乙型肝炎病毒表面抗原的表位及其用途
【专利摘要】公开了乙型肝炎病毒(HBV)特异性表位及其用途。所公开的表位是其上不发生突变的保守位置，因此，包含对针对上述表位之抗体的组合物或者包含所述表位的疫苗组合物由于HBV突变而引起治疗效力降低的可能性非常低，因此对于HBV治疗非常有用。
【专利说明】乙型肝炎病毒表面抗原的表位及其用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及乙型肝炎病毒OfepatitiS B virus)(下文中称为“HBV”)特异性表位及其用途。由于本文中公开的表位是其上不发生因突变(“突变发生”)引起之修饰的保守位置，所以包含针对所述表位之抗体的组合物或包含上述表位的疫苗组合物由于JBV突变而引起治疗效力降低的可能性非常低，因此对于HBV治疗非常有用。
[0002]本发明还涉及用于产生针对上述表位之抗原特异抗体的方法，并且根据本发明产生的针对所述表位的这种抗原特异抗体在体内施用后显示出优秀的特异性。
【背景技术】
[0003]HBV是具有DNA基因组的病毒，属于嗜肝DNA病毒科Ofepadnaviridae)，并引起急性和/或慢性肝炎。通常，HBV分为8种基因型，这些基因型具有彼此之间至少8%不同的基因序列，或者基于HBV表面抗原(HBV surface antigen,HBsAg)的两个抗原决定簇(即，表位)(d/y、w/r)而分为9种血清型(即，adw、adr、ayw、ayr等)。全世界有3.5亿人已感染慢性HBV，特别地，韩国和中国的人口中约5%至8%具有慢性HBV感染。HBV感染是这些区域中肝疾病和肝癌的主要病因。目前，虽然可通过开发疫苗而在一定程度上提供针对上述感染的保护，但许多患者仍患有由HBV引起的慢性乙型肝炎感染。HBV引起的慢性感染可引起肝炎以及肝硬化和肝癌，并且，与未感染的人相比，具有慢性感染的人示出升高约300倍的肝癌。根据WHO的调查，慢性乙型肝炎被认为是约80%肝癌的主要病因。
[0004]最近开发的作为核苷类似物并且可市购的慢性乙型肝炎药物可包括例如拉米夫定、阿德福韦酯(adefovir dipivoxil)等。这些药物可干扰HBV聚合酶的逆转录酶,进而抑制HBV DNA复制 。然而，在上述的药物中的任何一个在长期(例如3年)施用的情况下，约75%的患者具有药物抗性病毒，因而引起治疗效力降低的问题。为了防止垂直传递(vertical transmission)或肝移植后的感染，上述药物通常与乙型肝炎免疫球蛋白(hepatitis B immunoglobulin, HBIG) 一起使用。
[0005]目前,HBIG通过离子交换纯化和病毒灭活来从具有高抗HBsAg抗体滴度之供体的血浆中制备。
[0006]然而，目前可用的HBIG不是治疗性抗体的理想来源，这是因为其有限的可获得性、较低的比活性和可能的传染性病原体污染。
[0007]已知通过目前在本领域中使用的疫苗在体内产生的抗体主要为识别HBV之表位的抗体。然而最近报道了逃避此类抗体的突变体，例如在HBsAg的第145位用精氨酸替换甘氨酸而产生的G145R突变体。另外，已发现多种逃避突变体，因此，现有的HBV药物在产生满意的治疗效力上是受限的。因此，对于与表位特异性结合的HBV治疗抗体和/或HBV疫苗有提高的需要，所述表位对应于与JfflV复制相关的对HBV之存活必须的位点并且不引起突变，因此不引起由于突变而导致的治疗效力降低。
【发明内容】
[0008]技术问题
[0009]为了解决上述问题，本发明提供了包含RFLWE (SEQ ID NO:4)或KFLWE (SEQID NO:5)的HBV特异性表位，特别是具有例如FARFLWEWASVRFSW(SEQ ID NO:6)或FGKFLffEffASARFSff (SEQ ID NO:7)之氨基酸序列的表位，所述表位是对于HBV之存活所必须的位点，因此对应于其上不发生突变的保守位置。
