基供体一一ADP葡萄糖。淀粉合成酶利用所述ADP 葡萄糖延伸多糖多聚体(综述见于Hannah, L. Curtis [1996"玉米胚乳中的 淀粉合成"，见植物细胞和分子生物学进展(爿rfv"wcM //i CW/ /""朋rf Mo/ec"/",忍/o/ogy )第4巻，B. A. Larkins和I. K. Vasil (主编)，
植物种子发育的细胞和分子生物学(Cellular and Molecular Biology of Plant Seed Development) ， Kluwer学院出版社，Dordrecht,荷兰)。
对马铃薯AGP的最初研究显示，在大肠杆菌中表达产生的该酶与天 然块茎中的该酶在变构和动力学特性上非常相似(Iglesias， A" Barry, G. F.， Meyer, C.， Bloksberg, L.， Nakata， P.， Greene, T.， Laughlin， M. J.， Okita， T. W" Kishore, G. M.和Preiss， J.1993]生物化学杂志(/ 肠/ C脸附.)268: 1081-86; Ballicora， M. A.， Laughlin, M. J.， Fu， Y.， Okita， T. W.， Barry, G. F.和Prdss， J. [1995]植物生理学(户/做,/%嵐)109:245-251)。 Greene 等人指出了在马铃薯AGP的结构-功能研究中细菌表达系统的用途 (Greene, T. W.， Chantler， S. E.， Kahn， M. L.， Barry, G. F.， Preiss， J.和 Okita， T. W. [1996]国家科学院院报(Prac. TV"//. S": )93: 1509-1513;
8Greene, T. W.， Woodbury， R丄.和Okita， T.W. [1996植物生理学(iVfl加 P/i"/o/. ) 112: 1315-1320)。现已鉴定出在变构和底物结合位点作图时具有 重要作用的多个突变(Okita, T. W" Greene, T. W.， Laughlin， M. J" Salamone， P.， Woodbury, R.， Choi, S,, Ito， H.， Kavakli， H.和Stephens, K. [1996"通过生成修饰的植物生物合成酶改造植物淀粉"，见五wg,'wecV/g Ow/o/* /m/"败/fl/ ￡W t/*es， Shewry， P. R,， Napier, J. A.和Davis， P.主编， Portland出版有限公司，伦敦)。
AGP酶已经从细菌和植物中分离出来。细菌AGP由同四聚体组成， 而植物光合和非光合组织的植物AGP为异四聚体，由2种不同的亚基构 成。该植物酶由两个不同的基因编码，其中一个亚基比另一个大。这一特 性在许多植物中得到证明。利用SDS-PAGE估计，菠菜叶中的AGP亚基 的分子量为54 kDa和51 kDa。两个亚基都可以与抗纯4匕的菠菜叶AGP 的抗体发生免疫反应(Copeland， L" J. Preiss (1981)植物生理学(尸/做f 尸A一/. ) 68: 996-1001; Morell， M" M. Bloon， V. Knowles， J. Preiss [1988
生物化学杂志(J说o. C7^附.)263: 633)。利用制备的抗菠菜叶大和小亚基 的抗血清的免疫学分析显示马铃薯块茎AGP也由两个基因编码(Okita等 人，19卯，前述引文)。马铃薯块茎的两个亚基(50和51 kDa)的cDNA克隆也 已经分离并测序(Muller-Rober， B. T" J. Kossmann， L. C. Hannah, L. Willmitzer， U. Sounewald1990TV/o/. G^汰G^rtC 224: 136-146; Nakata， P. A.， T. W. Greene, J. M, Anderson, B. J. Smith-White, T. W. Okita， J. Preiss [1991植物分子生物学(Pto編.細.)17:1089-1093)。马铃薯 块茎AGP大亚基是热稳定的(Nakata等人[1991，前述引文)。
正如Hannah和Nelson (Hannah, L. C.， O. E. Nelson (1975)植物生理 学(/VflW尸/^wV /. ) 55: 297-302; Hannah, L. C.和Nelson, Jr., O. E.1976
生物化学遗传学(Biochem. Genet.)14: 547-560)所推断，5T^"wA:ew-2 (Bhave， M. R.， S. Lawrence, C. Barton, L. C. Hannah [1990植物细胞 (7V""f O") 2: 581-588)和5"'"/e-2(Bae， J. M.， M. Giroux， L. C.Hannah [19卯Affl^Woi 35: 317-322)都是玉米胚乳ADP-葡萄糖焦磷酸化 酶的结构基因。和分别编码该酶的大亚基和小亚基。通过cDNA 测序推断出5T^和份2蛋白质的分子量分别为57,179 Da (Shaw， J. R.， L. C. Hannah [1992植物生理学(尸ZaW尸—wo/.) 98:1214-1216)和52,224 Da。 胚乳是玉米谷粒发育期间大部分淀粉沉积的位点。与AGP活性缺陷水平 相对应，和玉米胚乳突变体的淀粉水平大大减少。已证实，任何 一个基因的突变都将4吏AGP活性减少约95% (Tsai和Nelson, 1966,前述 引文；Dickinson和Preiss， 1969，前述引文)。而且已经观察到，酶活性随功 能性野生型S/^和5G等位基因的剂量而增加，而突变酶具有改变的动力 学特性。AGP是植物淀粉生物合成中的限速步骤。Stark等人将大肠杆菌 AGP的突变形式导入马铃薯块茎中，得到淀粉含量增加35%(Stark等人 [1992科学(S"'e"") 258:287)。
现已报道了对多种植物的编码AGP酶亚基的基因的克隆和鉴定。这 包括玉米的cDNA (Bhave等人，19卯，前述引文)、基因组DNA (Shaw和Hannah, 1992，前述引文)以及份2 cDNA (Bae等人，19卯，前述引 文)；水稻的小亚基cDNA (Anderson, J, M" J. Hnilo, R. Larson， T. W. Okita, M. Morell， J. Preiss1989]生物化学杂志(/ )264:
