明提供的试剂组分及提取方法可用于唾液样本中人类 疱疹病毒的核酸提取，提取产物可直接用于后续LAMP扩增反应。
[0080] 实施例3、提取鸭瘟病毒核酸
[0081] -、试剂盒的制备
[0082]分别制备三个试剂盒，每个试剂盒由独立包装的A液和B液组成。
[0083] 试剂盒V中，A液为含有0. lmol/L氢氧化钠和0.01m〇l/L二硫苏糖醇的水溶液，B液 为含有50g/L海藻糖和50g/L甘露醇的水溶液。
[0084] 试剂盒VI中，A液为含有0.25m〇VL氢氧化钠和〇.〇3m〇VL二硫苏糖醇的水溶液，B 液为含有90g/L海藻糖和70g/L甘露醇的水溶液。
[0085] 试剂盒W中，A液为含有0.5mol/L氢氧化钠和0. lmol/L二硫苏糖醇的水溶液，B液 为含有200g/L海藻糖和200g/L甘露醇的水溶液。
[0086]二、试剂盒的应用 [0087] 1、制备待测样本液
[0088]取浓度为IX 108个拷贝/ml的鸭瘟病毒原液，用无菌水稀释至1000倍体积，作为待 测样本液。
[0089] 2、将10yL试剂盒V中的A液与90yL待测样本液混合，65°C静置反应30min，得到反 应体系V ;将10yL试剂盒VI中的A液与90yL待测样本液混合，65 °C静置反应30min，得到反应 体系VI;将l〇yL试剂盒W中的A液与90yL待测样本液混合，65°C静置反应30min，得到反应体 系W〇
[0090] 3、将3体积份反应体系V与2体积份试剂盒V中的B液混合，得到核酸提取液V ;将 3体积份反应体系VI与2体积份试剂盒VI中的B液混合，得到核酸提取液VI;将3体积份反应 体系W与2体积份试剂盒W中的B液混合，得到核酸提取液W。
[0091] 4、取4yL步骤3得到的核酸提取液（核酸提取液V、核酸提取液VI或核酸提取液 VH)，与21yL PCR扩增试剂混匀，然后进行荧光定量PCR反应(反应条件:94°C2min; 94°C 15s、 55 °C 30s，40 个循环）。
[0092] PCR扩增试剂为广州维伯鑫生物科技有限公司的"鸭瘟病毒(DPV)核酸检测试剂盒 (PCR-荧光探针法)"中的组件。
[0093]采用每个试剂盒时设置三个重复处理。
[0094]结果如图3所示，用试剂盒V得到的测试结果为图3(a)，用试剂盒VI得到的测试结 果为图3(b)，用试剂盒W得到的测试结果为图3(c)。三组实验Ct值有明显梯度，每组样本检 测曲线的重复性，斜率基本一致且扩增效率高，本发明试剂组分及其提取方法可以对不同 浓度的鸭瘟病毒进行准确的定量。
[0095]实施例4、从唾液中提取人类疱疹病毒核酸 [0096] 一、试剂盒的制备 [0097]试剂盒包括A管和B管。
[0098] 制备试剂盒珊，由A管和B管组成。
[0099] A管：将8yL的A液(A液为含有0.25mol/L氢氧化钠和0.03mol/L二硫苏糖醇的水溶 液)加入1.5ml EP管中，然后干燥至无水，得到含有2 X ΙΟΛιοΙ氢氧化钠和0.24 X ΙΟΛιοΙ二 硫苏糖醇的1.5ml ΕΡ管。
[0100] B管：将12yL的B液(B液为含有90gAJ!藻糖和70g//L甘露醇的水溶液）加入1.5ml EP管中，然后干燥至无水，得到含有1.08 X 10-3g海藻糖和0.84 X 10-3g甘露醇的1.5ml EP 管。
[0101] 二、试剂盒的应用
[0102] 1、已经医院确诊感染人类疱疹病毒第四型(Epstein-Barr virus)的患者(知情同 意的志愿者），取唾液。
[0103] 2、取80μ1唾液，加入A管中，65 °C静置反应30min。
[0104] 3、完成步骤2后，吸取A管中的所有液相，加入B管中，充分混匀。
[0105] 4、完成步骤3后，取B管中的所有液相，与等温扩增试剂混合(B管中的所有液相与 等温扩增试剂的体积比为3:2)，然后注入到预先包埋人疱疹病毒4型引物的微流控芯片内， 然后将芯片放入恒温扩增微流控芯片核酸分析仪内，完成扩增反应。
[0106] 等温扩增试剂，参见文献"Rapid detection of Epstein-Barr virus DNA by loop-mediated isothermal amplification method"，Seiko Iwata,Yukiko Shibata, Jun-ichi Kawada,Shinya Hara,Yukihiro Nishiyama,Tsuneo Morishima,Masaru Ihira, Tetsushi Yoshikawa,Yoshizo Asano,Hiroshi Kimura,Journal of Clinical Virology 37(2006)128-133。
