大肠杆菌耐热性肠毒素ST_I突变体(Cys→Gly)分泌型表达载体的制作方法

专利名称：大肠杆菌耐热性肠毒素ST_I突变体(Cys→Gly)分泌型表达载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物学、分子生物学与基因工程的相关实验方法与技术，属于 微生物学、分子生物学与基因工程研究领域，特别是三种大肠杆菌耐热性肠毒素 ST,突变体(Cys—Gly)的分泌型表达载体。
背景技术：
引起仔猪黄、白痢的致病菌为产肠毒素性大肠杆菌(ETEC),其致病因子主要 为肠毒素和黏附素(adhesion)。肠毒素可分为耐热性肠毒素(ST)和不耐热性肠 毒素(LT)。耐热性肠毒素分为ST,和STn,其中ST,是最主要的直接致病因子。 耐热性肠毒素有毒且几乎没有免疫原性，当其与载体蛋白共价偶联后，可表现出 特异免疫原性。
ST,在菌体内首先合成72个氨基酸的前体,ST,前体由1 19个氨基酸前区、 20 54个氨基酸后区和55 72个氨基酸成熟区组成。前区为ST,类保守的领头 肽，在ST,mRNA翻译开始时便为信号肽酶所切割；后区在ST,通过内膜进入细 胞间质过程中有重要作用；要成为成熟ST,，转运后的后区ST,必须经过加工和 分子内正确二硫键的形成。
成熟的大肠杆菌ST,为18 19个氨基酸的多肽，ST,含有13个高度保守的 氨基酸序列(5 17个氨基酸)，这段氨基酸小肽保留了 ST,的完全毒性，为毒 性区，具有与天然毒素相似的受体蛋白结合能力。保守区内的6个Cys组成 Cys5-Cys10、 Cys6-Cys14和Cys9-Cys17 3个分子内二硫键，对ST,的生物毒性 至关重要。因该键属于共价键，键能高，不易破坏，故分子结构高度稳定，因而 耐热(在100'C 30min和121'C 15min不失活)、耐酸碱(在pH2 10稳定)、耐 多种有机溶剂和表面活性剂；抗各种蛋白酶水解，为肽类毒素中最特殊者。不被 淀粉酶、胰蛋白酶、脂酶、链霉蛋白酶、糖化酶等失活。
如果将二硫键破坏，就可以使S1^失去生物学毒性。因此，本研究采用PCR 和基因定点突变技术，将ST!基因成熟区第IO、 14、 17位的半胱氨酸(Cys)密码子TGT、 TGT、 TGC分别突变成编码甘氨酸(Gly)残基的密码子GGT、 GGT、 GGC密码子，成功获得了大肠杆菌耐热性肠毒素ST,的3种突变体(Cys— Gly)—ST,C10/G、 ST,C14/G、 ST,C17/G及其分泌型表达载体pESG10、 pESG14、 pESG17与相应的重组菌株BL21(DE3)(pESG10) 、 BL21(DE3)(pESG14)、 BL21(DE3)(pESG17)。从而为研究ST,的结构与功能的关系、致病机理及开发新 型仔猪腹泻基因工程疫苗奠定了坚实的基础。目前国内外尚没有与本研究成果相 关报道。

发明内容
本发明的目的是提供三种大肠杆菌耐热性肠毒素ST,突变体(Cys—Gly)的分 泌型表达载体，从而为研究ST,的结构与功能的关系、致病机理及开发新型仔猪 腹泻基因工程疫苗奠定了坚实的基础。本发明的目的按照下述方案实现
一种大肠杆菌耐热性肠毒素ST,突变体(Cys—Gly)分泌型表达载体，是以产 肠毒素性大肠杆菌强毒株C83922所提取质粒为模板，利用引物分别进行重组PCR， 扩增得到三种ST突变体--ST,C10/G、 ST,C14/G和ST,C17/G,继而将其克隆至 pET-22b中，获得了相应的分泌型表达载体pESG10、 pESG14、 pESG17与相应的重 组菌株BL21 (DE3) (pESG10) 、 BL21 (DE3) (pESG14) 、 BL21 (DE3) (pESG17)。分泌型 表达载体中，突变体基因核苷酸序列分别为
突变体基因ST,C10/G核苷酸序列
GCT CAG GAT GCT AAA CCA GTA GAG TCT TCA AAA GAA AAA ATC ACA CTA GAA TCA AAA AAA 60 力。yV/l《户yVf"5",〃A" / 7"Z yVi",iT^SV TGT AAC ATT GCA AM AAA AGT AAT AAA AGT GGT CCT GAA AGC ATG AAT AGT AGC MT TAC 120 CyVi"/JJ,51yV,5"G尸〃5" 5"Vf 40
TGC TGT GAA TTG TGT GGT AAT CCT GCT TGT ACC GGG TGC TAT 180 CCf/;C( yViP^C7"tfC/ 《0
突变体基因ST,C14/G核苷酸序列