12238-12242)和基因组DNA (Anderson, J, M.， R. Larson, D, Landencia, W. T. Kim， D. Morrow, T. W. Okita， J. Preiss1991基因(Gwe) 97: 199-205);以及菠菜叶的大小亚基cDNA (Morell等人，1988,前述引文) 和马铃薯块茎的大小亚基cDNA (Muller-Rober等人，1990,前述引文； Nakata， P. A.， Greene, T. W.， Anderson, J. W.， Smith-White, B. J" Okita， T. W.和Preiss, J. [1991]植物分子生物学(尸/"w,Afo/. )17: 1089-1093)。 另夕卜，已经从小麦胚乳和叶组织(Olive， M, R.， R. J. Ellis, W. W. Schuch [1989]植物生理分子生物学(/^"/i/尸A""/. Mo/.所o/. ) 12: 525-538)以及拟 南芥叶(Lin， T" Caspar, T., Sommerville， C. R.和Preiss, J. [1988植物生 理学(尸/做f户/^wV /.) 88:1175-1181)中分离出cDNA克隆。在迄今所研究的所有組织和生物体中AGP以变构酶形式执行功能。 AGP的变构特性最先在大肠杆菌中被证实是重要的。从大肠杆菌中分离了 一个过度产生糖原的突变体，并且该突变定位于AGP结构基因上，命名 为g&C。已证实此大肠杆菌突变体(称作对激活剂果糖-l，6-二 磷酸较敏感，而对抑制剂cAMP较不敏感(Preiss， J. [1984微生物学年评 i ev. Af/oY^/"/.) 419-458)。尽管植物AGP也为变构酶，但它们与 大肠杆菌AGP响应不同的效应分子。在植物中，3-磷酸甘油酸(3-PGA)作 为其激活剂而磷酸盐(P04)作为抑制剂(Dickinson和Preiss， 1969，前述引 文)。
利用体内诱变系统，Giroux等人能够在玉米胚乳AGP的功能重要区 域产生点特异突变体(Giroux， M. J., Shaw， J., Barry， G.， Cobb， G. B., Greene, T.， Okita， T. W.和Hannah, L. C. [1996国家科学院院报( AW/.爿ow/. Sd.) 93: 5824-5829),上述体内诱变系统由Ac-介导切除偶然紧 靠已知激活剂结合位点的仂转座因子而产生。突变体/ ev6在AGP大亚 基上含有酪氨酸-丝氨酸插入，并且所述突变体使种重增加了 11-18%。另 外，据已出版的国际申请WO 01/64928所讲授，利用编码含有及ev6突变 的玉米AGP大亚基的多核苷酸转化植物可以增强植物的多种特征，例如 种子数目、植物生物量、收获指数等等。
发明内容
本发明涉及用于提高植物中作物产量的材料和方法，上述植物例如那 些产生谷类作物的植物。在一个实施方案中，本发明提供热稳定AGP酶
以及编码这些酶的核苷酸序列。在优选实施方案中，本发明热稳定酶可以 用于提供对高温具有更大耐受性的植物，并因此增加这些植物的作物产量。 在特别优选实施方案中，改进的植物为谷类植物。可应用本发明的谷类包 括例如玉米、小麦、稻和大麦。附图简述
图1显示热稳定玉米胚乳AGP大亚基突变体。所示的是在6(TC热处 理5分钟后保留的AGP活性百分数。
图2所示是玉米、小麦、大麦和马铃薯AGP大亚基中HS33突变的周 围区域的一级序列联配(alignment)。用盒子表示保守的区域。
图3显示玉米、小麦、大麦和马铃薯AGP大亚基中HS40突变的周围 区域的一级序列联配。用盒子标出保守的区域。粗体天冬氨酸残基对应于 马铃薯LS的D413A变构突变体(Greene， T， W. ， Woodbury, R. L.，和 Okita， T. W. [1996尸/朋f尸/^wW. (112: 1315-1320)。菠菜叶AGP序列是在 3-PGA类似物研究中鉴定的激活剂位点2肽(Ball， K.和Prdss, J.1994/. 肌o/. c&附.269: 24706- 24711)。用粗体表示标记的赖氨酸残基。
图4A和4B分别显示TS48和TS60的分子特征。用粗体表示TS48 基因损伤和相应残基。在TS48的Leu到Phe突变上方标出了氨基酸编号。 最后一行是共有序列。Leu残基高度保守。用粗体表示TS60基因损伤和 相应残基。在TS60的Glu到Lys和Ala到Val突变上方标出了氨基酸编 号。盒子内的残基对应于以前鉴定的HS33突变，该突变被证实在玉米胚 乳AGP的热稳定性中是重要的。最后一行是共有序列。
图5A和5B分别显示RTS48-2和RTS60-1的分子特征。用粗体表示 RTS48-2基因损伤和相应残基。在RTS48-2的Ala到Val突变上方标出了 氨基酸编号。最后一行是共有序列。有意义的是，在RTS48-2中鉴定的此 突变与热稳定变体HS13中发现的突变作图定位于相同的残基位置。HS13 在位置177含有Ala到Pro突变。用粗体表示RTS60-1基因损伤和相应残 基。在RTS60-1的Ala到Val突变上方标出了氨基酸编号。最后一行是共 有序列。
序列简述
SEQ ID NO.l是含有图2所示HS 33突变的玉米AGP大亚基区域的氨基酸序列。
SEQ ID NO.2是图2所示玉米AGP大亚基区域的氨基酸序列。 SEQIDNO,3是图2中所示小麦AGP大亚基区域的氨基酸序列。 SEQ ID N0.4是图2中所示大麦AGP大亚基区域的氨基酸序列。 SEQ ID N0.5是图2中所示马铃薯AGP大亚基区域的氨基断列。 SEQ ID NO.6是含有图3中所示HS 40突变的玉米AGP大亚基区域 的氛基^列。
SEQ ID N0.7是图3中所示玉米AGP大亚基区域的氨基酸序列。 SEQ ID N0.8是图3中所示小麦AGP大亚基区域的氨基酸序列。 SEQ ID N0.9是图3中所示大麦AGP大亚基区域的氨基酸序列。 SEQ ID NO.10是图3中所示马铃薯AGP大亚基区域的氨基酸序列。 SEQ ID NO.ll是图3中所示菠茱AGP大亚基区域的氨基酸序列。 SEQ ID N0.12是含有图4A中所示TS48突变的玉米AGP大亚基区
域的氨基酸序列。
SEQ ID N0.13是图4A中所示玉米AGP大亚基区域的氨基酸序列。 SEQ IDNCU4是图4A中所示小麦AGP大亚基区域的氨基酸序列。 SEQ ID NO,15是图4A中所示大麦AGP大亚基区域的氨基酸序列。 SEQ ID NO.16是图4A中所示稻AGP大亚基区域的氨基酸序列，。 SEQ ID NO,17是含有图4B中所示TS60突变的玉米AGP大亚基区
域的氨基酸序列。
SEQ IDN0.18是图4B中所示玉米AGP大亚基区域的氨基,列。 SEQ ID N0.19是图4B中所示小麦AGP大亚基区域的氨基絲列。 SEQ ID NO.20是图4B中所示大麦AGP大亚基区域的氨基M列。 SEQ ID NO.21是图4B中所示稻AGP大亚基区域的氨基酸序列。 SEQ ID N0.22是含有图4B中所示TS60突变的玉米AGP大亚基区
域的氨基酸序列。
SEQIDN0.23是图4B中所示玉米AGP大亚基区域的氨基絲列。SEQ ID N0.24是图4B中所示小麦AGP大亚基区域的氨基絲列。 SEQ ID N0.25是图4B中所示大麦AGP大亚基区域的氨基瞎列。 SEQ ID NO.26是图4B中所示稻AGP大亚基区域的氨基酸序列。 SEQ ID NO.27是含有图5A中所示RTS48-2突变的玉米AGP大亚基
区域的氨基酸序列。
