外流泵抑制剂的制作方法

专利名称：外流泵抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗微生物剂领域和潜在抗微生物剂的辨别和鉴定方法。更具体地说，本发明涉及这样的抗微生物剂，其作用方式与细胞上的外流泵及外流泵的调节有关。背景下面的背景材料并不被认为是未决权利要求的先有技术，仅仅是为读者的理解提供帮助。
在上半个世纪，抗生素是治疗感染性疾病的有效工具。由于抗生素治疗的发展，到二十世纪八十年代后期，在发达国家几乎可完全控制细菌性感染。耐药细菌的出现，尤其在二十世纪八十年代后期和九十年代前期，正在改变这一状况。在主要的医院和医疗中心，抗生素耐药性菌株的增多已尤为普遍。耐药性菌株增多的后果包括更高的发病率和死亡率，更长的患者住院时间，和医疗费用的提高。(B.Murray.1994.《新英格兰医学杂志》(New Engl.J.Med.)330卷1229-1230页)。
抗生素在医院环境下的经常使用选择出了对许多抗生素有耐药性的细菌群体。这些群体包括那些毒性可能不强，但本身对许多抗生素有耐药性的病原菌。这些细菌常常感染身体虚弱或免疫功能低下的患者。出现的耐药群体也包括那些已熟知的病原体细菌菌株，它们以前对抗生素敏感。新获得的耐药性通常源于DNA突变，或源于从其它有机体转入的耐药性质粒(R质粒)或具有耐药性的转座子。具有天然耐药性的病原体或抗生素耐药性病原细菌中任何细菌群体的感染，用目前的抗生素治疗是非常困难的，因而需要能克服耐药机制的新的抗生素分子。
细菌具有一些不同的对抗抗生素作用的机制。这些耐药机制可能对某一抗生素分子或家族是特异的，或者可能是非特异的，对不相关的抗生素耐药性均有涉及。几种耐药机制可能存在于单个菌株中且这些机制可能独立地起作用或协同作用对抗某种抗生素或一组抗生素的作用。具体的机制包括药物的降解，酶促修饰导致药物的灭活，以及药物靶分子的改变(B.G.Spratt《科学》(Science)，264卷388页，1994年)。然而，还存在着更普遍的耐药性机制，即通过降低抗生素向细胞内的运输或提高药物从细胞向胞外介质的外排而阻断或降低抗生素与靶分子的接近。两种机制均能降低药物在靶位点的浓度从而使得细菌能在一种或多种抗生素存在下存活，否则这些抗生素将抑制或杀死这些细菌细胞。一些细菌可利用上述两种机制并结合具有活跃的抗生素外排作用的细胞壁(包括膜)的低通透性(H.Nikaido，《科学》(Science)264卷382-388页，1994年)。
在某些情况下，源于低通透性的抗生素耐药性与细菌质膜的结构有关。通常，根据包裹着胞质的质膜的结构，细菌可分为两大类。革兰氏阳性(G+)细菌只有一层膜，即质膜。相形之下，革兰氏阴性(G-)细菌有两层膜，一层质膜和一层外膜。这些细菌的膜均为含蛋白质的脂双分子层并可与其它分子结合。细菌膜的通透性可影响对抗生素的敏感性/耐药性，因为尽管一些抗生素的靶分子，如青霉素结合蛋白，可从质膜外层接触到，但抗生素的大多数靶分子均位于胞质中或在质膜的内层。因而对于靶分子在质膜中的抗生素来说，在革兰氏阴性细菌中该抗生素需首先穿过外膜。若靶分子在胞质中，抗生素在革兰氏阳性细菌中需穿过质膜，在革兰氏阴性细菌中则需穿过外膜和质膜两层膜。对所有两种膜，抗生素可扩散透过膜或利用膜转运系统穿过膜。
对于革兰氏阴性细菌，其外膜的脂成分构成了一有效的通透性屏障。这个外膜的外层含有脂、脂多糖(LPS)，脂多糖只见于革兰氏阴性细菌的外膜。外膜的脂层以准晶体方式高度组织化并具有非常低的流动性。由于外膜脂层的低流动性，甚至亲脂性的抗生素也不能快速扩散透过脂层。这已为实验所证示，疏水性探针分子极少分配到LPS的疏水区，而且其透过外膜双分子层的速率仅为透过普通磷脂双分子层(如质膜双分子层)速率的五十分之一到百分之一。
一些抗生素可通过含水的孔蛋白通道或通过特异的运输系统透过膜。然而，许多孔蛋白通道直径很窄，不能让较大的抗生素分子有效地扩散。另外，许多孔蛋白通道为高度亲水性环境，不能让疏水性分子有效地通过。因此，外膜可作为小分子的分子栅栏，这可部分解释，为什么革兰氏阴性细菌通常比革兰氏阳性细菌对抗生素更不敏感，以及为什么革兰氏阴性细菌通常对大的抗生素，如糖肽，更具抗药性，因为它们不能透过外膜。
对某些抗生素质膜也提供了一个扩散屏障。然而，由于质膜脂层的流动性大于革兰氏阴性细菌外膜的流动性，亲脂性的药物可透过脂层。其它一些药物，如磷霉素或D-环丝氨酸，它们在亲脂环境中具有非常低的溶解性，可利用运输系统穿过质膜，在这种情况下，如果运输系统没有合成，细菌将对药物产生耐药性(Peitz等，1967年，《生物化学杂志》(Biochem.J.)6卷，2561页)。