[0010]本发明的另一个目的是提供这样的方法，其用于产生上述表位、包含所述表位的HBV疫苗组合物或者疫苗和通过应用上述表位能够与所述表位特异性结合的抗体、以及包含如上所产生之抗体的HBV治疗组合物或治疗剂。
[0011]本发明的另一个目的是提供用于HBV检测的组合物或试剂盒，其具有上述表位或者编码所述表位的多核苷酸序列。
[0012]问题的解决方案
[0013]本发明的发明人已发现，与HBV表面抗原特异性结合的人抗体(参见PCT/KR2010/004445，下文中称为“本发明抗体”)的表位对应于包含RFLWE(SEQ ID NO:4)或 KFLWE (SEQ ID NO:5)的序列，特别是衍生自 FARFLWEWASVRFSW(SEQ ID NO:6)或FGKFLffEffASARFSff (SEQ ID NO:7)的序列或其一部分，并且这样的表位位点有利地是保守的，对于HBV复制具有重要意义并且对于HBV存活是必须的。因此，在上述发现的基础上完成了本发明。在上述表位中，具有SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.6的表位是HBV之adr亚型(SEQ ID NO:1)的表位，而具有SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.7的表位对应于HBV之ayw亚型(SEQ ID NO:2)的表位。
[0014]根据本发明的由SEQ ID N0.4至7中任一种所定义的HBV特异性表位可保留三维结构或者可作为与载体缀合的形式来使用以在用于组合物(例如疫苗)时提高效率。本文中使用的载体可包括可生物利用并且实现本发明之期望作用的任一种载体，并且选自:肽、血清白蛋白、免疫球蛋白、血蓝蛋白(hemocyanin)、多糖等,但不特别地限于这些。
[0015]由SEQ ID N0.4至7中任一种所定义的HBV特异性表位本身或者其与载体组合的复合物可用作用于HBV治疗的疫苗组合物。在这一方面，所述疫苗组合物还可包含可药用佐剂或赋形剂。这样的佐剂有助于通过体内注射所述佐剂形成抗体，并且可包含能够实现本发明之目的的任一种佐剂，更特别地，选自以下的至少一种:铝盐(A1(0H)3、ALPO4)、角S烯、山梨聚糖(sorbitane)、聚山梨酯80、CpG、脂质体、胆固醇、单磷酰脂质Mmonophosphoryl lipid,MPL)和吡喃葡萄糖基脂质A(glucopyranosyl lipid,GLA),但不特别地限于这些。
[0016]根据本发明提供的编码由SEQ ID N0.4至7所定义的HBV特异性表位的多核苷酸可用作DNA疫苗。在此，可使用多核苷酸本身(没有任何载体)或者装载于病毒或非病毒载体中。本文中使用的病毒或非病毒载体可包括本领域(本发明所属领域)中通常可用的任一种。所述病毒载体优选地包括腺病毒、腺相关病毒、慢病毒(Ientivirus)、逆转录病毒(Ietrovirus)等，而所述非病毒载体可包括阳离子聚合物、非离子聚合物、脂质体、脂质、磷月旨、亲水性聚合物、疏水性聚合物以及选自上述材料之至少一种的组合，但不特别地限于这些 。
[0017]本发明提供:重组载体，其包含编码由根据本发明的由SEQ ID N0.4至7中任一种所定义之HBV特异性表位的多核苷酸、包含所述重组载体的宿主细胞、以及使用上述重组载体或宿主细胞产生根据本发明的由SEQ ID N0.4至7中任一种所定义之HBV特异性表位的方法。
[0018]在本发明中，“重组载体”是从合适的宿主细胞中表达目标蛋白质的表达载体，其是含有必需调节元件的基因产物，所述调节元件与基因插入片段可操作地相连接以表达所述基因插入片段。在本发明中，术语“可操作地相连接”是指核酸表达调控序列与编码目标蛋白质的核酸序列功能性地相连接，从而执行一般功能。与重组载体的可操作连接可以通过本发明所属领域中公知的基因重组技术来进行。位点特异性DNA切割和连接还可使用本发明所属领域中通常已知的酶来容易地进行。