SEQ ID N0.28是图5A中所示玉米AGP大亚基区域的氨基,列。 SEQ IDN0.29是图5A中所示小麦AGP大亚基区域的氨基^f列。 SEQ ID NO.30是图5A中所示大麦AGP大亚基区域的氨基絲列。 SEQ ID NO.31是图5A中所示稻AGP大亚基区域的氨基酸序列。 SEQ ID NO.32是含有图5B中所示RTS60-1突变的玉米AGP大亚基
区域的氨基酸序列。
SEQIDN0.33是图5B中所示玉米AGP大亚基区域的氨基酸序列。 SEQ ID NCU4是图5B中所示小麦AGP大亚基区域的氨基酸序列。 SEQ ID N0.35是图5B中所示大麦AGP大亚基区域的氨基絲列。 SEQ ID NO.36是图5B中所示稻AGP大亚基区域的氨基酸序列。
发明详述
本发明涉及新的突变多核苷酸分子及其编码的多肽，相对于具有野生 型基因型的植物而言，其赋予在热胁迫条件下生长的植物增高的产量。在 特定实施方案中，本发明多核苷酸分子编码玉米胚乳ADP葡萄糖焦磷酸化 酶(AGP)和可溶性淀粉合成酶(SSS)酶活性。与野生型酶活性相比，该突 变酶可以使表达此突变酶的种子和植物组织在种子和植物发育时期对热胁 迫条件表现出增强的稳定性。
在一个实施方式中，本发明多核苷酸编码在多肽序列中含有组氨酸到 酪氨酸置换的玉米AGP大亚基突变体。根据该蛋白质中可接受的氨基酸 编号(Shaw和Hannah， 1992，前述引文)，该置换出现在氨基酸残基333位。 该置换的位置可以容易地被本领域技术人员鉴定。本发明中示例的第二突变是在玉米AGP蛋白质大亚基的460位苏氨酸到异亮氨酸的置换。
本发明也示例了用苯丙氨酸、甲硫氨酸或甘氨酸置换玉米AGP大亚 基333位组氨酸的突变体。下面的表l中示出了可以赋予增加热稳定性的
其它玉米AGP大亚基突变体例子。_
表l
突变体 氨基酸改变
HS 13在位置177，Ala到Pro
HS 14在位置400，Asp到His和
在位置454,Val到lie
HS 16在位置104，Arg到Thr
HS 33在位置333,His到Tyr
HS 33F在位置333，His到Phe
HS 33M在位置333，His到Met
HS 33G在位置333,His到Gly
HS 39在位置333，His到Tyr
HS 40在位置333,His到Tyr,和
在位置460，Thr到lie
HS 47在位置216，Arg到Pro ， 和
在位置333，His到Tyr
RTS 48-2在位置177，Ala到Val
RTS 60-1在位置396,Ala到Val
由于植物不同种类之间AGP多肽的同源性(Smith-White和Preiss [1992分子进化杂志(/ Afo/. ) 34: 449-464)，普通技术人员可以容易 地确定玉米以外其它植物的AGP中与此处公开的玉米AGP突变位置相对 应的突变位置。例如，图2和3显示了小麦、大麦和马铃薯中玉米HS 33 和HS40突变周围区域的一级序列联配。因此，本发明包括编码非玉米植 物的突变AGP的多核苷酸，所述植物包括但并不限于小麦、大麦和稻， 当所述多核苷酸在植物中表达时其赋予增强的热稳定性。
玉米胚乳AGP亚基(SH2和BT2)的cDNA克隆和内源细菌AGP缺陷
15型大肠杆菌(￡".^//)林系(^/gC-)(AC70Rl-504)促进了研究玉米胚乳AGP
的细菌表达系统的建立。单个亚基的表达不能补偿g/g c-突变，不产生糖
原(Iglesias， A. ， Barry, G. F.， Meyer, C. , Bloksberg， L ， Nakata， P.， Greene, T. , Laughlin， M. J. ， Okita， T. W. ， Kishore, G. M.,和Preiss, J. [1993/.说o/C7^肌268: 1081-86)。然而，如暴露于》典的菌落的暗红棕色染
色所证明的一样，相容表达载体上大和小亚基的表达完全补偿了 g/g cr突
变，并且恢复了糖原产生。因此，通过简单的将菌落暴露于硤很容易鉴定 互补性。
在一个实施方式中，使用了表达马铃薯或玉米胚乳AGP结构基因的 大肠杆菌g/g Cr细胞。当在37。C或在42'C生长时，含有马铃薯 AGP基因的细胞可以合成充足的糖原。然而，表达玉米胚乳AGP的细胞 只在37C合成糖原。该结果证明了野生型玉米胚乳AGP的热敏感性。马 铃薯和玉米APG在这方面的差异为筛选具有玉米胚乳AGP热稳定变异体 的突变细胞提供了有效系统。
本发明一方面涉及对热稳定AGP的有效鉴定。因此，如下所述，化 学诱变含有编码玉米AGP SH2亚基的多核苷酸的质粒，将其导入表达BT2 亚基的突变大肠杆菌(五.C0/Z)细胞中，在42。C生长细胞以筛选可以在该 温度产生糖原的突变体。也可以利用本领域已知的其它诱变剂。分离了 11 个可遗传的、碘染色的突变体，称为热稳定(HS)突变体。制备这些突变 体的粗提取物，并监测所获得的AGP的热稳定性。在60'C温育5分钟后， 突变体保留了活性的8-59% (图1 )。相比较，在该温度，对于野生型AGP， 常规观察到1-4 %活性。
结果表明可以根据本发明，通过突变产生热稳定形式的酶。因此，本 发明一个方面涉及产生和鉴定编码突变淀粉生物合成酶的多核苷酸的方 法，该突变淀粉生物合成酶与野生型酶比较具有增加的热稳定性。意外地， 在大多数这些突变体中热处理前玉米胚乳AGP的总活性升高约2到3倍 这种意外的结果4吏得这些突变体用在农业中特别有利。可以才艮据本发明利 用这里所述的诱变技术以鉴定编码热稳定淀粉生物合成酶的其它基因。完全测序了编码这里所示例的几种热稳定突变体的基因，其中包括两
个热稳定性最强的HS突变体，HS33和HS40。热处理后保留59%活性的 HS33包含在多肽氨基酸序列位置333从组氨酸残基到酪氨酸改变的单碱 基对突变(图2)。与小麦和大麦AGP大亚基的一级序列联配表明在类似 残基位置也存在组氨酸(图3)(Ainsworth， C.， Hosein， F. ， Tarvis， M. ， Weir， F,，BurrelI, M. ， Devos， K. M. ， Gale, M. D. [1995]户/做似197: 1-10)。对处理 后保留41%活性的HS40进行序列分析，该序列也含有在位置333从组氨 酸到酪氨酸的突变。此外，还鉴定了另一个点突变，其产生了苏氨酸到异 亮氨酸的置换。苏氨酸残基在AGP大亚基中高度保守，而在AGP小亚基 中类似的残基是半胱氨酸或丝氨酸(Ainsworth等，1995，前述引文)。此苏氨 酸到异亮氨酸的置换紧靠大亚基的羧基末端，并且紧靠激活剂3-PGA的已 知结合位点(图3 )。
本发明另一方面涉及淀粉生物合成酶，诸如AGP的突变体和编码它 们的多核苷酸，其中这些突变酶通过筛选温度敏感型(TS)突变体，然后 诱变并且筛选显示增加稳定性的回复体来分离。本发明另一方面涉及制备 和鉴定这些多核苷酸和其编码的突变酶的方法。
本发明也涉及酶小亚基中有突变的AGP热稳定突变体。本发明范围 中也包括编码突变的AGP小亚基的多核苷酸。利用本发明方法也可以很 容易地制备和鉴定能赋予酶热稳定性的AGP小亚基中的突变。
