利用cDNA-AFLP体系挖掘荻耐盐基因的方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及一种适用于能源作物——荻耐盐基因挖掘的cDNA-AFLP体系构建方法。具体来讲取不同耐盐荻资源根系、叶片，及时提取其RNA并进行双链cDNA的合成及纯化，利用EcoRI及MseI内切酶对获得的双链cDNA进行限制性酶切并连接接头，然后进行预扩增和选择性扩增，利用变性聚丙烯酰胺凝胶对反应产物进行电泳，银染后拍照分析扩增产物多态性及不同耐性材料的差异条带，并通过对差异条带的回收、克隆、测序分析，挖掘能源作物——荻的耐盐基因。通过建立荻cDNA-AFLP体系，不需要预先知道任何序列信息，且多态性强，假阳性低，速度快，解决目前荻无该体系的问题，拓宽了其分子标记辅助育种的思路和领域，扩展了基因挖掘的方式。
[0002]属于分子生物学领域。
【背景技术】
[0003]能源是社会经济发展的重要保证，开发利用不会对环境带来危害的可再生能源资源，是解决目前过度依赖化石能源、降低环境污染的重要手段，对于目前我国乃至全球的可持续健康发展均有重要的意义。2007年中央一号文件明确指出，鼓励有条件的地方利用边际土壤，发展生物质原料作物栽培种植。盐胁迫是影响植物生长发育的重要胁迫因子，是限制我国盐碱地高效利用的关键因子，而耐盐材料的选育和利用将对盐碱地高效利用和可持续发展具有重要意义。
[0004]荻(M.saccharif lora(Maxim.)Nakai)为禾本科芒属(M.Anderss.)广布种，多年生高大C4草本，原产于东亚，我国是芒属植物资源的分布中心(陈守良等，中国植物志，1997，10(2): 19)。由于其作为能源植物所具有的经济、高效和可持续性，越来越受到重视并已在欧美等发达国家得到了深入发展而由于目前生产上常用的奇岗(Miscanthus xgiganteus)等材料的耐盐性相对有限，极大影响了其在盐碱地的栽培应用。已有研究表明，转高效耐盐基因的分子育种对提高植物耐盐性有积极作用。而作为我国资源丰富的本土植物，分析不同耐盐材料在基因表达方面的差异，挖掘耐性材料中有效的耐盐基因，对于后续材料的耐盐持续改良和分子育种显得尤为重要。
[0005]分子标记技术是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映，是植物遗传育种领域内一种新的技术手段。AFLP技术是种高效的分子标记技术，其基本原理是对基因组DNA的酶切片段进行选择性扩增，基因组DNA先用限制性内切酶完全消化，酶切片段与特定的人工接头相连接，作为扩增的模板，接头序列和邻近的限制性酶切位点序列作为引物结合位点，然后用特定的引物进行PCR扩增。它结合了RFLP和PCR技术特点，具有RFLP技术的可靠性和PCR技术的高效性，可在一次单个反应中检测到大量的片段，可以说AFLP技术是一种具有很大功能的DNA指纹技术。
[0006]cDNA-AFLP技术结合了RT-PCR和AFLP技术的优点，较传统的AFLP技术，cDNA-AFLP以纯化的mRNA为模板，反转录合成cDNA。进而借鉴AFLP的方法，用识别序列分别为6_bp和4-bp的两种限制性内切酶酶切双链cDNA，酶切片段与人工接头连接后，利用与接头序列互补的引物进行预扩增和选择性扩增，扩增产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳显示。cDNA-AFLP不需要预先知道任何序列信息，且多态性强，本低，速度快，更适合对生物体转录组进行全面分析。然而cDNA-AFLP技术流程复杂，操作繁琐，技术要求高，尤其是扩增引物的设计常常需要根据植物种类的不同而有所差异，同时在试验过程中的反应体系内Mg2+和dNTPs的含量和比例更会直接影响实验的结果，需要不断进行引物组合的筛选和反应体系的优化，工作量巨大，从而导致开发特定植物适合的cDNA-AFLP体系的过程极其困难，限制了 cDNA-AFLP技术在植物研究领域的应用。而在荻研究方面，还未见有关其cDNA-AFLP体系建立的报道。
[0007]因此，根据能源作物——荻的表达特点，开发荻特有且成熟的cDNA-AFLP技术体系，将会对荻重要基因的发掘、克隆及分子标记辅助选择育种及比较基因组学研究等起到重要推动作用。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是建立能源作物——荻成熟cDNA-AFLP技术体系，该体系具有重复性好、多态性丰富、适合荻不同部位的特点，为能源作物荻重要耐盐基因的发掘、克隆及分子标记辅助选择育种及比较基因组学研究等提供了新的方法。