通过减少孔蛋白的数目或减少某种孔蛋白的数目而降低外膜的通透性，可降低某一菌株对许多抗生素的敏感性，因为降低了抗生素进入细胞的速率。然而，对于大多数抗生素，其半平衡期非常短，若不存在其它机制，这些抗生素能够发挥其作用。外流泵就是这些其它机制中的一个实例。一旦进入胞质或周质，药物将被运回外面的介质。这种运输通过外流泵来介导，它们由蛋白质组成。不同的泵可特异地外排一种或一组药物，如NorA系统可运输喹诺酮，或TetA可运输四环素，或者它们能外排许多不同的分子，如绿脓杆菌上的某种外流泵。通常，外流泵含有胞质成分且将分子运出细胞需要能量。一些外流泵具有二级质膜蛋白质，它们伸至周质。至少有绿脓杆菌的某些外流泵具有位于外膜的三级蛋白质。
外流泵与抗生素耐药性有关，因为在某些情况下，它们能除去大部分设法进入细胞的抗生素分子，从而维持非常低的细胞内抗生素浓度。现举例说明，实验室诱导的绿脓杆菌突变株799/61。不能产生任何可测到的外流泵，其对四环素和环丙氟氯霉素的敏感性比其父本菌株绿脓杆菌799高8至10倍，而其父本菌株可合成外流泵。同样，绿脓杆菌外流泵的胞质成分的无效突变体mexA，比野生型对抗生素更敏感。
外流泵的生理功能还没有弄清。它们与药物的耐受性有关，也参与了细菌细胞的正常生理活动。编码于绿脓杆菌mexA操纵子中的外流泵已被证实受介质中的铁离子含量调控，并与铁载体受体的合成共同受到调控。铁载体是细菌在缺铁离子条件下，如在动物感染过程中，生长所必需的分子。当细菌细胞需要铁离子时，它们在胞质中合成并外排。铁载体在感染的动物中清除铁离子并将铁离子归还给微生物体以用于基本的微生物生命过程。由于在动物体内，包括在人体内，基本上没有游离的铁离子，感染细菌产生的铁载体在感染过程中是一个重要的毒力因子。
甚至通常包被有具有相对高通透性的被膜的有机体可通过降低被膜的通透性而产生耐药性。当某种试剂主要通过某种特异的通道扩散穿过屏障时，通道的突变丢失可能成为耐药性的有效机制。“非经典”的β-内酰胺化合物亚胺培南，表现出不同寻常的抗绿脓杆菌活性，主要因为该药剂可通过一特异的通道OprD扩散，该通道的生理功能似乎是运输基本氨基酸。然而，通过简单地丢失oprD通道，绿脓杆菌可获得对亚胺培南的耐药性，目前从医院环境中分离的大部分绿脓杆菌株均由于这种修饰作用而具耐药性。以同样的方式，模仿铁螯合剂(铁载体)设计的β-内酰胺化合物在它们透过外膜的运输中已知可选择铁载体特异运输有缺陷的突变体。
概括地说，上面的讨论暗示细胞中影响抗生素进入细菌细胞的运输(主动和被动运输)的因子，对许多细菌种类来说，是抗生素耐药性的的重要成分。概述本发明提供了筛选外流泵抑制剂化合物的方法，这些化合物能抑制细菌或其它微生物细胞的外流泵。这些外流泵可以能量依赖的方式从胞质中外排底物分子，外排的底物分子包括抗细菌剂。这样的外流泵抑制剂可用于，例如，通过降低共同给予的抗微生物剂的外排作用或阻止微生物(如细菌)合成的能允许或促进其生长的化合物的外排作用而治疗微生物感染。降低这种化合物外排作用的一个实例是通过降低铁载体的外排而抑制铁离子的利用。因此，本发明也提供了含这些外流泵抑制剂的组合物以及用这些组合物来治疗微生物感染的方法。从而，本发明公开了一个适用于许多对抗微生物剂有耐药性的病原有机体的治疗方法。这样的微生物中尤为合适的例子是病原菌绿脓杆菌，它对许多常用的抗菌剂有固有的耐药性。将这种细菌暴露在某种外流泵抑制剂中可明显减缓抗菌剂从细胞内部的外排或铁载体的外排。因此，如果另一种抗菌剂与外流泵抑制剂共同给药，该抗菌剂将聚积到合适的浓度以抑制细菌细胞的生长，否则，由于外排作用，它只能维持较低的胞内浓度。根据所用抗菌剂的种类，这种抑制作用可归因于抑菌作用或杀菌作用。尽管绿脓杆菌是一合适菌种的例子，其它细菌和微生物种类可能含有相似的宽底物泵，它们能主动地外排许多抗微生物剂，从而也能成为合适的目标。除上述之外，对于某些菌种，外流泵抑制剂可降低细菌的毒力，例如，通过抑制重要的病原因子的运输。再次以绿脓杆菌为例，对这种细菌外流泵的抑制抑制了铁离子的摄取，这对其致病性是非常重要的。细菌铁离子运输的机制中涉及了称作铁载体的分子，它由细菌细胞合成并由外流泵外排。这些铁载体分子紧紧地与从宿主中清除的铁离子结合并被细菌摄取。通过这种方式，获得细菌代谢所需的铁离子，从而感染得以维持。
因此，举例说明外流泵抑制剂的功效，绿脓杆菌外流泵的抑制可产生下面的一种或多种生物学效应1.绿脓杆菌株将变为对那些不能用于假单胞菌属感染治疗的抗生素敏感，或变得对能抑制假单胞菌属生长的抗生素更敏感。
2.绿脓杆菌株将变得对目前用于治疗假单胞菌属感染的抗生素更加敏感。
3.由于铁离子的利用受到妨碍，绿脓杆菌的致病力减弱。
4.一种泵成分的抑制可能是致命的。这些效应甚至获得一种即可治疗这种细菌的感染。同时，如前面提到的，相似的泵也发现于其它的微生物。上面这些效应的某些或全部也可从这些微生物中获得，因而它们也是检测或使用外流泵抑制剂的合适的目标物。因此，术语“微生物”包括，例如，细菌，真菌，酵母，和原生动物。