本发明也考虑经培育含有本发明突变多核苷酸或用本发明突变多核苷 酸转化的、并表达多核苷酸所编码的多肽的植物和植物组织。表达突变多 核苷酸的植物和植物组织可以产生例如当发育期间受到热胁迫时，具有较 低热诱导的重量或产量损失的组织。本发明范围内的植物包括单子叶植物， 诸如稻、小麦、大麦、燕麦、高梁、玉米、百合和粟，和双子叶植物，诸 如豌豆、紫花苜蓿、鹰嘴豆、菊苣、三叶草、羽衣甘蓝、兵豆、北美雀麦、 大豆、烟草、马铃薯、甘薯、萝卜、甘蓝、欧洲油菜、苹果树和莴苣。在 特别优选的实施方式中，植物是谷类。本发明应用的谷类包括，例如玉米、 小麦、稻、大麦、燕麦、黑麦和粟。具有本发明突变多核苷酸的植物可以从基因组中含有突变基因的种子 生长。此外，用基因转化植物的技术是本领域已知的。
因为遗传密码的简并性，对于这里所公开的每一个变异体AGP多肽， 可以由各种不同的多核苷酸序列来编码。此外，本领域技术人员可以熟练 地产生编码相同或基本相同的本发明多肽的替代多核苷酸序列。这些变异 体或替代多核苷M列在本发明范围内。这里所用提到的"基本相同，，序 列指编码氨基酸置换、缺失、添加或插入的序列，该氨基酸置换、缺失、
添加或插入不实质上改变这里所述AGP多核苷酸突变体编码的多肽的功 能活性。
这里所用术语"核酸"和"多核苷酸序列"指单或双链形式的脱氧核 糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非有另外的限定，其也包括以与天
序列包括转录为RNA的DNA链序列和翻译为蛋白质的RNA序列。多核 苷酸序列包括全长序列及来源于全长序列的较短序列。在特定的多核苷酸 序列中包含天然序列的简并密码子或包含可以被引入以提供特定宿主细胞 中密码子优先使用的序列，这是可以理解的。示例序列的等位基因变异也 落在本发明范围内。落入本发明范围内的多核苷酸序列还包括与示例的序 列特异性杂交的序列。多核苷酸包括单链形式的或双链体中的有义和反义 链。
本发明范围内也考虑除了这里所公开的突变体中具体示例的M酸置 换以外的氨基酸置换。可以将氨基酸分为下面的几类非极性、不带电荷 极性、碱性和酸性。将突变AGP多肽中的氨基酸置换成与该氨基酸相同 类的另一个氨基酸的保守性置换也落入本发明范围内，前提是具有置换的 突变AGP多肽相对于野生型多肽仍旧保留了增加的热稳定性。下面的表2 列出了属于每一类的氨基酸的例子。
。多核苷酸
氨基酸的分类
氨基酸的例子
非极性
Ala， Val， Leu， lie, Pro, Met， Phe， Trp不带电荷极性
酸性
碱性
Gly， Ser， Thr, Cys， Tyr， Asn， Gln Asp， Glu
Lys， Arg， His_
例如，在HS 33， HS 39， HS 40和HS 47玉米胚乳AGP突变体中位置 333，用其它氨基酸诸如甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和 谷氨酰胺置换酪氨酸将包括在本发明范围内。只要多肽相对于野生型多肽 保留增加的热稳定性，本发明范围内也考虑在除了热稳定突变位点以外的
位置的氨基酸置换。
本发明也涉及编码全长突变多肽的片段的多核苷酸，条件是这些片段 保留与全长多肽基本相同的功能活性。这些多核苷酸编码的突变AGP多 肽片段也在本发明范围内。
本发明也考虑编码淀粉生物合成酶的多核苷酸分子，所述分子具有与 野生型序列足够同源以致于允许在标准高严格条件下与该序列杂交的序 列。这种杂交条件在本领域是常规的(参见，例如Maniatis， T. ， E. F. Fritsch， 丄Sambrook [1989J分子克隆实验室指南，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor，纽约)。
本发明多核苷酸分子可以用于转化植物以在这些植物中表达突变热稳 定酶。此外，本发明多核苷酸可以用于表达重组变异体酶。它们也可以用 做检测相关酶的探针。多核苷酸也可以用做测量DNA大小的标准。
本发明的多核苷酸分子也包括编码含有突变的淀粉生物合成酶诸如 AGP酶的多核苷酸，其中该突变可以使表达这些突变的植物具有增加的种 子重量及增加的热稳定性。本发明尤其考虑在编码玉米AGP大亚基的多 核苷酸中热稳定性突变诸如妖WJ或和提供增加的种子重量的突变， 例如i ev 6的联合。美国专利号5,589,618和5,650,557公开了编码AGP大 亚基中突变的多核苷酸(例如，及ev6)，该突变在表达突变多肽的植物中赋 予增力p的种子重量。
根据本发明提供热稳定性的AGP亚基中的突变可以与玉米的磷酸不 敏感性突变诸如Wev6突变联合以增强i ev6编码的大亚基的稳定性。预期如同利用AGP时所观察到的，高温将损伤SSS酶活性。因此， 根据这里所述的方法，可以在增加的热条件(42。C )下表达诱变形式的SSS, 以分离热稳定变异体。这些热稳定诱变形式的SSS和编码它们的多核苷酸 是本发明的另一方面。
本发明也涉及通过掺入本发明多核苷酸，在热胁迫条件下增加植物产 量特征的方法，所述多核苷酸包含提供对热胁迫条件增加的稳定性或抗性 的淀粉生物合成酶中的突变和赋予植物增加的产量特征的突变。增加的产 量特征包括，例如增加的种子数量、增加的种子重量、增加的植物生物量 和增加的收获指数。
本发明也涉及产生和鉴定本发明范围内所考虑的多核苷酸和多肽的方 法。在一个实施方式中，可以通过基因突变、接着利用细菌表达系统筛选， 分离编码如下酶的多核苷酸分子，所述酶可以减轻植物在淀粉合成中的热 诱导损失。
这里参考或引用的所有专利、专利申请、临时申请和公开出版物，除 了与本说明书所清楚教导的内容不一致的，特此整体并入作为参考文献。
下面举例说明实践本发明的方法的实施例。不应该将这些实施例解释 为限制性的。除非另有指明，所有百分比按重量计，所有溶剂混合物的比 例按体积计。
实施例1
利用诱变获得玉米胚乳AGP热稳定变异体
首先，化学诱变剂羟胺-HCl用于大亚基表达质粒的随机诱变。羟胺优 先幾基化胞嘧啶C-4位置的氨基氯，产生了 GC到AT的转换(Suziiki， D. T.， Griffith, A. J. F. ， Miller, J. H.，和Lewontin， R. C. [1989，《遗传分析导论》 (Introduction to genetic analysis ) ， Freeman, NY，第4版,475-499页)。
选择高突变频率的化学诱变剂。化学诱变剂的局限性是已知的，如果未分 离到大量的各种遗传变异体，那么可以进行PCR随机诱变。PCR诱变可 以产生包括相似的转换和颠换频率的更广泛的突变谱，提供了化学方法的优良的可替4、方案。可以按照Cadwell和Joyce (Cadwell, R. C.和Joyce, G. F. [1992，《PCR方法和应用》，(PCR Methods and Applications ), 2: 28-33)概述的方法实施此PCR方法。
由于随机诱变中利用了完整的表达质粒，突变可能出现在编码区的外 面。尽管预期这种突变将不会对玉米胚乳AGP的热稳定性具有任何影响， 但是在进行酶水平的任何其它鉴定之前，可以将每个变异体亚克隆到未突 变的表达质粒中。可以以一定方式构建大和小亚基表达质粒，以便使得可 以通过TVcoIASV^I消化释放完整的编码区。然后，该完整的编码区可以容 易地被克隆回未突变的iVcoIA^cI消化的表达载体中。
