肽寡核苷酸缀合物的制作方法
【专利摘要】提供了缀合到载体肽上的寡核苷酸类似物。本公开的化合物可用于治疗各种疾病，例如，其中抑制蛋白表达或校正异常mRNA拼接产物可产生有利的治疗效果的疾病。
【专利说明】肽寡核苷酸缀合物
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请根据美国法典第35章第120条要求2011年5月5日申请的第13/101942号美国专利申请和2011年5月13日申请的第13/107528号美国专利申请的权益，这些申请通过引用全部并入本文中。
[0003]背景
【技术领域】[0004]本发明总体涉及可用作反义化合物的寡核苷酸化合物(寡聚物)，更具体地涉及结合到细胞渗透性肽上的寡聚物化合物，以及此类寡聚物化合物在反义应用中的用途。
[0005]相关技术描述
[0006]具有潜在有用生物活性的许多药物的实际效用，常常由于难以将此类药物递送到其靶标而受阻。通常必须将待递送到细胞内的化合物从含大量水的细胞外环境中递送出来，并随后穿透亲脂性细胞膜来进入细胞。除非物质由特定运输机制来主动运输，许多分子，尤其是大分子，要么太过亲脂而不能实际溶解，要么太多亲水而不能穿透膜。
[0007]由氨基酸残基49-57 (Tat49-57，具有序列RKKRRQRRR)组成的HIV Tat蛋白质片段被用来将具有生物活性的肽和蛋白质递送到细胞内(例如Barsoum etal.，1994，PCT Pubn.N0.W094/04686)。Tat (49-60)被用来促进硫代膦酸寡核苷酸的递送(Astriab-Fisher, Sergueev et al.2000;Astriab-Fisher, Sergueev et al.2002)。反向Tat或rTat (57-49) (RRRQRRKKR)被报导相比Tat (49-57)具有改善的递送荧光素到细胞内的效用(ffender, Mitchell et al.2000; Rothbard, Kreider et al.2002)。Rothbard 和Wender还公开了其他富含精氨酸的运输聚合物(第W001/62297号PCT公开；第6306993号美国专利；第2003/0032593号美国专利申请公开)。
[0008]寡核苷酸是一类的潜在有用的药物化合物，其递送常常是治疗使用的一个障碍。就这此而言，已经发现连接有磷酸二酰胺的吗啉代寡聚物(PMOs ;见例如Summerton和Weller, 1997)比诸如硫代磷酸的带电寡核苷酸类似物更具前景。PMOs为水溶性、不带电荷或基本上不带电荷的反义分子，其通过阻止拼接或翻译机构元件的结合或进展来抑制基因表达。还表明PMOs可抑制或阻止病毒复制(Stein, Skilling et al.2001 ;McCaffrey, Meuseet al.2003)。它们对酶消化具有高度抗性(Hudziak, Barofsky et al.1996)。在体外的无细胞和细胞培养模型中(Stein, Foster et al.1997; Summerton和Wellerl997),和在体内的斑马鱼、青娃和海胆胚胎中(Heasman, Kofron et al.2000;Nasevicius和Ekker2000),以及在成年动物模型中，如大鼠、小鼠、兔、狗和猪(见例如Arora和Iversen2000; Qin, Tayloret al.2000;Iversen2001;Kipshidze, Keane et al.2001;Devi2002;Devi, Oldenkamp etal.2002; Kipshidze, Kim et al.2002; Ricker, Mata et al.2002), PMOs 展不了高反义特异性和功效。
[0009]还表明反义PMO寡聚物可被摄入到细胞内，且相比其他广泛使用的反义寡核苷酸，在体内更具一致的有效性和更少的非特异性效应(见例如P.1versen, "PhosphoramiditeMorpholino Oligomers"，in Antisense Drug Technology,S.T.Crookejed.，MarcelDekker, Inc.，New York, 2001)。已经表明PMOs结合到精氨酸富集肽上可增加它们的细胞摄取(见例如，第7468418号美国专利)；然而，该缀合物的毒性减缓了它们作为可行的药物候选物的发展。
[0010]尽管已经取得了明显的进展，本领域仍然存在对具有提高的反义或反基因性能的寡核苷酸缀合物的需要。此类提高的反义或反基因性能包括:低毒性、对DNA和RNA的较强的亲和力而不危害序列选择性；提高的药物代谢动力学和组织分布；提高的细胞递送及可靠和可控的在体内分布。
[0011]发明概述
[0012]本发明的化合物可解决这些问题，并提供超过本领域现存的反义分子的改进。通过由甘氨酸或脯氨酸氨基酸将细胞渗透性肽连接到基本上不带电荷的核酸类似物上，本发明发明人解决了与其他肽寡聚物缀合物相关的毒性问题。此外，亚基间连接和/或末端部分到寡核苷酸类似物的5’和/或3’端的结合的修饰，例如，吗啉代寡核苷酸，还可以提高该缀合物的性能。例如，在某些实施方案中，相比其他的寡核苷酸类似物，本公开的缀合物具有减少的毒性和/或提高的细胞递送、效价和/或组织分布，和/或能被更有效地递送到靶器官。这些优越的性能可产生有利的治疗指标、减少的临床剂量和更低的商品成本。