因此，第一个方面，本发明提供了一种筛选非四环素特异的外流泵抑制剂的方法。该方法包括当细菌生长在非零的亚抑制浓度的某种抗菌剂条件下时，确定产生非四环素特异的外流泵的细菌的生长，而通常该抗菌剂将被细菌中的非四环素特异的外流泵排出。如果不被抑制，外流泵将使抗菌剂的胞内浓度维持在低水平，于是抗菌剂不能抑制细胞。然而，如果也存在能显著减缓或终止抗菌剂外排的化合物，该药剂将在胞内聚积到一个较高浓度，从而抗菌剂在较高的胞内浓度下能抑制细胞的生长。
在某些优选的实施方案中，外流泵的一个成分与为绿脓杆菌mexA/mexB/oprM外流泵或由绿脓杆菌株K385过量表达的外流泵或由绿脓杆菌株PAO4098E过量表达的外流泵的一部分的多肽至少有50％的氨基酸序列相似性。由于该外流泵一多肽组分的上述序列相似性，这种外流泵被称作绿脓杆菌型外流泵。这种泵将外排一种或多种非四环素化合物(但也可外排四环素)，其中包括，例如，其它类型的抗菌剂和毒力因子。在特别优选的实施方案中，外流泵为绿脓杆菌外流泵，为在绿脓杆菌中天然存在的一种外流泵。一些这种绿脓杆菌外流泵已在上面提到。同样在特别优选的实施方案中，细菌为绿脓杆菌，例如，菌株K385或菌株PAO4098E。
同样在一优选的实施方案中，细菌可来自其它的菌种，如下面的任何一种绿脓杆菌，荧光假单胞菌，食酸假单胞菌，产碱假单胞菌，恶臭假单胞菌，嗜麦芽糖寡养单胞菌，洋葱伯克氏菌，嗜水气单胞菌，大肠杆菌，弗氏柠檬酸杆菌，鼠伤寒沙门氏菌，伤寒沙门氏菌，副伤寒沙门氏菌，肠炎沙门氏菌，痢疾志贺氏菌，弗氏志贺氏菌，索氏志贺氏菌，阴沟肠杆菌，产气肠杆菌，肺炎克雷伯氏菌，产酸克雷伯氏菌，粘质沙雷氏菌，土拉热弗朗西丝氏菌，摩氏摩根氏菌，奇异变形菌，普通变形菌，产碱普罗威登斯菌，雷氏普罗威登斯菌，斯氏普罗威登斯菌，乙酸钙不动杆菌，溶血不动杆菌，小肠结肠炎耶尔森氏菌，鼠疫耶尔森氏菌，假结核耶尔森氏菌，中间耶尔森氏菌，百日咳博德特氏菌，副百日咳博德特氏菌，支气管炎博德特氏菌，流感嗜血菌，副流感嗜血菌，溶血嗜血菌，副溶血嗜血菌，杜氏嗜血菌，多杀巴斯德氏菌，溶血巴斯德氏菌，粘膜炎布兰汉氏球菌，幽门螺杆菌，胚胎弯曲杆菌，空肠弯曲杆菌，大肠弯曲杆菌，布氏疏螺旋体，霍乱弧菌，副溶血弧菌，侵肺军团菌，单核细胞增生利斯特氏菌，淋病奈瑟氏球菌，脑膜炎奈瑟氏球菌，阴道加德纳氏菌，脆弱拟杆菌，吉氏拟杆菌，拟杆菌3452A同源群，普通拟杆菌，卵拟杆菌，多形拟杆菌，单形拟杆菌，埃氏拟杆菌，内脏拟杆菌，艰难梭菌，结核分枝杆菌，鸟分枝杆菌，胞内分枝杆菌，麻风分枝杆菌，白喉棒杆菌，溃疡棒杆菌，肺炎链球菌，无乳链球菌，酿脓链球菌，粪肠球菌，屎肠球菌，金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，腐生葡萄球菌，中间葡萄球菌，猪葡萄球菌猪亚种，溶血葡萄球菌，人葡萄球菌，解糖葡萄球菌。
术语“外流泵”指一蛋白组合，它能从胞质或细胞周质中外排底物分子，这种外排作用需要能量。因此，外流泵一般位于细胞的质膜上(跨质膜)。在革兰氏阴性细菌中泵可能跨过周质空间并可能存在部分跨过外膜的外流泵。特定的外流泵将包含一多肽，它与为绿脓杆菌mexA/mexB/oprM的外流泵或绿脓杆菌株K385过量表达的外流泵或绿脓杆菌株PAO4098E过量表达的外流泵的一部分的多肽至少有50％的氨基酸序列相似性。由于外流泵组成多肽的上述序列相似性，这样的外流泵被称作绿脓杆菌型外流泵。
术语“非四环素特异性外流泵”指对四环素没有高特异性(相对其它抗生素)的外流泵，从而它不是一个四环素(四环素特异)外流泵。该术语因而包括广泛底物的泵(外排多种具有不同结构特征的化合物)和对除四环素外的化合物(包括抗生素)有高特异性的泵。四环素外流泵与细菌对四环素特异的耐药性有关。(Speer等，1992年《临床微生物学评论》(Clin.Microbiol.Rev.)5卷387-399页。)如所提到的，这些泵对四环素具有高的特异性，它们的存在使得细胞具有高的四环素耐药性，但是它们并不能提供对其它抗生素的耐药性。四环素泵成分的基因已在革兰氏阴性以及革兰氏阳性细菌的质粒中发现并能分为两大类tetA(A-E)，和tetK及tetL。TetA-E四环素耐药性因子含一结构基因tetA，它是一四环素特异性泵，以及一阻遏物基因，tetR，它介导可诱导的四环素耐药性。属于这类的四环素外流泵称为tetA(A)，tetA(B)，tetA(D)，tetA(E)，存在于肠细菌和其它革兰氏阴性细菌。TetK和TetL是与革兰氏阳性细菌的四环素耐药性有关的泵。其基因通过翻译的弱化而调节，与tetA类并不同源。
术语“一种筛选方法”的使用指该方法适用于，常常是同时评价大量化合物的功效。在本发明中，这样的筛选是直接地确定某种化合物抑制某种外流泵的能力。在本文中，“筛选”与检测有所区别，在检测中某一方法仅适合用于评价一种或几种化合物。