实施例2
热稳定AGP变异体的分子鉴定和分析
最初，获得11个玉米胚乳大亚基热稳定变异体。利用DuPont和ABI 仪器进行测序。可以常规地比较序列数据和祖先野生型等位基因。该分析 表明可以调节热稳定性的变化式样的多样化程度。
几种测序的HS突变体在大亚基氨基酸位置333含有相同的组氨酸到 酪氨酸的改变。利用将酪氨酸改变回到组氨酸的引物，通过定点诱变，可 以针对此组氨酸到酪氨酸的改变，快速篩选PCR来源的HS突变体。
实施例3
遗传变异体的表达、純化和动力学分析
已经充分地表征了在大肠杆菌(Eco/Z)中野生型玉米胚乳AGP表达 的条件。最适宜的生长和诱导条件稍微不同于以前公开的用于大肠杆菌中 表达马铃薯AGP的条件(Iglesias等，1993，前述引文；Ballicora等，1995，前述 引文)。在0.31111\1 IPTG和25iag/ml萘啶酮酸存在的情况下，在室温诱导 12-14小时一贯地得到高水平的表达和活性。向提取緩冲液添加30%硫酸 铵和10mM KH2P(V/K2HP(V以稳定粗提取物中玉米AGP。
利用Tentacle C3氨基丙基介质(EM S印arations)填充的Pharmacia
21HR 10/10柱子，通过疏水相互作用层析法进一步纯化硫酸铵浓缩的AGP。 在含有1M硫酸铵的緩沖液中，蛋白质结合柱子。通过连续步骤的含有 0.75M， 0.5M， 0.25M和OM硫酸铵的緩冲液梯度冲洗，从柱子洗脱AGP。 通常在0.25M洗脱物中洗脱野生型玉米胚乳AGP。利用填充Macro-Prep DEAE (BioRad)阴离子交换介质的Pharmacia HR 10/10柱子，通过阴离子 交换层析进一步纯化经C3纯化的玉米胚乳AGP。通过100-500mM KC1 的线性梯度洗脱AGP,并且通常在约300mM盐浓度时洗脱AGP。 Pharmacia FPLC系统用于所有的层析步骤。充分地表征了各纯化步骤的 条件。通过焦磷酸解测定法监测纯化期间的AGP活性，通过SDS-PAGE、 考马斯染色和利用对玉米胚乳AGP大和小亚基特异的多克隆抗体的 Western印迹监测纯化步骤。
实施例4
增强的亚基相互作用
HS玉米胚乳AGP突变体的完全意外的多效作用是热处理前2到3倍 活性的升高。对这种结果的一种可能的解释是我们已经通过突变转变了大 肠杆菌细胞中存在的SH2和BT2单体和聚合物的比率。可能，在野生型 中，仅仅10%或更低的总蛋白质以活性异四聚体形式存在，而在突变体中， 该百分比高得多。如果聚合物比单体更具有热抗性，那么突变体的表型将 与观察结果一致。动力学分析可以用于确定对底物和/或变构效应物亲和性 的改变。
为了检验这些突变体中单体/聚合物比率可能改变的想法，可以监测热 处理前和后野生型中和选定突变体中的单体和聚合物数量。由于可获得这 两个亚基的抗体(Giroux， M. J.和Hannah， L. C.1994Afo/. Gew"/cs 243: 400-408), 4吏得该方法切实可行。这可以通过蔗糖梯度超离心和通过 凝胶层析检验，并且将^l艮容易地确定哪种方法最有效和最明确。
因为高等植物AGP由2个相似但不同的亚基组成，所述亚基寡聚化 形成天然异四聚体结构，增强该相互作用的突变可以为该酶提供额外的稳定性。可以利用酵母双杂交系统(CLONTECH Laboratories, Palo Alto， CA) 估测亚基相互作用。可以构建用于编码区扩增的特异性引物。这些引物在 5，_和3，_末端添加唯一的限制位点，以便通过克隆有利于将各亚基与GAL4
DNA结合结构域(pGBT9)或GAL4激活结构域(pGAD424)形成翻译融合。 如果克隆到载体中的蛋白质相互作用，那么DNA结合结构域和激活结构 域将形成功能性转录激活物。接着，这将激活克隆在GAL4启动子后面的 才艮道基因lacZ的表达。
首先，可以利用野生型亚基鉴定条件。可以将野生型大和小亚基的编 码区克隆到pGBT9和pGAD424酵母表达载体中。可以产生所有可能的组 合，并检测这些组合。含有57i2和说2的pGBT9和pGAD424栽体可以共 转化到相同的酵母林系中，并且在缺乏色氨酸(pGBT9)和亮氨酸(pGAD424) 的培养基上筛逸生长的菌林。可以双向以lacZ的表达检测亚基相互作用。 通过P-半乳糖苷酶滤膜测定法可以可视地鉴定阳性菌落。用该测定法，菌 落与滤膜结合，裂解和与X-gal溶液温育。可以分析显示蓝颜色的菌落。 进一步，可以通过对P-半乳糖苷酶特异的酶测定法分析亚基相互作用。这 允许相互作用的定量分析。增强亚基相互作用的突变将在测定时给出更高 水平的P-半乳糖苷酶活性。
实施例5
稳定性的进一步增强
分离的大亚基突变体在它们的热稳定特性方面不同，表明存在多种突 变的可能性。尽管突变体HS 33和HS 40的序列分析表明突变体序列不同， 但是两个突变体都含有相同的组氨酸到酪氨酸的改变。如果鉴定到SH2蛋 白质中不同的HS改变，则可以在一个蛋白质中有效地逐渐增加这些改变。 而且，小亚基中任何HS突变都可以与HS SH2突变体共表达以进一步增 强玉米胚乳酶的稳定性。
可以很容易地在一个亚基中联合多个HS突变。例如，可以利用将5T^ 编码区分成3个不同片段的不同单一限制位点。当适合时，可以通过亚克隆含有所要添加的突变的相应片段以达到突变的联合。如果两个突变紧邻， 那么可以利用定点诱变设计这种联合。位点特异性诱变的一种方法涉及
PCR、诱变引物和Z)/ml限制性内切核酸酶的应用。可以构建引物以在5， 末端含有突变，并且利用校正聚合酶Vent，利用该引物进行PCR扩增。 然后可以用Z)/ml消化扩增的DNA。因为从大肠杆菌分离的亲代DNA是 甲基化的，因此其对i)/ml敏感。通过凝胶电泳大小分级消化的DNA,将 其连接并且克隆到表达载体中。通过序列分析确认突变并转化到带有野生 型小亚基的AC70Rl-504林系中。然后可以分析组合突变体。
实施例6
在玉米AGP大亚基位置333的其它突变体的鉴定
羟胺-HCl诱变剂仅产生胞嘧啶到胸腺嘧啶的改变，因此限制了可能置 换的类型。因为DNA两条链都受到了诱变，所以也出现胸腺嘧啶到胞嗜 啶的改变；然而，合起来一起考虑总共仅出现12种可能的单碱基改变中的 2种改变。因此，通过羟胺-HCl诱变将不能产生所有可能的氨基酸置换。
因此，为了制备突变体，利用2步法，在玉米胚乳AGP大亚基的位 置333分别插入20种不同氨基酸的每种氨基酸。方法学基本来源于 Stratagene的方法。首先，通过PCR位点特异性诱变除去编码氨基酸333 的密码子加上氨基酸334密码子的第一个碱基(Suzuki等，1989，前述引 文)。随后通过碘染色对失活作筛选，接着测序以证实缺失，利用在333密 码子含有随机碱基加上在氨基酸334密码子第一个碱基处含有置换碱基的 引物PCR诱变所得到的质粒。由此得到的质粒;陂转化到含有份2的大肠杆 菌突变细胞中，在37。C和在42。C，通过碘染色筛选活性，随后测序。在后 面的阶段使用具有更少简并性的引物以更有效地产生在第 一次循环中没有 获得的密码子。
诱变后，分离所有20种氨基酸置换，并且在37。C,所有置换都产生 了染色。在升高的温度42。C计数碘染色的突变体。编号的抹系被用于筛选 以除去观察者方面的偏见。下面的表3中列出了在42。C生长时产生等于或大于野生型的染色的那些突变体。