[0013]因此，在一个实施方案中，本公开提供的缀合物包含:
[0014](a)载体肽，其包含氨基酸亚基；和
[0015](b)核酸类似物，其包含基本上不带电荷的骨架和用于序列特异性结合到靶核酸上的寻祀喊基序列；
[0016]其中:
[0017]两个或更多个的所述氨基酸亚基为带正电荷的氨基酸，所述载体肽包含位于载体肽的羧基端的甘氨酸(G)或脯氨酸(P)，且所述载体肽共价连接至所述核酸类似物。还提供了包含以上缀合物和药学可接受的载体的组合物。
[0018]在另一个实施方案中，本公开提供了抑制蛋白产生的方法，该方法包括将编码该蛋白的核酸暴露于本公开的缀合物。
[0019]本公开的另一方面包括促进将核酸类似物运输到细胞内的方法，该方法包括将权利要求I所述的载体肽结合到核酸类似物上，且其中相对于非缀合形式的核酸类似物，促进了将所述核酸类似物运输到细胞内。
[0020]在另一个实施方案中，本公开针对治疗对象体内疾病的方法，该方法包括将药学有效量公开的缀合物给予到对象。还提供了制备该缀合物的方法、它们的使用方法和可用于结合到核酸类似物上的载体肽。
[0021]通过参考以下的详细描述，本发明的这些和其他的方面会变得显而易见。为了这个目的，本文中陈述了不同的参考文献，它们更加详细地描述了某些背景信息、程序、化合物和/或组合物，且它们中的每一个在此都通过完整引用被进行了并入。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1A显示了包含磷酸二酰胺连接的示例性吗啉代寡聚物结构。
[0023]图1B显示了结合在载体肽5’末端的吗啉代寡聚物。[0024]图1C显示了结合到载体肽3’末端的吗啉代寡聚物。
[0025]图1D-G显示了示例性吗啉代寡核苷酸的重复亚基片段，指定为ID至1G。
[0026]图2描绘了连接到吗啉代一T部分上的示例性亚基间连接。
[0027]图3为显示制备用于固相合成的连接臂的反应路线。
[0028]图4展示了用于寡聚物合成的固相支持体(support)的制备。
[0029]图5A、5B和5C分别显示了，相比小鼠四头肌、隔膜和心脏内已知的缀合物，示例性缀合物的外显子跳读数据。
[0030]图6A、6B和6C分别为，相比小鼠四头肌、隔膜和心脏内已知的缀合物，示例性缀合物的外显子跳读数据的供选择代表。
[0031]图7A和7B分别描绘了用不同肽-寡聚物缀合物处理过的小鼠血尿素氮(BUN)水平和存活率。
[0032]图8A和SB分别显示了用不同肽-寡聚物缀合物处理过的小鼠的肾损伤标志物(KIM)数据和凝聚素(Clu)数据。
[0033]图9A、9B、9C和9D分别为，相比已知的缀合物，比较用示例性缀合物处理过的小鼠体内外显子跳读、BUN水平、%存活率和KM水平的图。 [0034]图10展示了用不同缀合物处理过的小鼠的KM数据。
[0035]图11显示了用不同缀合物处理过的小鼠的BUN分析结果。
[0036]图12为显示小鼠肾组织中不同寡聚物的浓度的图。
[0037]发明详述
[0038]1.定义
[0039]在以下描述中，为了提供不同实施方案的充分理解，陈述了某些具体细节。然而，本领域技术人员应当理解，可以在没有这些细节的情况下实施本发明。在其他的例子中，没有显示或详细描述熟知的结构，以避免不必要地模糊所述实施方案的描述。除非上下文另有要求，在本说明书和随后权利要求的通篇中，单词“包括(comprise) ”和其变形，如，“包括(comprises) ”和“包括(comprising) ”将被解释为开放式、包括性含义，即解释为“包括，但不限于”。而且，本文中提供的标题仅是为了方便，且不解释要求保护的本发明范围或含义。
[0040]在本说明书通篇中，提及“一个实施方案”或“实施方案”是指描述的与所述实施方案有关的具体特征、结构或特性被包括在至少一个实施方案中。因此，在本说明书通篇中，词组“在一个实施方案中”或“在实施方案中”在不同位置的出现并不一定都指相同的实施方案。此外，可以以任何合适的方式将具体特征、结构或特性组合在一个或多个实施方案中。另外，如本说明书和所附权利要求中所使用，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”包括复数参照对象，除非上下文另有明确说明。也应当注意到，术语“或”通常以包括“和/或”在内的含义被采用，除非上下文另有明确说明。
[0041]如本文中所使用，下列术语具有以下含义，除非另有说明:
[0042]“氨基”指的是-NH2基。
[0043]“氰基”或“腈”指的是-CN基。
[0044]“羟基(Hydroxy) ” 或“羟基(Hydroxyl) ” 指的是-0H 基。
[0045]“亚氨基”指的是=NH取代基。
[0046]“胍基”指的是-NHC (=NH) NH2取代基。[0047]“脒基”指的是-C (=NH) NH2取代基。