“外流泵抑制剂”指能特异地干扰外流泵外排其正常底物或其它如抗生素的化合物能力的化合物。该抑制剂可能具有固有的抗微生物(如抗菌)的能力，但至少其主要的相关活性是由于外流泵抑制活性。本发明中尤为感兴趣的是那些能抑制外排作用或抑制具有包括抗菌剂在内的广泛底物范围的外流泵活性的化合物。术语“非四环素特异性外流泵抑制剂”指抑制某种非四环素特异性外流泵的外流泵抑制剂。术语“绿脓杆菌型外流泵抑制剂”指抑制绿脓杆菌型外流泵的外流泵抑制剂。“绿脓杆菌外流泵抑制剂”指抑制存在于绿脓杆菌的外流泵的外排活性的外流泵抑制剂。
“潜在的”外流泵抑制剂指将被或正被试验其作为外流泵抑制剂的能力的化合物，从而是一“试验化合物”或一“假定的外流泵抑制剂”。
本文中，关于细菌或其它微生物的生长，术语“生长”首先指微生物的繁殖，即数量的增多而不是尺寸的增大。因此这个术语可适用于一种或多种类型的单细胞或细胞群。然而，这一术语也指生长着的细胞正进行其代谢过程，而不仅仅是正进行一轮繁殖，如分裂。当然这一术语也指如某些真菌等有机体的多核型的大小增长，同时伴随着核的数目增加。
在细菌(同样对其它微生物)细胞生长的上下文中，术语“抑制”指细菌群的生长速率降低。这样的抑制作用是可监控的，例如，通过抑制剂存在或不存在时液体培养基的浊度差异，或通过抑制剂存在或不存在时固体培养基上培养物蚀斑的大小差异而监控。
关于细菌上特异的外流泵的存在，术语“过量产生”指与该菌种天然最常见的(通常为非医院变种)分离菌相比，特异性外流泵数目显著增多的细菌的存在。该术语并不是仅指外流泵组成多肽数目的增多，而是指细胞膜上有功能的外流泵数目的增多。结果，过量产生外流泵的细胞比该细菌不过量产生外流泵的菌株能更有效地外排底物分子。
过量产生外流泵的细菌株因而与“野生型菌株”相对。野生型菌株产生的特异外流泵水平为该菌种天然分离株的一般水平。但更重要的是，野生型菌株产生特异外流泵的水平明显低于过量产生该特异外流泵的相关菌株的水平。
这里用到的术语“抗菌剂”指能特异抑制细菌生长的化合物。更普遍地，术语，“抗微生物剂”指能特异地抑制微生物生长的化合物，因而该术语的解释也指其它的微生物和抗微生物剂。因而该术语包括天然存在的抗生素以及合成和半合成的化合物，这些药剂具有杀菌或抑菌的能力。通常，如果某种抗菌剂是抑菌的，意味着该药剂能基本上停止细菌细胞的生长(但不杀死细菌)；如果某种药剂是杀菌的，意味着该药剂将杀死细菌细胞(在杀死细菌前可停止细菌生长)。但是，该术语与通常对细胞有毒性的化合物有明确地区别。抗菌剂类的一些实例有喹诺酮(旋转酶抑制剂)，氨基糖苷，糖肽，磺胺，大环内酯，β-内酰胺和四环素。本发明中的外流泵抑制剂单独使用时可能是抗微生物(如抗菌)剂，和/或能激发另一种抗微生物剂的活性(提高微生物对该抗微生物剂的敏感性)，和/或能降低病原体的毒力。
一种抗菌剂的“亚抑制浓度”指比零高，但低于能抑制该特定菌株的菌群中大部分细胞的浓度。(对其它微生物也一样)。因此，尽管少量的高敏感细胞可能被抑制，但大多数细胞的生长不会受到影响或仅仅部分降低，因而，在合适的培养基中，在亚抑制浓度的特异抗菌剂存在下，优选特异菌群的生长降低应不超过50％，更优选不超过30％，更加优选不超过10％。但是在下面的实施例1和3中的筛选方法中，亚抑制浓度必须足够高，从而使外流泵的抑制能导致相应的生长抑制和抗菌剂灭活因子的进入。通常，一种抗菌剂(或抗微生物剂)的亚抑制浓度低于最小抑制浓度(MIC)。
无论“包含”后面接什么词，“包含”意味着包括，但不仅限于这些。因此，术语“包含”的使用表示列出的要素是所需或必需的，但其它的要求是任选的，可能存在，也可能不存在。无论词组“由…组成”后面接什么，“由…组成”意味着包括且限于此。因此“由…组成”表示要素是所需的或必需的，且没有其它要素存在。“基本上由…组成”指包括词组后列出的所有要素，但不包括其它的不干扰或提高所列要素在本公开内容中的特异活性或作用的要素。因此，词组“基本上由…组成”表示所列的要素是所需或必需的，但其它的要素则依其是否影响所列要素的活性或功能而是任选的，即可能存在，也可能不存在。
在另一方面，本发明提供了一个筛选非四环素特异性外流泵抑制剂的方法。在这个方法中，表达非四环素特异外流泵的细菌培养在含试验化合物和另一种化合物的合适培养基中。该方法包括确定在试验化合物的存在下，第二种化合物(如抗微生物剂)的胞内浓度是否升高。第二种化合物通常是被该泵外排的物质。确定第二种化合物在胞内的浓度是否增高涉及检测与调控序列(启动子)共同转录的报道基因的表达，而该调控序列的表达是受第二种化合物升高的胞内浓度诱导的。第二种化合物在培养基中以非零的、对细菌亚抑制的浓度存在，这会使其胞内浓度过低而无法诱导报道基因的表达，除非外排该化合物的泵被抑制。如果某试验化合物存在时比不存在时报道基因的表达水平高，则表明该试验化合物为外流泵抑制剂。第二种化合物优选为抗菌剂，但不是必需为抗菌剂。在某些实施方案中，如果报道基因为单拷贝染色体插入，如插入非必需基因中，是非常有用的。