如所预料的，此筛选鉴定到在蛋白质位置333具有野生型氨基酸，即 组氨酸，或/TSW突变体氨基酸，即酪氨酸的活性酶。还鉴定到苯丙氨酸, 其仅由于缺少极性羟基而不同于酪氨酸。此筛选也鉴定到具有实质上不同 于酪氨酸和苯丙氨酸的氨基酸，诸如甘氨酸的活性酶。
也在65。C处理新提取的酶制备物5分钟之前和之后，测定了 AGP活 性，结果如表3中所示。通过在42。C生长阳性染色的大肠杆菌板篩选到的 8种氨基酸，在65 。C热处理后，其中三种突变体(HS 33， HS 33F ，和HS 33M， 在位置333分别具有酪氨酸、苯丙氨酸或甲疏氨酸)在酶测定中显示了上佳 活性。尽管含有苯丙氨酸和曱硫氨酸的AGP的AGP活性稍孩i高于酪氨酸 置换介导的AGP活性，但是这三种制备物之间的活性差异小。
表3氨基酸力口热前w力口热后论
组氨酸(野生型)6142
酪氨酸(HS 33 )10077
苯丙氨酸13885
甲硫氨酸16089
半胱氨酸737
赖氨酸4838
甘氨酸10234
谷氨酰胺6521
*在热处理前，粗制备物中的AGP活性表示为HS33活性的百分数。
实施例7
热稳定性突变和i ev6的联合
根据本发明，热稳定突变可以与和增加的种子重量有关的突变，诸如 Z^v6突变联合。目的是维持/^v6期望的磷酸盐不敏感性特征，而同时增 强其稳定性。如这里所述，可以构建并且证实Rev6/HS双突变体。双突变
25体可以被转化到带有野生型小亚基的AC70R1-504中。通过在低葡萄糖培 养基上的阳性糖原染色可以容易地鉴定增加的热稳定性。当在该培养基上 生长时，i ev6不染色。最初可以酶促筛选所有突变体组合的磷酸盐不敏感 性的维持，之后仅进一步篩选维持磷酸盐不敏感性的组合。
实施例8
SSSI突变体的克隆
可以从大肠杆菌原种中心(E.coli Stock Center)获得内源细菌糖原合 酶缺陷的g/g A-大肠杆菌林系。目前用于AGP表达的细菌表达载体可以用 于SSS的表达。
如用于例如和份2的一个克隆策略(Giroux等，1996，前述引文)是 一个引物含有一个单一限制位点加转录物5，末端，而另一个引物含有另一 个单一限制位点和待研究基因的翻译终止密码子3'序列。随后的克隆在质 粒内产生翻译融合。首先将这些基因特异性引物与来源于发育胚乳的poly A+RNA用在RT-PCR反应中。
玉米胚乳SSS I的表达将补偿g/g A-抹系中糖原合酶活性的缺乏。如同 在g/gC林系中表达AGP—样，用碘染色应该容易观察到互补。可以在各 种温度温育粗提取物不同时间长度以测定SSSI热稳定性。如同利用AGP 细菌表达系统一样，可以在各种温度生长表达玉米胚乳SSS I的g/^ A-株系 以测定是否功能是温度敏感性的。 一旦确定限制性温度，可以对SSSI克 隆进行随机诱变。SSSI的突变体形式可以被转化到g/gA-林系中，在限制 性温度生长，并且通过它们在限制温度产生碘染色糖原的能力鉴定热稳定 变异体。
实施例9
玉米胚乳ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的温度敏感型突变体 做为鉴定其它具有增加稳定性的变异体的替代方法，利用反向遗传学 方法。已经分离温度敏感型突变体(TS)。在30。C，这些突变体显示了阴性碘染色表型，表明玉米胚乳AGP功能的缺乏。相反，当突变体在37。C 生长时，它们能完全互补细菌AGP中的突变。这清楚地表明突变APG是 功能性的，并且功能丧失是温度依赖型的。在30"C和37。C，野生型AGP 显示了阳性糖原染色表型。然后，温度敏感型突变体用于产生第二位点回 复突变体，该第二位点回复体编码具有增强稳定性的突变AGP。 诱变
对pSh2 DNA进行幾胺谦变(Greene， T. W.， Chantler， S. E.， Kahn， M. L. ， Barry, G. F.， Preiss， J.，和Okita， T. W. [1996JiV"rf. Sd. 93:
1509-1513)，并且将其转化到带有野生型pBt2小亚基质粒的AC70R1-504 大肠杆菌细胞中。细胞涂平板，并且在30。C生长。在30。C， AGP温度敏 感型变异体通过阴性碘染色表型鉴定。在30。C和37。C再一次划线培养推定 的突变体和做为对照的野生型AGP。分离在30'C—致地产生阴性碘表型 和在37'C—致地产生阳性碘染色表型的6个突变体。野生型Sh2和Bt2的 表达在这两个温度都产生了阳性碘染色表型。
TS48和TS60的鉴定
分离和测序来源于两个温度敏感型突变体TS48和TS60的质粒DNA， 以筌定基因损伤。筌定到在氨基酸位置426产生苯丙氨酸置换亮氨酸的单 点突变(图4A)。该残基和周围的区域在谷类胚乳大亚基(LS)中高度 保守(Smith-White和Preiss， 1992，前引文)。在TS60中，鉴定到在氨基酸 324从谷氨酸到赖氨酸突变和在位置359从丙氨酸到缬氨酸突变的两个点 突变(图4B) 。 Glu-324在AGP的LS和小(SS )亚基中高度保守 (Smith-White和Preiss， 1992,前引文)。Ala-359和周围氨基酸在AGP LS 中也高度保守。更重要的是,TS60中鉴定的2个突变位于这里所述的HS 33 突变的侧翼。已证明在位置333具有组氨酸到酪氨酸置换的HS 33突变大 大地增加了玉米胚乳AGP的热稳定性。TS60突变紧邻HS 33突变是蛋白 质的该区域对稳定性具有重要性的另外证据。
第二位点回复体的分离
温度敏感型突变体的分离为分离其它可以增强AGP稳定性的变异体提供了可选择表型。对TS48和TS60 DNA再进行羟胺诱变以分离第二位 点回复体，该回复体恢复了在30。C的阳性糖原染色表型。使用羟胺是因为 此诱变化学消除了 TS48和TS60突变体中鉴定的最初突变直接恢复突变的 可能性。这促进了恢复这些温度敏感型突变体稳定性的第二位点突变的筛 选。
分离TS48的3个回复体，并且示出了一个突变体RTS48-2的分子特 征(图5A) 。 RTS48-2除了含有TS48中鉴定的亲本突变外，还在氨酸酸 位置177含有丙氨酸到缬氨酸突变。该残基和周围区域高度保守。RTS 48-2 突变对应于热稳定突变体HS13中所鉴定的相同突变位点。在HS13中， 在位置177，丙氨酸残基突变为脯氨酸。这两个突变作图定位于相同位点 是有意义的。利用完全不同的方法，根据增加的稳定性筛选到RTS48-2和 HS 13突变体，由此这两个突变确定这个位点在AGP稳定性中是重要的。
分离TS60的5个第二位点回复体，示出了一个回复体RTS60-1的序 列分析(图5B)。鉴定到在氨基酸396的丙氨酸到缬氨酸突变。该残基在 AGPLS中高度保守，并且其也作图紧邻HS14中所鉴定的热稳定突变。
应该理解这里所述的实施例和实施方式仅仅是示例性目的，本领域技
术人员鉴于此将得到各种变通或改变方案的启示，该变通和改变方案包括 在本申请的精神和范围内及所附权利要求的范围中。序列表
<110>佛罗里达大学研究基金公司(University of Florida Research Foundation, Inc.)