GCT CAG GAT GCT AM CCA GTA GAG TCT TCA AAA GAA AAA ATC ACA CTA GAA TCA AAA AAA 60 TGT AAC ATT GCA AM AAA AGT MT AAA AGT GGT CCT GAA AGC ATG AAT AGT AGC AAT TAC 120 TGC TGT GAA TTG TGT TGT AAT CCT GCT GGT ACC GGG TGC TAT 180
突变体基因ST,C17/G核苷酸序列GCT CAG GAT GCT AAA CCA GTA GAG TCT TCA AAA GAA AAA ATC ACA CTA GAA TCA AAA AAA 60 TGT AAC ATT GCA AAA AAA AGT AAT AM AGT GGT CCT GAA AGC ATG AAT AGT AGC AAT TAC 120 TGC TGT GM TTG TGT TGT AAT CCT GCT TGT ACC GGG GGC TAT 180
本发明采用基因定点突变技术,将在ST,生物学毒性中起关键作用的10、14、 17位编码Cys的密码子定点突变为编码Gly的密码子，获得了 3种大肠杆菌耐 热性肠毒素STi突变体(Cys—Gly) —ST,C10/G、 ST,C14/G和ST,C17/G，并构建 了相应的分泌型表达载体pESG10、 pESG14、 pESG17与相应的重组菌株 BL21 (DE3) (pESG10) 、 BL21 (DE3) (pESG14) 、 BL21 (DE3) (pESG17)。检测结果表明， IPTG诱导表达后的重组蛋白分子量约为14kD,且可以可溶形式表达。发明结果 为进一步在蛋白质水平上阐明ST,中Cys残基形成的3对二硫键对ST生物学毒 性的影响，以及研究ST,的结构与功能的关系、致病机理等奠定了了坚实的基础。


图1是本发明ST,突变体基因的扩增产物电泳对照图； 图l左是PCR扩增结果
1. pu、 plOG PCR扩增产物
2. pu、 pl4G PCR扩增产物
3. pu、 pl7G PCR扩增产物
4. 空白对照PCR扩增产物
5. DL 2000 DNA Marker
图1右是重组质粒的酶切电泳结果
1. pMSG10/EcoR I /Hind III
2. pMSG14/EcoR I /Hind III
3. pMSG17/EcoR I /Hind III
4. DL 2000 DNA Marker 图2是突变体表达载体的酶切鉴定图，
1.DL6000bp DNA Marker 2.pESG10 3.pESG14 4.pESG17
图3是表达产物的Tricine-SDS-PAGE检测图1. BL21 (DE3) (pESS10)周质蛋白
2. BL21 (DE3) (pESS14)周质蛋白
3. BL21 (DE3) (pESS17)周质蛋白
4. BL21 (DE3) (pESS17)包涵体
5. BL21 (DE3) (pESS17)全菌蛋白
6. BL21 (DE3) (pET22b)全菌蛋白(阴性对照)
7. 超低分子量蛋白Marker
图4表达产物的Western blot检测图
1.BL21(DE3) (pESG10)周质蛋白 2. BL21 (DE3) (pESG14)周质蛋白 3.BL21(DE3)(pESG17)周质蛋白4. BL21 (DE3) (pET-22b)周质蛋白(阴性对照) 5.超低分子量蛋白Marker
具体实施例方式
根据STi基因序列及引物设计原则设计并合成如下突变用引物上游引物 pu:5-CATG ^)JS^多GA GCT CAG GAT GCT AAA CCA G-3 (TM=63)，阴影部分为 Nco I作用位点；下游引物分别为pl7G: 5-CCG ATA巡CCC GGT ACA
AGC AGG ATT ACA ACA C-3(TM=57): pl4G: 5-CCG &111招ATA GCA CCC GGT ACC AGC AGG ATT ACA ACA C-3(TM=57): plOG: 5-CCG (iXXfrS ATA GCA CCC GGT ACA AGC AGG ATT巡ACA C-3(TM=57) 。 pl7G、 pl4G、 plOG中，下划线部分分别表 示ST,成熟区第17、 14、 10位Cys密码子突变为编码Gly残基密码子的碱基组 成，阴影部分为EcoR I作用位点。