在优选的实施方案中，第二种化合物为抗菌剂。在具体的实施方案中，重组的细菌可来自大量菌种中的任何一种，包括上面为第一个方面列出的那些。
在一些优选的实施方案中，可诱导调控序列中报道基因的表达可通过四环素浓度的提高而诱导。在那些实施方案中，调控序列可能是tetA调控序列(如tetA(A))，它含有一个能结合TetR阻遏物分子的操纵位点。细菌也能表达该阻遏物。四环素不存在(或四环素浓度非常低)时，阻遏物将与操纵位点结合而报道基因不表达。因此，当四环素在培养基中以对表达非四环素特异外流泵的细菌为亚抑制水平存在时，四环素的胞内水平维持在足够低的水平，报道基因不能表达(或以极低水平表达)。如果某种能抑制外流泵活性的化合物(试验化合物)存在，四环素的胞内浓度将升高，TetR从操纵位点上释放，而报道基因将表达。报道基因和调控序列优选但非必须以单拷贝形式插在细菌染色体中。通常，该基因插在一非必需基因中。
在具体的实施方案中，外流泵为绿脓杆菌外流泵，如MexA/mexB/oprM外流泵或由绿脓杆菌株K385过量表达的外流泵。在其它具体的实施方案中外流泵为绿脓杆菌型外流泵。在特定的实施方案中，报道基因编码一种酶，如β-半乳糖苷酶，或其它表达易检测产物的基因，几种这样的基因对本领域的技术人员来说是熟知的。同样在特定的实施方案中，所用的细胞为绿脓杆菌菌株，但其它的实施方案中也可使用其它的细胞，具体地说包括上面第一个方面中列出的细菌。
在具体的实施方案中，报道基因编码一种酶，如β-半乳糖苷酶；一些合适的报道基因对本领域的技术人员来说是熟知的。在某些情况下报道物可提供一颜色可测的报道，但其它的报道也是有用的。比色报道即可是光吸收也可是光反射。因此，比色报道可能包括具有特征光吸收的分子(有色分子)的检测或光发射分子(如荧光分子)的检测。
对暴露在抗微生物剂中的微生物(包括细菌)来说，某种抗微生物剂的“胞内浓度”指该药剂在细胞最外层膜内的浓度。对大多数微生物种来说，最外层膜为质膜，但对革兰氏阴性细菌来说，该药剂在周质空间中的浓度可能是其显著的胞内浓度(如对β-内酰胺)。对革兰氏阴性细菌来说，某种抗菌剂的相应的胞内浓度为可接近该抗菌剂的主要目标物的细胞空间内的浓度。
术语“重组微生物”指通过人的操作，插入了某种DNA结构或序列的微生物种系，其中所插入的DNA结构或序列原先在该微生物中并不存在，或者被插入到该微生物细胞或染色体的不同位置。该术语并不包括天然的遗传交换如不同天然存在的有机体间的接合。该术语明确地包括重组细菌。对大多数目的，优选插入DNA序列为稳定的插入，也就是说该序列可连续地复制并在生长时传递给后代微生物。这样的后代也是“重组”的。
术语基因的“表达”指细胞内转录并翻译生成多肽产物的过程。在本文中，该术语尤指表达的产物是有功能的，并在某种意义上说很容易用适合该具体报道物的方法检测出来。因此，对一个酶报道物来说，产物具有正常的酶活性。
术语“提高的浓度”指这种一种胞内浓度，它表明通常为抗菌剂的某种化合物处于一种较通常为试验化合物或外流泵抑制剂的第二种化合物不存在时为高的浓度。因此，在筛选方法的描述中，一种抗菌剂提高的胞内浓度为比试验化合物或已知的外流泵抑制剂不存在时的浓度高的浓度。这种提高的浓度可能低于、等于或者高于培养基中的浓度。
术语“单拷贝”指该术语所指的核酸序列在每一染色体组中仅以单拷贝形式存在。这明确地区别于多拷贝质粒中核酸序列的存在，在多拷贝质粒中核酸序列在单个细胞中可以超过一的不同数目存在。
也与细胞中插入的核酸序列有关的术语“染色体插入”指核酸序列插入并共价连接入所讨论的细胞的染色体中。这意味着该序列在细胞正常复制过程中将与染色体其它部分共同复制。再次说明，这与独立于细胞染色体之外的细胞质粒上的核酸序列有明显不同。
“报道基因”是一种所编码的产物很容易被检测的核酸序列。其中一些报道物为酶，可通过产物的酶活性而检测。一个具体的例子是β-半乳糖苷酶基因。但还有许多其它的报道基因存在并为本领域的技术人员所熟知。
“调控序列”是能控制有关的编码序列何时表达和以什么水平表达的核酸序列。在涉及基因表达时，术语“可诱导的”指在某种特定条件下，跟随调控序列的编码序列的转译水平提高。于是，在调控序列可被抗菌剂诱导的情况下，当存在足够高浓度的抗菌剂时，有关的编码序列的表达水平将提高。这样的诱导作用可能有多种机制，具体包括解阻遏机制，其中在足够高浓度的抗菌剂存在下，阻遏物分子被灭活。
在另一方面，本发明提供了一种利用微生物(如细菌)细胞和可被该细胞外流泵(如非四环素特异性外流泵)运输的染料、荧光基团或其它容易用光谱法检测的化合物(检测或可测化合物)来筛选外流泵抑制剂的方法。该方法包括比较在试验化合物存在或不存在时检测化合物(如染料或荧光基团)的胞内浓度。如果在试验化合物存在时检测化合物的胞内浓度较试验化合物不存在时升高，表明该试验化合物为一种特异的外流泵抑制剂。优选细胞过量表达外流泵。
