专利名称：微生物发酵生产低温淀粉酶的方法
技术领域：
本发明涉及微生物学、酶工程、发酵工程、生物化学等领域，具体涉及一种低温淀 粉酶微生物发酵生产方法。该发明生产的低温淀粉酶主要应用于食品加工、中草药提取、造 纸、纺织、印染、洗涤、环境保护以及其它淀粉酶应用行业。可以提高原料的利用率、转化率 和生产率，降低生产成本，改善并提高产品质量。
背景技术：
淀粉酶是催化淀粉水解转化成葡萄糖、麦芽糖及其他低聚糖的一组酶的总称，广 泛存在于动物、植物和微生物中(钱海丰等，西北农业学报，200 。淀粉酶作为生物制剂， 已经广泛应用于食品加工、中草药提取、造纸、纺织、印染、洗涤、环境保护以及其它淀粉酶 应用行业。国内外目前使用的淀粉酶主要为中温和高温型淀粉酶。有关低温淀粉酶的研 究是起步阶段，主要研究菌种选育、发酵条件优化、酶学性质以及相关基因克隆等(张刚 等，海洋科学，2002 ；傅力等，农产品加工，2007 ；王淑军等，中国酿造，2008 ；刘志培等，环境 科学，2009)；而低温淀粉酶产业化、规模化生产及应用还未见报道。低温淀粉酶与高温、中 温淀粉酶相比具有很大的应用优势，因为低温淀粉酶在低温条件下具有高酶活力及高催化 效率；可减少加工工艺，缩短加工过程的时间并省却昂贵的加热或冷却费用；在节能方面 有相当大的优势；经过温和的热处理可使低温酶的活力丧失；低温或适温处理有助于提高 产品品质和质量(孙谧等，海洋水产研究，200 ，低温淀粉酶上述特性有助于其推广和应 用。低温淀粉酶的应用将对传统的农业、食品、医药、轻工、能源和环保等领域产生深远的影 响。利用微生物发酵生产的低温淀粉酶，按原料重量0. 1%。 0. 5%。的量添加于生料发酵、 食品加工和多孔淀粉生产等领域中，在7 20°C处理0. 5 1.证，可以提高原料的转化率 15. 4% 8%，降低了生产成本，改善并提高产品质量，从根本上摆脱中温、高温酶的加 热、冷却设备和工艺。低温淀粉酶具有非常巨大的开发潜力和应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种微生物发酵生产低温淀粉酶的方法，该方法主要是微生 物经过低温驯化后，在14 20°C液体发酵生产低温淀粉酶的方法，这种生产方法获得的低 温淀粉酶粗酶液活性可以达到199. 8U/mL，如再经过分离和纯化，可以得到不同浓度和纯度 的酶制剂。当该酶制剂活性为1000U/mL或1000U/g，0. 1%。 0. 5%。的添加量应用于生料发 酵、食品加工和多孔淀粉生产等领域中，在6 18°C处理0. 5 1.证，可以提高原料的转化 率15. 4% 8%。该酶制剂应用操作简单、方便、快捷、成本低。可以从根本上避免中温、 高温酶的加热、冷却设备和工艺。本发明所述的一种微生物发酵生产低温淀粉酶的方法具体包括以下步骤(1)将产生淀粉酶的微生物逐级低温驯化，驯化温度由高到低， 250C- 220C- 200C- 181614°C，使其在低温环境中生长良好；(2)按常规方法将低温驯化后的淀粉酶产生菌在14 20°C逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；(3)将液体一级种子或二级种子，按发酵液体积的2 8%接种量接入产酶培养基 中，在14 20°C培养48 144h时，即微生物发酵生产低温淀粉酶结束；(4)将(3)的发酵液在4，000 8，OOOrpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶 液；(5)根据不同需要和使用对象不同，将(4)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化， 制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。本发明中使用的菌种来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)，初期活化和生长条件按菌种保藏单位提供的说明进行。淀粉酶产生菌(例如， CGMCC菌种编号1. 2323τ或1. 447或1. 504等)，菌株先活化，再经过逐级低温驯化，发酵生 产低温淀粉酶时按本发明方法进行培养。低温驯化后的菌株在4°C环境中可保存2个月，用 25 40%甘油制成的菌悬液在零下80°C条件下可以长期保藏。