<120>淀粉生物合成酶的热稳定突变体
<130> UF-178AXC2
<150> US 09/312,433 <151> 1999-05-14
<150> US 60/085,460 <151> 1998_05_14
<150> US 08/972,545 <151> 1997-11-18
<150> US 60/031,045 <151> 1996-11-18
<160> 36
<210> 1 <211> 33 <212> PRT
<213>玉米(Zea mays)的HS 33突变体 <400> 1
Leu His Asp Phe Gly Ser Glu工le Leu Pro Arg Ala Val Leu Asp Tyr 15 10 15
Ser Val Gin Ala Cys lie Phe Thr Gly Tyr Trp Glu Asp Val Gly Thr 20 25 30
lie
<210> 2 <211> 33 <212> PRT <213>卫米
<400> 2
Leu His Asp Phe Gly Ser Glu lie Leu Pro Arg Ala Val Leu Asp His 15 10 15
Ser Val Gin Ala Cys lie Phe Thr Gly Tyr Trp Glu Asp Val Gly Thr 20 25 30
工le
<210> 3 <211> 33 <212> PRT
<213> 件通小走(Tritic腿aestivum) <400> 3Leu His Asp Phe Gly Ser Glu lie 1 5
Asn Val Gin Ala Tyr Val Phe Thr
20
lie
<210> 4
<211> 33
<212> PRT
<213>大麦(Hordeum vulgare)
<400> 4
Leu His Asp Phe Gly Ser Glu lie 1 5
Asn Val Gin Ala Tyr Val Phe Thr 20
lie
<210> 5 <211> 33 <212> PRT
<213>马铃薯(Solanum tuberosum) <400> 5
Ser Asn Asp Phe Gly Ser Glu lie 1 5
Asn Val Gin Ala Tyr lie Phe Lys 20
lie
<210> 6 <211〉 26 <212> PRT
<213>卫米的HS4。突变体 <400> 6
Ala Gly Lys Val Pro lie Gly lie
Cys lie lie Asp Met Asn Ala Arg 20
<210> 7 <211〉 26 <212> PRT <213>卫米
Pro Arg Ala Leu His Asp His 10 15
Tyr Trp Glu Asp lie Gly Thr
30
Pro Arg Ala Leu His Asp His 10 15
Tyr Trp Glu Asp工le Gly Thr
30
Pro Ala Ala lie Asp Asp Tyr 10 15
Tyr Trp Glu Asp lie Gly Thr
30
Arg Asn 工le Lys lie Arg Asn 10 15
Gly
Leu
Asp 25
Leu
Asp 25
p 5
CO 2
A
y
30<400> 7
Ala Gly Lys 1
Val Pro lie Gly lie Gly Arg Asn Thr Lys工le Arg Asn 5 10 15
Cys lie lie
Asp Met Asn Ala Arg lie Gly 20 25
<210> 8 <211> 26 <212> PRT <213>普通小麦
<400> 8
Glu Gly !Lys
1
Val Pro lie Gly Val Gly Glu Asn Thr Lys工le Ser Asn 5 10 15
Cys lie lie
Asp Met Asn Ala Arg lie Gly 20 25
<210〉 9
<211> 26
<212> PRT
<213>人左
<400> 9
Glu Gly Lys 1
Val Pro工le Gly Val Gly Glu Asn Thr Lys lie Ser Asn 5 10 15
Cys lie lie Asp Met Asn Ala Arg lie Gly 20 25
<210> 10
<211> 26
<212> PRT
<213>马铃薯
<400> 10 Glu Gly Lys
Val Pro工le Gly lie Gly Glu Asn Thr Lys lie Arg Lys 5 10 15
Cys lie lie Asp Lys Asn Ala Lys lie Gly 20 25
<210> 11 <211> 11 <212> PRT
<213> 菠菜(Spinicia oleracea) <400> 11
lie Lys Asp Ala lie lie Asp Lys Asn Ala Arg 15 10<210> 12 <211> 20 <212> PRT
<213>玉米的TS48突变体
<400> 12 Cys Ser Arg
Val Ser Ser Gly Cys Glu Phe Lys Asp Ser Val Met Met 5 10 15
Gly Ala Asp
lie 20
<210> 13 <211> 20 <212> PRT <213>玉米
<400> 13
Cys Ser Arg 1
Val Ser Ser Gly Cys Glu Leu Lys Asp Ser Val Met Met 5 10 15
Gly Ala Asp
工le 20
<210> 14 <211> 20 <212> PRT
<213>普通小麦 <400> 14
Arg Ser Arg
1
Leu Asn Ser Gly Ser Glu Leu Lys Asn Ala Met Met Met 5 1Q 15
Gly Ala Asp
Ser 20
<210> 15 <211> 20 <212> PRT <213>大麦
<400> 15
Arg Ser Arg 1
Leu Asn Ser Gly Ser Glu Leu Lys Asn Ala Met Met Met 5 10 15
Gly Ala Asp
Ser 20
<210> 16 <211> 12 <212> PRT<213>稻(Oryza sativa)
<400> 16
Ser Ser Arg ValSer Ser
15
<210> 17
<211> 24
<212> PRT
<213>玉米的TS60突变体
<400> 17
Asp Phe Gly SerLys lie
10
10
15
Gin Ala Cys
lie Phe Thr Gly Tyr 20
<210> 18 <211> 24 <212> PRT <213>玉米
<400> 18
Asp Phe Gly 1
Ser Glu lie Leu Pro Arg Ala Val Leu Asp His Ser Val ■ 5 10 15
Gin Ala Cys
lie Phe Thr Gly Tyr 20
<210> 19 <211> 24 <212> PRT <213>普通小麦
<400> 19
Asp Phe Gly 1
Ser Glu lie Leu Pro Arg Ala Leu His Asp His Asn Val 5 10 15
Gin Ala Tyr
Val Phe Thr Asp Tyr 20
<210> 20
<211> 24
<212> PRT <213>人走
<400> 20
Asp Phe Gly 1
Ser Glu lie Leu Pro Arg Ala Leu His Asp His Asn Val 5 10 15
Gin Ala Tyr Val Phe Thr Asp Tyr<210> 21 <211> 25 <212> PRT <213>稻
<400> 21
20
Asp Phe Gly 1
Ser Glu 工le Leu Pro Arg Ala Leu Leu Glu His Asn Val 5 10 15
Lys Val Ala Cys Val Phe Thr Glu Tyr 20 25
<210> 22 <211> 25 <212> PRT
<213>玉米的TS60突'变体
<400> 22
Glu Asp Val 1
Gly Thr lie Lys Ser Phe Phe Asp Ala Asn Leu Val Leu 5 10 15
Thr Glu Gin
Pro Ser Lys Phe Asp Phe 20 25
<210> 23 <211> 25 <212> PRT <213>
<400> 23 Glu Asp Val
Gly Thr 工le Lys Ser Phe Phe Asp Ala Asn Leu Ala Leu 5 10 15
Thr Glu Gin
Pro Ser Lys Phe Asp Phe 20 25
<210> 24 <211> 25 <212> PRT <213>涔通小犮
<400> 24
Glu Asp lie Gly Thr lie Arg Ser Phe Phe Asp Ala Asn Met Ala Leu 15 10 15
Cys Glu Gin Pro Pro Lys Phe Glu Phe 20 25
25
<211> 25<212> PRT <213>大麦
<400> 25
Glu Asp lie 1
Gly Thr lie Arg Ser Phe Phe Asp Ala Asn Met Ala Leu 5 10 15
Cys Glu Gin Pro Pro Lys Phe Glu Phe 20 25
<210> 26 <211> 25 <212> PRT <213>稻