[0048]“硝基”指的是-NO2基。
[0049]“氧代”指的是=0取代基。
[0050]“硫代”指的是=S取代基。
[0051]“胆酸盐”指的是以下结构:
[0052]
【权利要求】
1.缀合物，其包含: (a)载体肽，包含氨基酸亚基；和 (b)核酸类似物，包含基本上不带电荷的骨架和用于序列特异性结合到靶核酸上的寻靶碱基序列； 其中: 所述氨基酸亚基的两个或更多个为带正电荷的氨基酸，所述载体肽包含位于所述载体肽的羧基端的甘氨酸(G)或脯氨酸(P)亚基，不多于7个连续的氨基酸亚基为精氨酸，且所述载体肽共价连接至所述核酸类似物。
2.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述载体肽包含位于羧基端的甘氨酸。
3.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述载体肽包含位于羧基端的脯氨酸。
4.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述载体肽包含4至40个氨基酸亚基。
5.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述载体肽包含6至20个氨基酸亚基。
6.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述带正电荷的氨基酸为组氨酸(H)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)或它们的组合。
7.根据权利要求1 所述的缀合物，其中至少I个所述带正电荷的氨基酸为精氨酸。
8.根据权利要求1所述的缀合物，其中除所述羧基末端甘氨酸或脯氨酸外，每个所述氨基酸亚基都为带正电荷的氨基酸。
9.根据权利要求1所述的缀合物，其中每个所述带正电荷的氨基酸都为精氨酸。
10.根据权利要求1所述的缀合物，其中至少I个所述带正电荷的氨基酸为精氨酸类似物，所述精氨酸类似物为阳离子型α -氨基酸，其包含结构为RaN=C(NH2)Rb的侧链，其中Ra为H或Re ；Rb为R\ NH2, NHR或N(Re) 2，其中Re为低级烷基或低级烯基且任选地包含氧或氮，或者Ra和Rb可以一起形成环；且其中所述侧链通过Ra或Rb连接到所述氨基酸上。
11.根据权利要求1所述的缀合物，其中至少20%的所述氨基酸亚基为带正电荷的氨基酸。
12.根据权利要求1所述的缀合物，其中至少50%的所述氨基酸亚基为带正电荷的氨基酸。
13.根据权利要求1所述的缀合物，其中至少80%的所述氨基酸亚基为带正电荷的氨基酸。
14.根据权利要求1所述的缀合物，其中除所述羧基末端甘氨酸或脯氨酸外，所有的氨基酸亚基都为带正电荷的氨基酸。
15.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述载体肽包含序列(Rd)m，其中Rd每次出现时都独立地为带正电荷的氨基酸，且m为2至12的整数。
16.根据权利要求15所述的缀合物，其中Rd每次出现时都独立地为精氨酸、组氨酸或赖氨酸。
17.根据权利要求15所述的缀合物，其中每个Rd都为精氨酸。
18.根据权利要求1所述的缀合物，其中除所述羧基末端甘氨酸或脯氨酸外，每个氨基酸亚基都为精氨酸。
19.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述载体肽包含至少I个疏水性氨基酸，所述疏水性氨基酸包含取代的或未被取代的烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基侧链，其中所述烷基、烯基和炔基侧链每6个碳原子包含至多I个杂原子。
20.根据权利要求19所述的缀合物，其中所述载体肽包含两个或更多个疏水性氨基酸。
21.根据权利要求19所述的缀合物，其中所述载体肽包含两个或更多个连续的疏水性氨基酸。
22.根据权利要求19所述的缀合物，其中至少I个疏水性氨基酸为苯丙氨酸。
23.根据权利要求19所述的缀合物，其中每个疏水性氨基酸都为苯丙氨酸。
24.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述载体肽包含至少I个具有以下结构(Yb)的中性氨基酸:
-C (O)-(CHRe)n-NH-
(Yb) 其中η为2至7，且每个Re在每次出现时都独立地为氢或甲基。
25.根据权利要求24所述的缀合物，其中所述载体肽包含序列[(RdYbRd)x(RdRdYb)y]z，其中Rd在每次出现时都独立地为带正电荷的氨基酸，且X和y在每次出现时都独立地为O或1，条件是x+y为I或2,且 z为I至6的整数。
26.根据权利要求25所述的缀合物，其中Rd在每次出现时都独立地为精氨酸、组氨酸或赖氨酸。
27.根据权利要求25所述的缀合物，其中每个Rd都为精氨酸。
28.根据权利要求25所述的缀合物，其中至少I个Yb为6-氨基己酸或β-丙氨酸。