同样优选染料或荧光物质的胞内浓度可直接确定，然而，在其它的实施方案中，胞内浓度通过确定悬浮培养基中的染料或荧光物质的浓度(胞外浓度)或通过确定细胞抽提液中染料或荧光物质的浓度而间接测定。胞内染料的直接确定，在某些情况下，通过细胞(如一团细胞中)颜色的目测，可定量确定外流泵的抑制。
许多不同的染料和荧光物质在本领域是已知的。这些包括，例如龙胆紫，孔雀绿，美蓝，苄紫(Benzyl Viologen)，溴麝香草酚蓝，甲苯胺蓝，美蓝，玫瑰红，Alcyan蓝，钌红，坚牢绿，苯胺蓝，二甲苯青，溴酚蓝，考马斯蓝，溴甲酚紫，溴甲酚绿，台盼蓝和酚红。合适的染料或其它检测化合物可通过用本领域技术人员熟知的常用方法判定具体的染料是否被研究中的特定外流泵或被研究中的细胞的某种外流泵运输(外排)而作出选择。在优选的实施方案中，染料为龙胆紫和孔雀绿。
在另一个方面，本发明提供了一种筛选外流泵抑制剂方法，包括将重组的微生物细胞与一试验化合物接触，并确定重组的微生物细胞是否在试验化合物存在下生长。重组的微生物被构建，从而使得当外流泵被抑制后微生物细胞将能生长，而当外流泵不被抑制时将不能生长。如果重组的微生物细胞在试验化合物存在时生长而在试验化合物缺乏时不生长，则该试验化合物为外流泵抑制剂。这种方法是对外流泵抑制剂的阳性生长筛选。
在具体的优选实施方案中，这种方法包括将重组的微生物细胞与一试验化合物、一诱导剂、高于重组微生物细胞的MIC的某一浓度的抗微生物剂接触。在灭活因子的诱导不存在时，抗微生物剂不能被重组的微生物细胞外排或特异性灭活，诱导剂能诱导抗微生物剂的灭活因子。同样在具体的实施方案中，重组的微生物为重组细菌。灭活因子可以是β-内酰胺酶，抗菌剂β-内酰胺可被β-内酰胺酶断裂。具体地，在一个实施方案中，β-内酰胺酶基因可为blaS基因，而β-内酰胺为一可降解的卡巴培南，在J.Dufresne等1988年，《抗微生物剂化学疗法》(Antimicrob.Agents Chemother.)32卷819-826页中blaS基因被鉴定并首次报道。而且，在具体的实施方案中，启动子为tetA启动子，重组的细菌细胞能从tetR基因产生有功能的阻遏物，并结合到启动子上。启动子和β-内酰胺酶基因优选但非必需以单拷贝形式插在细菌染色体中。
在另一个方面，本发明提供了一种治疗动物微生物感染，如细菌感染的方法，通过给这类感染动物足够量的外流泵抑制剂以降低外流泵活性，这里的抑制剂可降低微生物的致病能力。例如，这种致病能力的降低可通过抑制铁载体的运输而干扰细菌对铁离子的需求而获得。同样这种致病能力也可通过降低或消除能对宿主造成组织损伤影响的微生物代谢产物而降低。然而其它降低致病能力的方法也包含在这个方面。动物可能是，例如鸡和火鸡，但在某些优选的实施方案中为哺乳动物。
在某些优选的实施方案中微生物感染可能由细菌引起，例如这些细菌可能是上面第一个方面中列出的细菌种类中的任何一种。
在一个相关的方面中，本发明提供了一种通过给动物足够量的外流泵抑制剂以降低外流泵活性而治疗遭受微生物感染的动物的方法。在这个方面中，外流泵抑制剂可减弱与感染有关的微生物在体内的生存能力。通过减弱在体内的生存能力，被感染的动物更容易清除体内的感染，或微生物甚至可能被杀死。在具体的实施方案中动物为哺乳动物。同样在具体的实施方案中，微生物可能是致病细菌种类中的任何一种，尤其是包括上面第一个方面中列出的那些。
术语“在体内的生存能力”指微生物如细菌在宿主如动物中的存活和生长能力。因此，某种能降低微生物在体内的生存能力的外流泵抑制剂能停止微生物的生长，和/或杀死微生物。这样的外流泵抑制剂因而也是抗菌剂。
在另一相关的方面中，本发明包括一种哺乳动物预防治疗的方法。在这个方法中，对处于微生物感染如细菌感染危险中的哺乳动物给予能减弱微生物致病能力的外流泵抑制剂。
在一相关的方面中，本发明提供了一种治疗动物，具体包括哺乳动物的微生物感染的方法，即用抗菌剂和能提高微生物对该抗菌剂敏感性的外流泵抑制剂来治疗遭受感染的动物。通过这种方式，用较小剂量的抗菌剂即可消灭与感染有关的微生物，或者用在外流泵抑制剂不存在时使用没有疗效的抗菌剂也可治疗。因此，本治疗方法尤其适用于难以单独用抗微生物剂治疗的微生物株造成的感染，由于单独作用需要大的剂量(可能带来不希望的副反应)，或由于缺乏具有临床疗效的抗生素。但是本方法也适用于治疗对特定抗微生物剂敏感的微生物感染，以减小该抗菌剂的剂量。这能降低发生副反应的危险，也能降低由于连续高剂量使用某种抗生素而造成的对高耐药性微生物的选择作用。在具体的实施方案中微生物为细菌，例如可能是上面第一个方面中指出的任何一种。同样在具体的实施方案中，可用到不同的抗菌剂，这些包括喹诺酮类、四环素类、糖肽类、氨基糖苷类、β-内酰胺类、利福霉素类、香豆霉素类、大环内酯类和氯霉素。