以产肠毒素性大肠杆菌强毒株C83922所提取质粒为模板，利用上述引物分 别进行重组PCR，扩增得到了相应的DNA片段产物。继而以pMD18-T Vector对 扩增产物进行了亚克隆，获得了相应的重组质粒pMSGlO、 pMSG14和pMSG17。酶 切鉴定结果表明，重组质粒中目的片段大小均约为220 bp，与预期结果基本一 致。核苷酸序列测定结果表明，ST,基因成熟区第IO、 14、 17位编码Cys的密码 子TGT、 TGT、 TGC分别按照实验设计突变为编码Gly残基的密码子GGT、 GGT、 GGC,表明成功获得了大肠杆菌耐热性肠毒素ST,的3种突变体(Cys — Gly)--ST,C10/G、 ST,C14/G、 ST,C17/G。在此基础上，进一歩分别成功构建了含有3种ST,突变体的分泌型表达载体pESG10、 pESG14、 pESG17,及相应的重组菌 株BL21 (DE3) (pESG10) 、 BL21 (DE3) (pESG14) 、 BL21 (DE3) (pESG17);对重组菌株 诱导后的周质蛋白进行了 Tricine-SDS-PAGE，结果表明上述3种重组菌株均可 以可溶形式表达ST,突变体蛋白，其分子量大小接近14kD;免疫印迹结果显示， 重组菌株所表达的周质部分融合蛋白可与相应抗体呈明显的抗原抗体结合反应。
ST,突变体基因的扩增如图1所示，分别利用所设计的突变引物，采用PCR 技术从产肠毒素性大肠杆菌强毒株C83922质粒中扩增得到了相应的DNA片段目 的产物(见图1左)。将所扩增的DNA片段回收后克隆至pMD18-T Vector中， 转化至受体菌JM109中，涂布于含Amp的LB琼脂平板上过夜培养，挑取阳性 菌落，采用碱裂解法进行质粒提取。重组子pMSG10、 pMSG14和pMSG17经 EcoRI/Hind III双酶切后，在2%琼脂糖凝胶上进行电泳检测(图2右)。结果 表明，酶切片段大小约为220 bp，与预期结果基本一致。
突变体基因的核苷酸序列测定
对上述ST,突变体重组子pMSGlO、 pMSG14和pMSG17进行了序列测定。结果表 ^^, ST,基因成熟区第IO、 14、 17位半胱氨酸的密码子TGT、 TGT、 TGC分别突变成 编码甘氨酸残基GGT、 GGT、 GGC的密码子(参见下表中下划线标记部分)，表明成 功获得了ST,的3种突变体(Cys—Gly): ST,C10/G、 ST,C14/G和ST,C17/G。
GCT CAG GAT GCT AAA CCA GTA GAG TCT TCA MA GAA AAA ATC ACA CTA GAA TCA MA AAA 60 /4。；V/4yr户yVf"S,iV/r/ f力 iVS《《iV TGT AAC ATT GCA AAA AAA AGT AAT AAA AGT GGT CCT GAA AGC ATG AAT AGT AGC AAT TAC 120 CyV/力^,51yV,SC尸〃■ i^yV51 yVf 4。
TGC TGT GAA TTG TGT GGT AAT CCT GCT TGT ACC GGG TGC TAT 180
表1突变体基因ST,C10/G核苷酸序列
GCT CAG GAT GCT AAA CCA GTA GAG TCT TCA AAA GAA MA ATC .ACA CTA GAA TCA MA MA 60
TGT AAC ATT GCA AAA AAA AGT AAT AAA AGT GGT CCT GAA AGC ATG AAT AGT AGC AAT TAC 120 TGC TGT GAA TTG TGT TGT AAT CCT GCT GGT ACC GGG TGC TAT 180
表2突变体基因ST! C14/G核苷酸序列
GCT CAG GAT GCT AAA CCA GTA GAG TCT TCA AAA GAA AAA ATC ACA CTA GAA TCA AAA AAA 60
TGT AAC ATT GCA AAA MA AGT AAT AAA AGT GGT CCT GAA AGC ATG AAT AGT AGC AAT TAC 120TGC TGT GAA TTG TGT TGT AAT CCT GCT TGT ACC GGG GGC TAT 180
表3突变体基ST, CI 7/G核苷酸序列
ST,突变体表达载体的构建-
将所获得的ST,的3种突变体基因片段ST,C10/G、 ST,C14/G、 ST,C17/G分 别插入到pET-22b表达载体中，构建了含有3种ST,突变体的分泌型表达载体 pESG10、 pESG14和pESG17。 pET-22b的特点是在多克隆位点的两侧携带周质蛋
白定位信号序列pelB的N-末端以及招5*丁&§@的C末端，从而使得插入的外源基
因可以以周质蛋白的形式进行表达。
进一步将上述重组质粒转化至受体菌DH5a中，涂布于含Amp的LB琼脂平 板上过夜培养，挑取阳性菌落扩增培养后，采用碱裂解法提取质粒。重组质粒经 Nco I和EcoR I双酶切后，在2%琼脂糖凝胶上进行电泳检测，结果见图2。结 果表明，其酶切片段大小约为162bp，与预期结果一致。
ST,突变体的原核表达