29.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述载体肽包含序列ILFQY。
30.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述载体肽包含序列ILFQ、IffFQ或ILIQ。
31.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述载体肽包含序列PPMWS、PPMWT,PPMFS或PPMYS。
32.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述载体肽包含丙氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、丝氨酸或苏氨酸中的至少I种。
33.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述载体肽包含位于所述载体肽氨基端的乙酰基、苯甲酰基或硬脂酰基部分。
34.根据权利要求1所述的缀合物，其中每个氨基酸亚基都为天然氨基酸。
35.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述不带电荷的骨架包含通过亚基间连接结合的吗啉代环状结构序列，所述亚基间连接将一个吗啉代环状结构的3’末端结合到邻近的吗啉代环状结构的5’末端上，其中每个吗啉代环状结构结合到碱基配对的部分上，使得寡聚物能够以序列特异性方式结合到靶核酸上，其中所述亚基间连接具有以下通用结构(I):
36.根据权利要求35所述的缀合物，其中至少I种所述吗啉代环状结构具有以下结构⑴:
37.根据权利要求35所述的缀合物，其中至少I个亚基间连接为连接(A)。
38.根据权利要求35所述的缀合物，其中每个亚基间连接都为连接(A)。
39.根据权利要求35所述的缀合物，其中每个连接(A)在每次出现时都具有相同的结构。
40.根据权利要求35所述的缀合物，其中对于至少I次连接(A)的出现，X为_N(CH3)2。
41.根据权利要求35所述的缀合物，其中X在连接(A)每次出现时都为_N(CH3)2。
42.根据权利要求35所述的缀合物，其中每个连接都为连接(A)，且X为-N(CH3)2。
43.根据权利要求35所述的缀合物，其中对于至少I次连接(A)的出现，X具有以下结构:
R / \ I
----------?I^iW 1 ,
44.根据权利要求35所述的缀合物，其中对于至少I次连接(B)的出现，X具有以下结构:
45.根据权利要求35所述的缀合物，其中对于至少I次连接(B)的出现，X具有以下结构:
46.根据权利要求35所述的缀合物，其中W和Y在每次出现时都各自为O。
47.根据权利要求35所述的缀合物，其中至少5%的所述亚基间连接为连接(B)。
48.根据权利要求35所述的缀合物，其中每个连接(B)在每次出现时都具有相同的结构。
49.根据权利要求35所述的缀合物，其中所述核酸类似物具有以下结构(XVII):
50.根据权利要求49所述的缀合物，其中R18为所述载体肽。
51.根据权利要求49所述的缀合物，其中R19为所述载体肽。
52.根据权利要求49所述的缀合物，其中R18或R19中的至少一个为R2°。
53.根据权利要求49所述的缀合物，其中R19为-C(=0)0R21。
54.根据权利要求53所述的缀合物，其中R19为
55.根据权利要求49所述的缀合物，其中L1包含磷酸二酰胺和哌嗪结合。
56.根据权利要求55所述的缀合物，其中L1具有以下结构(XXIX):
57.根据权利要求56所述的缀合物，其中R24为不存在。
58.根据权利要求49所述的缀合物，其中R18为载体肽，L2为直接键，且所述载体肽在所述载体肽的羧基端和所述核酸类似物的3’末端氮之间形成连接。
59.组合物，其包含权利要求1所述的缀合物和药学可接受的载体。
60.治疗对象体内疾病的方法，所述方法包括将药学有效量的权利要求1所述的缀合物给予到所述对象。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述疾病为病毒感染、神经肌肉疾病、细菌感染、炎症或多囊性肾病。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述病毒感染为流感。
63.根据权利要求61所述的方法，其中所述神经肌肉疾病为杜兴氏型肌营养不良。
64.用于促进将核酸类似物运输到细胞内的方法，所述方法包括将权利要求1所述的载体肽结合到 核酸类似物上，且其中相对于非缀合形式的核酸类似物，促进了所述核酸类似物运输到细胞内。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述核酸类似物为吗啉代寡聚物。
【文档编号】A61K47/48GK103619356SQ201180071918
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2011年11月17日 优先权日:2011年5月5日
【发明者】贡纳·J·汉森 申请人:萨勒普塔医疗公司