[0019]可用于本发明的合适的表达载体可包含用于膜靶向或分泌的信号序列以及表达调控元件(例如启动子、起始密码子、终止密码子、聚腺苷酸化信号、增强子等)。起始密码子和终止密码子一般被认为是编码免疫原性目标蛋白质之核苷酸序列的一部分，并且当施用基因产物时必须在个体中表现出作用并且在编码序列的框内(in-frame)。一般的启动子可以是结构型或者诱导型的。原核细胞可包含例如lac、tac、T3和17启动子,但不特别地限于这些。真核细胞可包含例如猴病毒40 (monkey virus40, SV40);小鼠乳腺肿瘤病毒(mouse breast tumor virus, MMTV)启动子；人类免疫缺陷病毒(human immunitydeficient virus,HIV),特别是HIV 的长末端重复序列(long terminal repeat,LTR)启动子；莫洛尼病毒(Moloney virus)、巨细胞病毒(cytomegalovirus, CMV)、ElB 病毒(Epsteinbar virus, EBV)、劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus, RSV)启动子；以及(6-肌动蛋白启动子；人血红蛋白、人肌肉肌酸、人金属硫蛋白衍生的启动子；但不特别地限于这些。
[0020]表达载体可包含选择标记以选择含有载体的宿主细胞。选择标记用于分选转化有载体的细胞，并且可包含 提供选择性表型(例如药物抗性、营养需求、细胞毒性的耐受、表面蛋白质的表达等)的标记。由于在选择剂处理的条件下只有表达选择标记的细胞存活，所以可筛选经转化的细胞。对于可复制的表达载体，该载体可具有作为复制在该处起始之特定核酸序列的复制起始点。表达的重组载体可以包括多种载体，例如质粒、病毒、黏粒等。重组载体并不特别地限于这些，只要多种原核和真核宿主细胞表达期望的基因并产生期望的蛋白即可，然而，优选产生大量与天然蛋白质相似的外源蛋白质的载体，其具有强活性的启动子，从而获得强表达。
[0021]特别地，为了表达由SEQ ID N0.4至7中任一种所定义的HBV特异性表位，可使用多种表达宿主-载体组合。适用于真核生物的表达载体可包含来自例如SV40、牛乳头瘤病毒、腺病毒、腺相关病毒、巨细胞病毒、慢病毒和/或逆转录病毒(不特别地限定于这些)的表达调控序列。用于细菌宿主的表达载体可包括例如:从大肠杆菌获得的细菌质粒，例如pET、pRSET、pBluescript、pGEX2T、pUC载体、col El、pCRl、pBR322、pMB9、及其衍生物；质粒，例如具有广泛宿主的RP4 ;嗤菌体DNA，例如多种\噬菌体衍生物例如\ gtlO和\ gtll、NM980等；其他DNA噬菌体，例如单链丝(filament)型DNA噬菌体，M13等。可用于昆虫细胞的载体可以是PVL941。
[0022]重组载体插入宿主细胞以形成转化体，并且本文中适用的宿主细胞可包括例如:原核生物，例如大肠杆菌、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、链霉菌属(Streptomycessp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)或葡萄球菌属(Staphylococcus sp.);真菌，例如曲霉属(Aspergillus sp.);酵母，例如巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces sp.)、粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)等；真核细胞，例如低等真核细胞、高等真核细胞(即，昆虫细胞)等。宿主细胞优选地来自植物和/或哺乳动物，特别是来自猴肾细胞7 (monkey kidney cell7，C0S7)、NS0细胞，SP2/0、中国仓鼠卵巢(Chinesehamster ovary, CHO)细胞、W138、幼仓鼠肾(BHK)细胞、MDCK、骨髓瘤细胞系、HuT 78细胞和/或HEK293细胞，但不特别地限于这些。