具体实施例方式实施例一(1)培养基制备①菌种活化培养基蛋白胨10. 0g，牛肉膏3. 0g, NaCl 5. 0g，琼脂20. 0g，蒸馏水 1. 0L, pH 值 7. 0，121°C 高压蒸气灭菌 30min。②菌种低温驯化培养基淀粉10. 0 20. 0g，蛋白胨10. 0 20. 0g, NaCl 7. 0 12. Og,琼脂20. Og,蒸馏水1. 0L, pH值7. 0 7. 6，121°C高压蒸气灭菌30min。③液体种子培养基淀粉5.0 8. 0g，牛肉膏2.0 4. 0g，NaCl 5. 0 8. 0g， K2SO4O. 8 1. 2g, CaCl2O. 1 0. 2g, ZnSO4 · 7H20 1. 2mg, MnSO4 · H2O 1. 6mg,蒸馏水 1. 0L, pH 值7. 0 7. 6，121°C高压蒸气灭菌30min。④产酶培养基淀粉12. 0 15. 0g，牛肉膏3. 0 6. 0g，NaCl 14. 0 20. 0g， K2S042. 0 4. 0g, CaCl2O. 1 0. 2g, ZnSO4 · 7H20 1. 2mg, MnSO4 · H2O 1. 6mg,蒸馏水 1. 0L, pH 值7. 0 7. 6，121°C高压蒸气灭菌30min。(2)将产生淀粉酶的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的 菌株说明进行初始活化；(3)将(2)活化好的菌种逐级低温驯化，驯化温度由高到低， 250C- 220C- 200C- 181614°C，使其在低温环境中生长良好；(4)按常规方法将低温驯化后的淀粉酶产生菌在14 16°C培养48 72h，按5% 的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；(5)将(4)制备的二级种子按发酵液体积2 4%的接种量接入10L的产酶培养 基中，在14 16°C培养96 144h时，即微生物发酵生产低温淀粉酶结束；(6)将(5)的发酵液在4，000 8，OOOrpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶 液；(7)根据不同需要和使用对象不同，将(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化， 制备成不同活性、纯度和剂型的低温淀粉酶制剂。实施例二
(1)培养基制备①菌种活化培养基蛋白胨10. 0g，牛肉膏3. 0g, NaCl 5. 0g，琼脂20. 0g，蒸馏水 1. 0L, pH 值 7. 6，121°C 高压蒸气灭菌 30min。②菌种低温驯化培养基淀粉10. 0 20. 0g，蛋白胨10. 0 20. 0g, NaCl 7. 0 12. Og,琼脂20. Og,蒸馏水1. 0L, pH值7. 0 7. 6，121°C高压蒸气灭菌30min。③液体种子培养基淀粉5.0 8. 0g，牛肉膏2.0 4. 0g，NaCl 5. 0 8. 0g， K2SO4O. 8 1. 2g, CaCl2O. 1 0. 2g, ZnSO4 · 7H20 1. 2mg, MnSO4 · H2O 1. 6mg,蒸馏水 1. 0L, pH 值7. 0 7. 6，121°C高压蒸气灭菌30min。④产酶培养基淀粉12. 0 15. 0g，牛肉膏3. 0 6. 0g，NaCl 14. 0 20. 0g， K2S042. 0 4. 0g, CaCl2O. 1 0. 2g, ZnSO4 · 7H20 1. 2mg, MnSO4 · H2O 1. 6mg,蒸馏水 1. 0L, pH 值7. 0 7. 6，121°C高压蒸气灭菌30min。(2)将产生淀粉酶的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的 菌株说明进行初始活化；(3)将(2)活化好的菌种逐级低温驯化，驯化温度由高到低， 250C- 220C- 200C- 181614°C，使其在低温环境中生长良好；(4)按常规方法将低温驯化后的淀粉酶产生菌在16 18°C培养48 72h，按5% 的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；(5)将(4)制备的二级种子按发酵液体积4 6%的接种量接入50L的产酶培养 基中，在16 18°C培养72 96h时，即微生物发酵生产低温淀粉酶结束；(6)将(5)的发酵液在4，000 8，OOOrpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶 液；(7)根据不同需要和使用对象不同，将(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化， 制备成不同活性、纯度和剂型的低温淀粉酶制剂。实施例三(1)培养基制备①菌种活化培养基蛋白胨10. 0g，牛肉膏3. 0g, NaCl 5. 0g，琼脂20. 0g，蒸馏水 1. 0L, pH 值 7. 6，121°C 高压蒸气灭菌 30min。②菌种低温驯化培养基淀粉10. 0 20. 0g，蛋白胨10. 0 20. 0g, NaCl 7. 0 12. Og,琼脂20. Og,蒸馏水1. 0L, pH值7. 0 7. 6，121°C高压蒸气灭菌30min。③液体种子培养基淀粉5.0 8. 0g，牛肉膏2.0 4. 0g，NaCl 5. 0 8. 0g， K2SO4O. 8 1. 2g, CaCl2O. 1 0. 2g, ZnSO4 · 7H20 1. 2mg, MnSO4 · H2O 1. 6mg,蒸馏水 1. 0L, pH 值7. 0 7. 