在具体的实施方案中，上面几类中的抗生素，例如可是下面的一种β-内酰胺抗生素亚胺培南，部分硫霉素，偏硫霉素，头孢克洛，头孢羟氨苄，头孢羟唑，头孢三嗪，头孢泽酮，头孢唑啉，头孢克肟，头孢甲肟，头孢地嗪，头孢尼西酸，头孢哌酮，头孢苄胺四唑，头孢噻肟，头孢替安，头孢咪唑，头孢匹胺，头孢泊肟，头孢磺啶，头孢他啶，头孢特仑，头孢他唑，ceftibuten，头孢唑肟，头孢三嗪噻肟，头孢氨呋肟，头孢唑喃，头孢乙腈，头孢氨苄，头孢来星，头孢噻啶，头孢噻吩，头孢匹林，头孢拉定，头孢美唑，头孢噻吩，头孢替坦，azthreonam，卡芦莫南，氟氧头孢，羟羧氧酰胺菌素，脒西林，阿莫西林，氨苄青霉素，阿洛西林，羧苄青霉素，苯青霉素，卡非西林，氯唑西林，二氯唑西林，甲氧西林，美洛西林，萘夫西林，苯唑西林，盘尼西林G，哌拉西林，磺苄西林，替莫西林，替卡西林，cefditoren，SC004，KY-020，头孢地尼，ceftibuten，FK-312，S-1090，CP-0467，BK-218，FK-037，DQ-2556，FK-518，cefozopran，ME1228，KP-736，CP-6232，Ro09-1 227，OPC-20000，LY206763大环内酯类阿齐红霉素，甲基红霉素，红霉素，磷酸竹桃霉素，罗他霉素，罗沙米星，罗红霉素，醋竹桃霉素喹诺酮类氨氟沙星，西诺沙星，环丙氟哌酸，伊诺沙星，氟罗沙星，氟甲喹，洛美氟哌酸，萘啶酮酸，诺氟沙星，氧氟沙星，左旋氟哌酸，喹酸，培氟沙星，吡乙喹酸，替马氟沙星，托舒沙星，司巴沙星，clinafloxacin，PD131628，PD138312，PD140248，Q-35，AM-1155，NM394，T-3761，芦氟沙星，OPC-17116，DU-6859a，(鉴定于Sato，K.等，1992年《抗微生物剂化学疗法》(Antimicrob.Agents Chemother，37卷1491-98页)，DV-7751a(鉴定于Tanaka，M.等，1992年《抗微生物剂化学疗法》，37卷2212-18页)四环素类金霉素，去甲金霉素，强力霉素，赖甲环素，甲烯土霉素，二甲胺四环素，土霉素，四环素氨基糖苷类阿米卡星，阿贝卡星，丁胺菌素，地贝卡星，福贴霉素，庆大霉素，卡那霉素，meomycin，乙基紫苏霉素，核糖霉素，紫苏霉素，大观霉素，链霉素，托普霉素，克林霉素，林可霉素在另一相关的方面中，本发明包括哺乳动物预防治疗的方法。在这个方法中，给予处于微生物感染如细菌感染危险中的哺乳动物抗菌剂和外流泵抑制剂。
在微生物如细菌对抗菌剂的反应的叙述中，术语“易(敏)感性”指微生物对抗菌剂存在时的敏感性。即，提高敏感性意味着微生物将被微生物细胞周围培养基中更低浓度的抗微生物剂抑制。这等于说微生物对抗微生物剂更敏感。在大多数情况下该抗生物剂的最小抑制浓度(MIC)被降低。
这里用到的术语“治疗”指为预防和/或治疗目的给予药物组合物。术语“预防性治疗”指治疗尚未感染，但容易感染，或有某种感染危险的患者。术语“治疗性治疗”指对已遭受某种感染的患者进行药物治疗。因此，在优选的实施方案中，治疗是联合给予(同时或依次)哺乳动物(为治疗或预防目的)有疗效量的增效剂和抗菌(或抗微生物)剂。
“疗效量”或“药效量”指如本发明中公开的，具有疗效的外流泵抑制剂的量，或外流泵抑制剂和抗微生物剂各自的量，疗效通常指抑制引起或有助于微生物感染的微生物细胞的正常代谢到一定程度。可用于联合治疗的外流泵抑制剂和抗微生物剂的剂量为有疗效量。因此，这里所用的疗效量指那些联合使用时，通过临床试验结果和/或模型动物感染研究判断为产生期望疗效的外流泵抑制剂和抗微生物剂的量。在具体的实施方案中，外流泵抑制剂和抗微生物剂按预先确定的比例混合，因此疗效量应是混合物的量。这个量和外流泵抑制剂及抗菌剂各自的量可由本领域的技术人员按常规确定，并随许多因子如涉及的具体菌株和所用的具体外流泵抑制剂和抗菌剂的不同而变化。这个量也依赖于患者的身高、体重、性别、年龄及病史。对于预防性治疗，疗效量是如果有微生物感染存在就将有疗效的量。
疗效在一定程度上减轻一种或多种感染的症状，包括治愈感染。“治愈”指感染症状的消除，包括与感染有关的其它残存的微生物的清除。但是，感染的某些长期或永久影响在治愈后仍存在(如大范围的组织损伤)。
术语“微生物感染”指病原性微生物对宿主哺乳动物的侵染。这包括通常存在于哺乳动物体内或体表的微生物的过量生长。更普遍地，微生物感染可能是微生物群体的存在正损伤宿主哺乳动物的任何状况。因此，当过量微生物群体存在于哺乳动物体内或体表，或当微生物的存在正损伤哺乳动物的细胞或其它组织时，该哺乳动物正“遭受”着微生物感染。这种描述尤其适用于细菌感染。