最优选地，使用CHO细胞。 [0023]在本发明中，术语“转化到宿主细胞中”包括任何用于将核酸引入到有机体、细胞、组织和/或器官，并且如现有技术中公知的，可以根据用于进行转化的宿主细胞合适地选择标准的技术。这样的技术包括电穿孔、原生质融合、磷酸钙(CaPO4)沉淀、氯化钙(CaCl2)沉淀、使用碳化娃纤维震荡(agitation)、农杆菌(agro-bacteria)介导的转化、PEG、硫酸葡聚糖和脂质转染胺(lipofectamine)介导的转化、以及通过干燥/抑制，但不特别地限于这些。通过在培养基中孵育转化体(其中表达重组载体)，可大量形成由SEQ ID N0.4至7中任一种所定义的HBV特异性表位。培养基和培养条件可适宜地选自根据所使用的宿主细胞通常使用的那些。在培养期间，可控制一些条件(例如温度、培养基的pH、培养时间等)以使其适于细胞生长和蛋白质的大量产生。如上所述，可通过重组方式从培养基或细胞分解产物中收集由SEQ ID N0.4至7中任一种所定义的HBV特异性表位，并通过任何常规生化分离技术进行分离或纯化(Sambrook et al., Molecular Cloning:A LaboratoryManual,2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) ；Deuscher, M., Guide toProtein Purification Methods Enzymology,Vol.182.Academic Press,Inc.,San Diego,CA(1990))?出于这一目的，可使用多种方法，例如电泳、离心、凝胶过滤、沉淀、透析、色谱(离子交换色谱、亲和色谱、免疫吸附色谱、尺寸排阻色谱等)、等电点聚焦、及其多种变化形式和组合，但不特别地限于这些。
[0024]本发明提供了用于在微生物或病毒表面上表达由SEQ ID N0.4至7中任一种所定义的的HBV特异性表位的方法。在这种情况下，可使用包含编码诱导型启动子或信号蛋白之序列的重组载体，以及具有上述重组载体的多种微生物或病毒。更特别地，重组的大肠杆菌、酵母和/或噬菌体是合适的微生物和/或病毒，但不特别地限于这些。为了在上述微生物或病毒表面上表达由SEQ ID N0.4至7中任一种所定义的HBV特异性表位，可使用本发明所属领域中公知的展示技术。特别地，编码由SEQ ID N0.4至7中任一种所定义之HBV特异性表位的多核苷酸序列可与编码启动子或信号蛋白(引起在微生物或病毒表面上表达)的序列相组合(或相结合)，从而表达所述HBV特异性表位。或者，缺失编码表面表达蛋白质的基因位点的一部分之后，编码由SEQ ID N0.4至7中任一种所定义之HBV特异性表位的多核苷酸序列可插入到被缺失的部分中。然而，本发明并不特别地限于上述方法。根据上述方法，在微生物或病毒表面上表达的由SEQ ID N0.4至7中任一种所定义之HBV特异性表位可如此地分离并用于根据本发明的期望用途。另外，本发明的表位可用于筛选与在表面上表达的由SEQ ID N0.4至7中任一种所定义之HBV特异性表位特异性结合的抗体，随后获得经筛选的抗体。
[0025]此外，本发明提供用于产生与由SEQ ID N0.4至7中任一种所定义之HBV特异性表位特异性结合的抗体或者所述抗体之片段的方法，其包括使用由SEQ ID N0.4至7中任一种所定义的HBV特异性表位、含有上述表位的复合物或编码上述表位的多核苷酸。这样的抗体可以是多克隆抗体或者单克隆抗体，只要其片段具有与由SEQ ID N0.4至7中任一种所定义之HBV特异性表位相结合的特征即可，它们也被包括在本发明的范围内。更特别地，本发明的抗体或其片段可包括例如单链抗体、双链抗体(diabody)、三链抗体(triabody)、四链抗体(triabody)、Fab片段、F (ab’)2片段、Fd、scFv、结构域抗体、双特异性抗体、微抗体(minibody)、scap、IgD 抗体、IgE 抗体、IgM 抗体、IgGl 抗体、IgG2 抗体、IgG3 抗体、IgG4 抗体、抗体非可变区的衍生物、以及基于蛋白质支架的合成抗体，其均具有与由SEQ ID N0.4至7中任一种所定义之HBV特异性表位相结合的能力，但不特别地限于这些。只要保留本发明抗体的特征，在可变区突变的抗体也包括在本发明的范围内。这可由在可变区中氨基酸的保守替换来示例。