<400> 26 Glu Asp lie
Gly Thr lie Lys Ser Phe Phe Asp Ala Asn Leu Ala Leu 5 10 15
Thr Glu Gin
Pro Pro Lys Phe Glu Phe 20 25
<210> 27 <211> 20 <212> PRT
<213>玉米的RTS4 8-2突变体 <400> 27
Thr Gin Met 1
Pro Glu Glu Pro Val Gly Trp Phe Gin Gly Thr Ala Asp 5 10 15
Ser lie Arg
Lys 20
<210> 28 <211> 20 <212> PRT <213>玉米
<400> 28 Thr Gin Met
Pro Glu Glu Pro Ala Gly Trp Phe Gin Gly Thr Ala Asp 5 10 15
Ser lie Arg Lys 20
<210> 29 <211> 20 <212> PRT <213>普通小麦
<400> 29Thr Gin Met Pro Gly Glu Ala Ala Gly 1 5
Ala Val Arg Lys 20
<210> 30 <211> 20 <212> PRT
火麦
<400> 30
Thr Gin Met Pro Gly Glu Ala Ala Gly
Ala Val Arg Lys 20
<210> 31 <211> 20 <212> PRT <213>禾舀
<400> 31
Thr Gin Met Pro Asp Glu Pro Ala Gly 1 5
Ala lie Arg Lys 20
<210> 32 <211> 18 <212〉 PRT
<213>玉米的RTS60-1突变体 <400〉 32
Asp Lys Cys Lys Met Lys Tyr Val Phe 1 5
Arg Glu
<210> 33 <211> 18 <212> PRT <213>卫米
<400> 33
Asp Lys Cys Lys Met Lys Tyr Ala Phe 1 5
Arg Glu
Phe Arg Gly Thr Ala Asp
15
Phe Arg Gly Thr Ala Asp
15
Phe Gin Gly Thr Ala Asp
15
Se:r Asp Gly Cys Leu Leu
15
Ser Asp Gly Cys Leu Leu
15
p o
r 1
T
p<
T
p<
r 一
36<210> 34 <211> 18 <212> PRT <213>普通小麦
<400> 34
Asp Lys Cys Arg 工le Lys Glu Ala lie lie Ser His Gly Cys Phe Leu 15 10 15
Arg Glu
<210> 35 <211> 18 <212> PRT <213>大发
<彻> 35
Asp Lys Cys Arg lie Lys Glu Ala lie工le Ser His Gly Cys Phe Leu 15 10 15
Arg Glu
<210> 36 <2]1> 20 <212> PRT <213>稻
<400> 36
Asp Lys Cys Lys Cys Lys lie Lys Asp Ala 工le lie Ser Asp Gly Cys 15 10 15
Ser Phe Ser Glu 20
权利要求
1、编码植物淀粉生物合成蛋白质突变体或所述蛋白质突变体的生物学活性片段或变异体的多核苷酸，其中所述蛋白质突变体相对于野生型蛋白质显示增加的热稳定性。
2、 如权利要求l所述的多核苷酸，其中所述多核香酸编码的所述蛋 白质突变体是植物ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的亚基。
3、 如权利要求l所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码的所述蛋 白质突变体是植物ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的大亚基，并且在所述大亚基 中包含氨基酸突变。
4、 如权利要求l所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码的所述蛋 白质突变体是植物ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的小亚基，并且在所迷小亚基 中包含氨基酸突变。
5、 如权利要求3所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码的所述蛋 白质突变体包含氨基酸突变，其中用能赋予蛋白质突变体增加的热稳定性 的氨基酸置换对应于玉米ADP-葡萄糖焦磷酸化酶野生型大亚基氨基酸序 列中位置333的组氨酸。
6、 如权利要求5所述的多核苷酸，其中在位置333置换组氨酸的氨 基酸是甘氨酸。
7、 如权利要求5所述的多核苷酸，其中在位置333置换组氨酸的所 述氨基酸是苯丙氨酸。
8、 如权利要求5所述的多核苷酸，其中在位置333置换组氨酸的所 述氨基酸是甲硫氨酸。
9、 如权利要求1所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码的所述蛋 白质突变体还包含能使表达所述多核苷酸的植物增加种子重量的氨基酸突 变。
10、 如权利要求9所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包舍及ev6突变。
11、 如权利要求9所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码植物 ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亚基，其中在对应于玉米野生型ADP-葡萄糖焦 磷酸化酶大亚基氨基酸序列之494和495位的氨基酸之间插入至少一个丝 氨酸残基。
12、 如权利要求9所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码植物 ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亚基，其中在对应于玉米野生型ADP-葡萄糖焦 磷酸化酶大亚基氨基酸序列之494和495位的氨基酸之间插入氨基酸对酪 氨酸丝氨酸。
13、 如权利要求9所述的多核普酸，其中所述多核苷酸编码植物 ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亚基，其中在对应于玉米野生型ADP-葡萄糖焦 磷酸化酶大亚基氨基酸序列之495和496位的氨基酸之间插入氨基酸对丝
14、 增加植物对热胁迫条件的抗性的方法，所述方法包括将权利 要求1所述多核苷酸掺入所述植物的基因组中，并且表达所述多核苷酸分 子编码的蛋白质。
15、 如权利要求11所述的方法，其中所述植物是单子叶植物。
16、 如权利要求15所述的方法，其中所述单子叶植物选自稻、小 麦、大麦、燕麦、高梁、玉米、百合和粟。
17、 如权利要求14所述的方法，其中所述植物是玉米(Zea mays ) 或所述植物组织来源于玉米(Zea mays)。
18、 如权利要求14所述的方法，其中所述植物是双子叶植物。
19、 如^又利要求18所述的方法，其中所述双子叶植物选自豌豆、 紫花苜蓿、鹰嘴豆、菊苣、三叶草、羽衣甘蓝、兵豆、北美雀、大豆、烟 草、马铃薯、甘薯、萝卜、甘蓝、欧洲油菜、苹果树和莴苣。
20、 含有权利要求1所述多核苷酸分子的植物或植物组织。
21 、 如权利要求20所述的植物或植物組织，其中所述植物或植物 组织是单子叶的。
22、 如权利要求21所述的植物或植物组织，其中所述单子叶植物或植物组织选自稻、小麦、大麦、燕麦、高梁、玉米、百合和栗。
23、 如权利要求20所述的植物或植物组织，其中所述植物是玉米 (Zetf附fl")或所述植物组织来源于玉米(Ze"附"")。
24、 如权利要求20所述的植物或植物组织，其中所述植物或植物 組织是双子叶的。
25、 如权利要求24所述的植物或植物组织，其中所述双子叶植物 或植物组织选自豌豆、紫花苜蓿、鹰嘴豆、菊苣、三叶草、羽衣甘蓝、兵 豆、北美雀麦、大豆、烟草、马铃薯、甘薯、萝卜、甘蓝、欧洲油菜、苹 果树和莴苣。
26、 如权利要求20所述的植物组织，其中所述植物组织是种子。
27、 权利要求1所述多核苷酸编码的淀粉生物合成蛋白质突变体。
28、 鉴定编码淀粉生物合成蛋白质突变体的多核普酸的方法，其 中所述淀粉生物合成蛋白质突变体相对于野生型蛋白质显示增加的热稳定 性，所述方法包括突变编码淀粉生物合成蛋白质的多核苷酸，在细胞中表 达所述突变的多核苷酸以产生淀粉生物合成蛋白质突变体，并且测定是否加的热稳定性。
29、 增强植物特征的方法，其中所述植物特征选自种子数目、植 物生物量、收获指数、旗叶重、结种花序以及总种重，所述方法包括向所 述植物的基因组中掺入权利要求10所述的多核苷酸，并表达由所述多核苷 酸分子编码的蛋白质。
全文摘要
本发明涉及新的突变多核苷酸分子，其编码具有增加的热稳定性的酶，当这些多核苷酸在植物中表达时，引起在热胁迫条件下生长的植物增加的产量。本发明多核苷酸分子编码玉米胚乳ADP葡萄糖焦磷酸化酶(AGP)和可溶性淀粉合酶(SSS)酶活性。本发明也考虑经培育含有突变多核苷酸或用突变体多核苷酸转化的、并表达多核苷酸编码的多肽的植物和植物组织。本发明也涉及分离本发明范围内所考虑的多核苷酸和多肽的方法。也提供了增加热胁迫条件下生长的植物的产量的方法。
文档编号C12N9/12GK101555481SQ20091011844
公开日2009年10月14日 申请日期2003年2月18日 优先权日2002年2月19日
发明者L·C·哈拿, T·W·格林 申请人:佛罗里达大学研究基金公司