[0009]本发明提供的能源作物——荻cDNA-AFLP技术体系挖掘耐盐基因的具体步骤如下:
分别采集正常生长及盐胁迫下荻的叶和根，用锡箔纸包裹后立刻置于液氮罐里进行速冻，然后利用Trizol试剂提取采集材料的总RNA。提取样品总RNA并纯化后，做DNA消化，然后用琼脂糖凝胶电泳进行RNA质量检测，根据检测结果将提取的材料总RNA稀释成100ng/ μ?浓度后，以总RNA为模板合成双链cDNA，然后用识别序列分别为6bp和4bp的两种限制性内切酶酶切双链cDNA，酶切后的片段两端与相应的限制性内切酶接头序列进行连接，利用与限制性内切酶接头序列互补的引物进行预扩增，再以预扩增引物为模板进行选择性扩增，反应结束后，采用变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，电泳结束后，采用银染法染色，获得盐胁迫下荻的差异表达基因的差异片段，回收差异片段二次扩增后进行克隆及测序，从而获得盐胁迫下荻差异表达基因。
[0010]其中所述的cDNA双链合成主要利用cDNA第一链的合成试剂盒进行第一链的合成，cDNA第二链的合成使用DNA polymerasel和RNase H进行。
[0011 ]其中所述的识别序列为6bp的限制性内切酶为EcoRI限制性内切酶，酶切反应按照内切酶说明书进行;识别序列为4bp的限制性内切酶为MseI限制性内切酶，酶切反应按照内切酶说明书进行。
[0012]其中所述的EcoRI限制性内切酶所述的接头序列为SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2，MseI限制性内切酶接头序列为SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4。酶切产物的连接反应体系按照说明书进行。
[0013]其中所述的EcoRI限制性内切酶接头序列互补的预扩增引物序列为E00:SEQ IDN0.5，MseI限制性内切酶接头序列互补的预扩增引物序列为M00:SEQ ID N0.6。预扩增反应体系及程序如下:CldH2O 9.7μ1,Buffer 2μ1，dNTPs( 10Mm/l )0.6μ1，E00(50ng/yl )0.7μ1，M00(50ngAil)0.7μ1，Tag聚合酶(5ιι/μ1)0.Ιμ?，已连接的模板(1: 10)5μ1，MgCl2(25mM/l)
1.2μ1，反应总体积20μ1，混匀，稍离心，进行PCR扩增反应。扩增程序为94°C2min ； 94°C30s，56°C30s，72°C60s，共30个循环;72°C10min。反应结束后取5μ1，用1.0%的琼脂糖检测。
[0014]其中所述的选择性扩增引物为EcoRI限制性内切酶选择性引物一条，MseI限制性内切酶选择性引物一条。EcoRI限制性内切酶选择性引物选自E-AAC:SEQ ID N0.7,E-AAG:SEQ ID N0.8,E-ACA:SEQ ID N0.9,E-ACT:SEQ ID N0.10,E-ACC:SEQ ID N0.11,E-ACG:SEQID N0.12，E-AGC:SEQ ID N0.13,E-AGG:SEQ ID N0.14中的任意一条;所述的MseI限制性内切酶选择性引物选自M-CAA:SEQ ID N0.15,M-CAC:SEQ ID N0.16,M-CAG:SEQ ID N0.17,M-CAT:SEQ ID N0.18,M-CTA:SEQ ID N0.19,M-CTC:SEQ ID N0.20,M-CTG:SEQ ID N0.21,M-CTT:SEQ ID N0.22中的任意一条。
[0015]其中所述的选择性扩增反应程序如下:根据荻转录组特点，将预扩增产物稀释100倍后进行扩增，反应体系及程序如下:ddH20 3.425μ1，Buffer Ιμ?，dNTPs( 10Mm/l) I.5μ1，E-NNN (50ng/yl，具体为SEQ ID N0.7-14中的一条)0.5μ1，M—NNN (50ng/yl，具体为SEQID 吣.15-22中的一条)0.5口1，了&8聚合酶