[0026]在此，这样的“保守替换”通常是指将氨基酸替换成与原氨基酸序列具有相似性质的其他氨基酸残基。例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸具有碱性侧链，进而显示出相似的性质。另一方面，天冬氨酸和谷氨酸二者均具有酸性侧链，并表现出彼此相似的性质。此外，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸和色氨酸是彼此相似的，因为它们具有不带电的极性侧链，而丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸是彼此相似的，因为它们具有非极性侧链。此外，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和组氨酸是彼此相似，因为它们具有芳香族侧链。因此，对于本领域的技术人员来说显而易见的是，即使发生任一上述具有类似特性之组内的氨基酸替换，可不会发现显著的特征改变。因此，如果保留本发明之抗体的特定性质，用于产生具有由于在可变区的保守替换而突变的抗体的方法也被包括在本发明的范围内。
[0027]可以通过本领域(本发明所属领域)中已知的任何常规方法来制备与由SEQ IDN0.4至7中任一种所定义之 HBV特异性表位相结合的抗体。更特别地，在用由SEQ ID N0.4至7中任一种所定义之HBV特异性表位、包含所述表位的复合物或者编码上述表位的多核苷酸接种动物之后，从经接种的动物中产生和筛选与由SEQ ID N0.4至7中任一种所定义之HBV特异性表位特异性结合的抗体，进而是可获得的。
[0028]本文中使用的动物可包括转基因动物，特别是能够产生与来自人之序列相同的抗体的转基因小鼠。所谓的完全人抗体具有降低的免疫原性，其使用转基因小鼠获得，可根据美国专利N0.5，569，825,5, 633，425和7，501，552等中公开的任一方法来产生。在上述动物未被优选地转化以允许产生与来自人之序列相同的抗体的情况下，可进一步根据美国专利 N0.5，225，539,5, 859，205,6, 632，927,5, 693，762,6, 054，297,6, 407，213、以及 WO 公开专利N0.1998/52976中公开的任一方法使用从动物获得的抗体来实施人源化或去免疫化过程，从而合适地处理待用于体内治疗的抗体。更特别地，这样的人源化或去免疫化可包括CDR移植，以将从动物产生的抗体的CDR序列移植到人抗体的框架中，从而增加亲和力或降低免疫原性，还可包含⑶R-步移过程(⑶R-walking process)来替换、插入和缺失至少一个氨基酸序列。
[0029]除了由SEQ ID N0.4至7中任一种所定义的HBV特异性表位、包含所述表位的复合物和/或编码所述表位的多核苷酸之外，如果使用总HBV作为免疫原，可使用这样的方法:主要筛选(通常为“淘选(panning)”)具有HBV结合能力(有时简称为“结合”)的抗体，然后再在首次筛选出的抗体中淘选特异性地识别由SEQ ID N0.4至7中任一种所定义的HBV特异性表位的抗体。或者，还可使用用于从首次筛选出的HBV结合抗体中筛选抗体的方法，筛选出的抗体在由SEQ ID N0.4至7中任一种所定义之HBV特异性表位的重要位点突变的HBV没有结合或结合降低，其中所述方法包括在由SEQ ID N0.4至7中任一种所定义之HBV特异性表位的重要位点引起突变。