将3种ST'突变体的分泌型表达载体pESG10、pESG14和pESG17分别转入BL21 (DE3 ),获得了重组菌株BL21 (DE3) (pESG10 ) 、 BL21 (DE3) (pESG14)和 BL21(DE3)(pESG17)。对重组菌株经IPTG导后的表达产物进行了 Tricine-SDS-PAGE检须!J,结果如图3所示。结果表明，重组菌株的周质蛋白提 取物中存在目的蛋白，即重组蛋白可以以可溶形式表达，且其分子量均接近14kD 左右，与预期蛋白大小相一致。
由于天然存在的ST,为小肽，不易发生抗原抗体结合反应，因此，利用重组 载体上与ST,突变体融合表达的His标签的抗体对转膜蛋白进行了 Western blot 检测，结果如图4所示，结果表明这3种融合蛋白均可与His标签抗体呈阳性反 应，从而间接证明了突变体基因的特异性表达。
权利要求
1、一种大肠杆菌耐热性肠毒素STI突变体(Cys→Gly)分泌型表达载体，是以产肠毒素性大肠杆菌强毒株C83922所提取质粒为模板，利用引物分别进行重组PCR，扩增得到三种STI突变体--STI C10/G、STI C14/G和STI C17/G，继而将其克隆至pET-22b中，获得了相应的分泌型表达载体pESG10、pESG14、pESG17与相应的重组菌株BL21(DE3)(pESG10)、BL21(DE3)(pESG14)、BL21(DE3)(pESG17)。分泌型表达载体中，突变体基因核苷酸序列分别为突变体基因STI C10/G核苷酸序列GCT CAG GAT GCT AAA CCA GTA GAG TCT TCA AAA GAA AAA ATC ACA CTA GAA TCA AAA AAA 60A Q N A K P N E U S K N K I T L N S K K 20TGT AAC ATT GCA AAA AAA AGT AAT AAA AGT GGT CCT GAA AGC ATG AAT AGT AGC AAT TAC 120C N I A K K S N K S G P N S M N S S N Y 40TGC TGT GAA TTG TGT GGT AAT CCT GCT TGT ACC GGG TGC TAT 180C C E L C G N P A C T G C Y 60突变体基因STI C14/G核苷酸序列GCT CAG GAT GCT AAA CCA GTA GAG TCT TCA AAA GAA AAA ATC ACA CTA GAA TCA AAA AAA 60A Q N A K P N E U S K N K I T L N S K K 20TGT AAC ATT GCA AAA AAA AGT AAT AAA AGT GGT CCT GAA AGC ATG AAT AGT AGC AAT TAC 120C N I A K K S N K S G P N S M N S S N Y 40TGC TGT GAA TTG TGT TGT AAT CCT GCT GGT ACC GGG TGC TAT 180C C E L C C N P A G T G C Y 60突变体基因STI C17/G核苷酸序列GCT CAG GAT GCT AAA CCA GTA GAG TCT TCA AAA GAA AAA ATC ACA CTA GAA TCA AAA AAA 60A Q N A K P N E U S K N K I T L N S K K 20TGT AAC ATT GCA AAA AAA AGT AAT AAA AGT GGT CCT GAA AGC ATG AAT AGT AGC AAT TAC 120C N I A K K S N K S G P N S M N S S N Y 40TGC TGT GAA TTG TGT TGT AAT CCT GCT TGT ACC GGG GGC TAT 180C C E L C C N P A C T G G Y 60
全文摘要
一种大肠杆菌耐热性肠毒素ST_I突变体(Cys→Gly)分泌型表达载体，是以产肠毒素性大肠杆菌强毒株C83922所提取质粒为模板，利用引物分别进行重组PCR，扩增得到三种ST_I突变体--ST_IC10/G、ST_IC14/G和ST_IC17/G，继而将其克隆至pET-22b中，获得了相应的分泌型表达载体pESG10、pESG14、pESG17与相应的重组菌株BL21(DE3)(pESG10)、BL21(DE3)(pESG14)、BL21(DE3)(pESG17)。检测结果表明，IPTG诱导表达后的重组蛋白分子量约为14kD，且可以可溶形式表达。发明结果为进一步在蛋白质水平上阐明ST_I中Cys残基形成的3对二硫键对ST_I生物学毒性的影响，以及研究ST_I的结构与功能的关系、致病机理等奠定了坚实的基础。
文档编号C12R1/19GK101550424SQ20091011723
公开日2009年10月7日 申请日期2009年2月24日 优先权日2009年2月24日
发明者徐广贤, 敏 李, 王玉炯, 辉 赵 申请人:宁夏大学