[0107] 人疱疫病毒4型引物，参见文献"Rapid detection of Epstein-Barr virus DNA by loop-mediated isothermal amplification method"，Seiko Iwata,Yukiko Shibata, Jun-ichi Kawada,Shinya Hara,Yukihiro Ni shiyama,T suneo Mori shima,Masaru Ihira， Tetsushi Yoshikawa,Yoshizo Asano,Hiroshi Kimura，Journal of Clinical Virology 37(2006)128-133。
[0108] 微流控芯片，参见实用新型专利"多指标检测的微流控芯片"（申请日： CN201420103225.5;公开（公告）号：CN 203750554U)。
[0109] 恒温扩增微流控芯片核酸分析仪:晶芯⑧RTisochipTM-A恒温扩增微流控芯片核酸 分析仪，博奥生物集团有限公司。
[0110] 扩增反应的条件:65°C，60min。 Com]进行三次重复试验。
[0112]结果见图4。结果表明，本发明提供的试剂组分及提取方法可用于唾液样本中人类 疱疹病毒的核酸提取，提取产物可直接用于后续LAMP扩增反应。
【主权项】
1. 一种核酸提取方法，包括如下步骤： (1) 取样本液，与A组分混合并反应，形成反应体系；所述A组分包括氢氧化钠和二硫苏 糖醇； (2) 完成步骤(1)后，取反应体系，与B组分混合，得到核酸提取物;所述B组分为B-1组分 或B-2组分;所述B-1组分包括硫酸氢钠;所述B-2组分包括海藻糖和甘露醇。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤（1)的所述反应中，氢氧化钠的浓度 为0 · Olmol/L-O · 05mol/L，二硫苏糖醇的浓度为0 · OOlmol/L-O · Olmol/L。3. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于： 所述A组分由氢氧化钠和二硫苏糖醇组成； 所述B-1组分为硫酸氢钠； 所述B-2组分由海藻糖和甘露醇组成。4. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于： 所述A组分为含有氢氧化钠和二硫苏糖醇的水溶液； 所述B-1组分为硫酸氢钠水溶液； 所述B-2组分为含有海藻糖和甘露醇的水溶液。5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于： 所述步骤(1)中，1体积份A组分与9体积份样本液混合； 所述步骤(2)中，3体积份反应体系与2体积份B组分混合。6. 如权利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于： 所述步骤(2)的所述混合后，硫酸氢钠的浓度为0.0044mol/L-0.32mol/L。7. 如权利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于： 所述步骤(2)的所述混合后，海藻糖的浓度为13.5g/L-80g/L，甘露醇的浓度为10.5g/ L_80g/L。8. 如权利要求1至7中任一所述的方法，其特征在于： 所述步骤(1)中，所述反应的温度为如下(bl)或(b2): (bl)温度为 20°C_105°C; 化2)温度为50°〇75°(：。9. 如权利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于： 所述样本液为动物体液和/或微生物培养物； 所述核酸提取方法为提取微生物和/或动物核酸的方法。10. -种用于生物核酸提取的试剂盒，包括A组分和B组分； 所述A组分包括氢氧化钠和二硫苏糖醇； 所述B组分为B-1组分或B-2组分;所述B-1组分包括硫酸氢钠;所述B-2组分包括海藻糖 和甘露醇。11. 权利要求10所述试剂盒在提取生物核酸中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种核酸提取方法及其专用试剂盒。本发明提供的方法包括如下步骤：(1)取样本液，与A组分混合并反应；A组分包括氢氧化钠和二硫苏糖醇；(2)取反应体系，与B组分混合，得到核酸提取物；B组分为B-1组分或B-2组分；B-1组分包括硫酸氢钠；B-2组分包括海藻糖和甘露醇。本发明提供的试剂盒，包括A组分和B组分；A组分包括氢氧化钠和二硫苏糖醇；B组分为B-1组分或B-2组分；B-1组分包括硫酸氢钠；B-2组分包括海藻糖和甘露醇。本发明提供的方法具有如下优点：步骤简单；成本低廉；反应条件温和；试剂保存容易；所得到的核酸提取物无需纯化步骤即可应用于后续扩增反应，几乎不会造成核酸的损失，便于集成到微流控芯片内。
【IPC分类】C12N15/10
【公开号】CN105567676
【申请号】CN201610069995
【发明人】王磊, 陈翔, 邢婉丽, 程京, 周峣, 林明仙, 张闻天, 王东
【申请人】博奥生物集团有限公司
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2016年2月1日