[0030]同时，根据在本领域中公知的展示技术，可以产生和筛选与由SEQ ID N0.4至7中任一种所定义之HBV特异性表位相结合的人抗体。这样的展示技术可选自噬菌体展示、细菌展示或核糖体展示，但不限于这些。文库的产生和展示可根据例如在美国专利N0.5，733，743,7, 063，943,6, 172，197,6, 348，315,6, 589，741 等中公开的常规技术容易地进行。特别地，上述展示中使用的文库可设计成具有来自人之抗体的序列。更特别地，上述方法的特征可在于通过应用由SEQ ID N0.4至7中任一种所定义的HBV特异性表位或包含所述表位的复合物来筛选(或淘选)与由SEQ ID N0.4至7中任一种所定义之HBV特异性表位特异性结合的抗体。
[0031]最后，本发明提供HBV检测组合物或试剂盒，其包含由SEQ ID N0.4至7中任一种所定义的表位、含有所述表位的复合物或者编码所述表位多核苷酸。根据本发明的HBV检测组合物或试剂盒的优点在于能够迅速和精确地诊断HBV感染而不受HBV突变的显著影响。包含由SEQ ID N0.4至7中任一种所定义之表位、包含所述表位之复合物或者编码所述表位之多核苷酸的HBV检测试剂盒可制成应用包括例如以下的多种方法:一般的酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、突光激活细胞分选术(fluorescence-activated cell sorting,FACS)方法等。此外，在使用编码本发明所述特异性表位的多核苷酸的情况下，可通过普通的杂交技术来对杂交进行检测。
[0032]本发明的有利效果
[0033]通过详细的描述而显而易见的是，根据本发明提供的HBV特异性表位基本上是其上不发生突变的保守位置。因此，包含针对上述表位之抗体的组合物或疫苗组合物由于这样的HBV突变而引起 治疗效力降低的可能性非常低，从而有效地用于HBV治疗和/或诊断。
[0034]附图简述
[0035]通过对结合附图而给出的一些优选的实施方案的以下描述，本发明的以上和其他目的、特征和优势将变得显而易见，其中:
[0036]图1举例说明了对HBV表面抗原蛋白突变体的结合能力变化的分析结果，以鉴定本发明抗体的表位；
[0037]图2示出了 HBV表面抗原蛋白中的环结构，其包含本发明的表位；
[0038]图3举例说明了 HBV基因组结构，其中编码表面抗原蛋白的基因组S ORF与编码聚合酶的基因组P ORF部分地相重叠；
[0039]图4举例说明了制备HBV聚合酶突变体的过程；
[0040]图5举例说明了通过同时用HBV Pol-free复制子和HBV聚合酶突变体感染H印G2细胞而进行的互补测试过程；
[0041]图6示出了通过Southern印迹分析的每种HBV聚合酶突变体的HBV复制能力的测试结果(HBV DNA复制中间体(即，在图的右侧的RC、DL、SS DNA)的比较)；
[0042]图7示出了各HBV聚合酶突变体对前基因组RNA包装之影响的测试结果(通过RNA酶保护测定)；以及
[0043]图8示出了在为了在小鼠中产生HBV病毒颗粒的流体动力学注射(hydrodynamicinjection)中使用的HBV基因载体的连锁图。
[0044]本发明的最佳实施方式
[0045]在下文中，将参照实施例来详细地描述本发明的一些优选的实施方案，然而，这样的实施例仅用于举例说明的目的，并不旨在限制本发明的范围。
[0046][表1]-用于表位鉴定的文库的特征
[0047]
【权利要求】
1.乙型肝炎病毒(HBV)特异性表位，其包含RFLWE(SEQ ID NO: 4)和KFLWE (SEQ ID NO:5)。
2.权利要求1所述的表位，其中含有FARFLWEWASVRFSW(SEQID NO:6)或FGKFLffEffASARFSff (SEQ ID NO:7)所示序列。
3.复合物，其包含权利要求1或2所述的HBV特异性表位与载体的组合。
4.权利要求3所述的复合物，其中所述载体是选自以下的至少一种:肽、血清白蛋白、免疫球蛋白、血蓝蛋白和多糖。
5.多核苷酸，其编码权利要求1或2所述的HBV特异性表位。