6，121°C高压蒸气灭菌30min。④产酶培养基淀粉12. 0 15. 0g，牛肉膏3. 0 6. 0g，NaCl 14. 0 20. 0g， K2S042. 0 4. 0g, CaCl2O. 1 0. 2g, ZnSO4 · 7H20 1. 2mg, MnSO4 · H2O 1. 6mg,蒸馏水 1. 0L, pH 值7. 0 7. 6，121°C高压蒸气灭菌30min。(2)将产生淀粉酶的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的 菌株说明进行初始活化；(3)将(2)活化好的菌种逐级低温驯化，驯化温度由高到低， 250C- 220C- 200C- 181614°C，使其在低温环境中生长良好；
(4)按常规方法将低温驯化后的淀粉酶产生菌在18 20°C培养48 72h，按5% 的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；(5)将(4)制备的二级种子按发酵液体积6 8%的接种量接入100L的产酶培养 基中，在18 20°C培养48 72h时，即微生物发酵生产低温淀粉酶结束；(6)将(5)的发酵液在4，000 8，OOOrpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶 液；(7)根据不同需要和使用对象不同，将(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化， 制备成不同活性、纯度和剂型的淀粉酶制剂。实施例四按实施例一、二和三方法生产的低温淀粉酶制剂，平均酶活性为1000U/mL，将活性 为1000U/mL或1000U/g的低温淀粉酶制剂，按原料重量0. 1%。 0. 5%。的量添加于生料发 酵、食品加工和多孔淀粉生产等领域中，在7 20°C处理0. 5 1.证，可以提高原料的利用 率、转化率和生产率，降低生产成本，改善并提高产品质量。低温淀粉酶应用部分实验结果 见下表。
权利要求
1.一种微生物发酵生产低温淀粉酶的方法，其包括以下步骤(1)将产生淀粉酶的微生物逐级低温驯化，驯化温度由高到低， 250C- 220C- 200C- 181614°C，使其在低温环境中生长良好；(2)按常规方法将筛选出的淀粉酶产生菌在14 20°C逐级扩大培养，制备成液体一级 种子和二级种子；(3)将液体一级种子或二级种子，按发酵液体积的2 8%接种量接入产酶培养基中， 在14 20°C培养48 144h时，即微生物发酵生产低温淀粉酶结束；(4)将(3)的发酵液在4，000 8，OOOrpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶液；(5)根据不同需要和使用对象不同，将(4)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备 成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其中菌种低温驯化培养基、液体种子培养基、产酶培养 基分别为(1)菌种低温驯化培养基淀粉10.0 20. 0g，蛋白胨10. 0 20. 0g, NaCl 7. 0 12. Og,琼脂20. Og,蒸馏水1. 0L, pH值7. 0 7. 6，121°C高压蒸气灭菌30min。(2)液体种子培养基淀粉5.0 8. 0g，牛肉膏2. 0 4. 0g, NaCl 5. 0 8. 0g, K2SO4 0. 8 1. 2g, CaCl2 0. 1 0. 2g, ZnSO4 · 7H20 1. 2mg, MnSO4 · H2O 1. 6mg,蒸馏水 1. 0L, pH 值 7. 0 7. 6，121°C高压蒸气火菌30min。(3)产酶培养基淀粉12. 0 15. 0g，牛肉膏 3. 0 6. 0g, NaCl 14. 0 20. 0g, K2SO4 2. 0 4. 0g, CaCl2 0. 1 0. 2g, ZnSO4 · 7H20 1. 2mg, MnSO4 · H2O 1. 6mg,蒸馏水 1. 0L, pH 值 7. 0 7. 6，121°C高压蒸气灭菌30min。
全文摘要
本发明所述的一种微生物发酵生产低温淀粉酶的方法是将产生淀粉酶的微生物逐级低温驯化，使其在低温环境中生长良好；将低温驯化后的淀粉酶产生菌在14～20℃逐级扩大培养，按发酵液体积的2～8％接种量接入液体发酵培养基中，在14～20℃培养48～144h时，即微生物发酵生产低温淀粉酶结束；发酵液在4,000～8,000rpm离心收集液体，收集的液体即为粗酶液；根据不同需要和使用对象不同，将粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
文档编号C12N9/24GK102093990SQ201010162660
公开日2011年6月15日 申请日期2010年4月9日 优先权日2009年12月11日
发明者张庆芳, 王鑫, 迟乃玉 申请人:大连大学