6.重组载体，其包含权利要求5所述的多核苷酸。
7.权利要求6所述的重组载体，其还包含编码启动子或信号蛋白的序列，所述启动子或信号蛋白引起所述HBV特异性表位在微生物细胞或病毒或哺乳动物细胞的表面上表达。
8.重组微生物或病毒或哺乳动物细胞，其被权利要求6或7所述的重组载体转化。
9.权利要求8所述的重组微生物或病毒或哺乳动物细胞，其中经转化的重组微生物或病毒或哺乳动物细胞选自重组大肠杆菌、重组酵母、重组噬菌体和重组哺乳动物细胞。
10.用于产生由SEQID N0.4至7中任一种所定义之HBV特异性表位的方法，其包括:重组载体，培养权利要求6至9中任一项所述的重组微生物或病毒或重组哺乳动物细胞。
11.疫苗组合物，其包含权利要求1至5中任一项所述的表位、包含所述表位的复合物或者编码所述表位的多核苷酸。
12.权利要求11所述的疫苗组合物，其还包含可药用佐剂以促进体内注射后形成抗体。
13.权利要求12所述的疫苗组合物，其中所述佐剂是选自以下的至少一种:铝盐(Al (OH) 3、ALPO4)、角鲨烯、山梨聚糖、聚山梨酯80、CpG、脂质体、胆固醇、单磷酰脂质A (MPL)和吡喃葡萄糖基脂质A(GLA)。
14.权利要求11所述的疫苗组合物，其中所述多核苷酸包含在可药用载体中。
15.权利要求14所述的疫苗组合物，其中所述可药用载体是病毒载体或非病毒载体。
16.用于产生抗体或抗体片段的方法，所述抗体或抗体片段与由SEQID N0.4至7中任一种所定义的HBV特异性表位特异性结合，所述方法使用由SEQ ID N0.4至7中任一种所定义的HBV特异性表位、包含上述表位的复合物或者编码上述表位的多核苷酸。
17.权利要求16所述的方法，其中所述抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。
18.权利要求16所述的方法，其中通过使用由SEQID N0.4至7中任一种所定义之HBV特异性表位、包含上述表位之复合物或者编码上述表位之多核苷酸的所述抗体产生方法包括:用所述HBV特异性表位、复合物或多核苷酸接种动物；并从经接种的动物中筛选和产生与由SEQ ID N0.4至7中任一种所定义的HBV特异性表位特异性结合的抗体。
19.权利要求18所述的方法，其还包括人源化或去免疫化过程。
20.权利要求19所述的方法，其中所述人源化过程包括将从动物产生之抗体的CDR序列移植至人抗体的FR(框架区)。
21.权利要求20所述的方法，其还包括替换、插入或缺失至少一个氨基酸序列以提高亲和力或降低免疫原性的过程。
22.权利要求18所述的方法，其中所述动物是转基因动物，其能够产生与来自人的序列相同的抗体。
23.权利要求22所述的方法，其中所述转基因动物是转基因小鼠。
24.权利要求16所述的方法，其中使用展示技术。
25.权利要求24所述的方法，其中所述展示技术是选自以下的任一种:噬菌体展示、细菌展示、酵母展示或核糖体展示。
26.权利要求24或25所述的方法，其中用于所述展示技术的文库被设计成具有来自人之抗体的序列。
27.权利要求24至26中任一项所述的方法，其还包括:使用由SEQID N0.4至7中任一种所定义的HBV特异性表位或包含上述表位的复合物来筛选(即，进行淘选)与由SEQID N0.4至7中任一 种所定义的HBV特异性表位特异性结合的抗体。
28.用于HBV检测的组合物，其包含权利要求1至5中任一项所述的表位、包含所述表位的复合物或者编码所述表位的多核苷酸。
29.HBV检测试剂盒，其能够检测权利要求1至5中任一项所述的表位、包含所述表位的复合物或者编码所述表位的多核苷酸。
【文档编号】A61K39/42GK103619870SQ201180071967
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2011年7月25日 优先权日:2011年6月30日
【发明者】金世镐, 洪广元, 辛庸源, 张基奂, 金敏洙, 林正爱 申请人:株式会社绿十字