术语“给予(药)”和“给药”指一种给予哺乳动物某种抗微生物的药用组合物制剂的方法，该方法为，例如局部用药、口服、静脉注射、皮下注射或肌肉注射。给药的优选方法可随多种因子如药用组合物的成分、潜在或已有的细菌感染的部位、所涉及的微生物和已有微生物感染的严重程度的不同而变化。
术语“哺乳动物”用其通常的生物学意义。因此，它具体包括人、狗和猫，但也包括许多其它的物种。
在另一个方面，本发明也以抑制细胞膜上的膜通道的方法为特色，该方法包括将膜通道与膜通道抑制剂接触，抑制剂可减弱膜通道的外排能力。在具体的实施方案中，膜通道中的至少一个多肽与mexA/mexB/oprM外流泵或绿脓杆菌株K385过量表达的外流泵的一个多肽至少有50％的氨基酸序列相似性。
这里用到的术语“膜通道”指位于细胞膜上的允许一种或多种类型分子跨膜运输的蛋白聚合体。这种运输可能是反映浓度梯度的被动运输，或是依赖于胞内能量供应的主动运输。
“膜通道抑制剂”类似于外流泵抑制剂，是一种能减缓或阻止分子利用相应的膜通道进行跨细胞膜运输的化合物。
本发明也以一种增强抗微生物剂对微生物的活性的方法为特点，在该方法中将微生物与细胞中外流泵的非四环素特异性外流泵抑制剂和一抗菌剂接触。因此，当表达外流泵的细胞用抗微生物剂和非四环素特异性外流泵抑制剂处理时，本方法使抗微生物剂更有效地作用于该细胞。在具体的实施方案中，微生物为细菌，如上面第一个方面中指出的菌种中的任何一种，抗菌剂可选自抗生素的许多结构类型，例如包括β-内酰胺类、糖肽类、氨基糖苷类、喹诺酮类、四环素类、利福霉素类、香豆霉素类、大环内酯类和氯霉素类。在具体的实施方案中，上面类型中的抗生素可为前面提到的那些。
在另一个方面，本发明提供了对哺乳动物细胞感染有效进行治疗的药用组合物，其中包括药用载体和外流泵抑制剂。这样的组合物可含有无其它抗菌剂存在时为有效抗菌剂的外流泵抑制剂。这样的组合物可单独用于治疗感染。在其它的组合物中，外流泵抑制剂可提高细菌对其它抗菌剂的敏感性，因而这种组合物应与这样的抗菌剂合用。本发明也提供了对哺乳动物感染的治疗同样有效的药用组合物，它包含外流泵抑制剂和抗菌剂。同样本发明也提供了含抗菌剂、外流泵抑制剂和载体的药用制剂。
在某些优选的实施方案中，外流泵抑制剂具有下面通用结构1-4中所示的一种结构
其中R＝烷基(C1-C4)、氟烷基(C1-C4)、过氟烷基(C1-C4)、烷氧基(C1-C4)、烷硫基(C1-C4)、卤素(Br，Cl，F或I)、芳基(C6-C10)、单取代芳基(C6-C10)[用烷基(C1-C4)、烷氧基(C1-C4)、烷硫基(C1-C4)、卤素(Br，Cl，F或I)、氨基、单取代氨基[用烷基(C1-C4)任选地取代]、双取代氨基[用烷基(C1-C4)或羟基的任意组合任选地取代]任选地取代]、双取代芳基(C6-C10)[用烷基(C1-C4)、烷氧基(C1-C4)、烷硫基(C1-C4)、卤素(Br，Cl，F或I)和氨基的任意组合]、2-(或3-)-噻吩基、2-(或3-)-呋喃基、或2-(3-或4-)-吡啶基。W＝H，NH2，单取代氨[用烷基(C1-C4)任选地取代]，双取代氨[用烷基(C1-C4)的任意组合任选地取代]，氮杂环[如N-吗啉基，N-哌嗪基，N-吡咯烷基，N-咪唑基，N-吡咯基，N-吡唑基，N-三唑基，或N-四唑基]，卤素(Br，Cl，F，I)，羟基，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，R1＝(CH2)nNRbRc，(CH2)nNHC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nSNHC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nN＝CNRbRc，(n＝2-4)；Ra(Rb或Rc)＝H，烷基(C1-C4)，芳基(C6)，取代芳基，苯基，取代苯[用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，卤素(Br，Cl，F或I)，或氨基任选地取代]，或Ra+Rb＝(CH2)2-3或-CH＝CH-，X＝芳基(C6-C10)，-(CH2)0-2芳基(C6-C10)，取代芳基(C6-C10)[用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，卤素(Br，Cl，F或I)，或氨基任选地取代]，取代-(CH2)0-2芳基(C6-C10)[用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，卤素(Br，Cl，F或I)，或氨基在芳基上取代]，2-(或3-)-噻吩基，2-(或3-)-呋喃基，2-(3-或4-)-吡啶基，苯并呋喃基[在苯并呋喃环的任何位置]，苯并噻吩基[在苯并噻吩环的任意位置]。其中存在着非对称中心，其绝对立体化学性质可能是R或S构型，或为外消旋混合物，都包含在通用结构描述中。
符合上述通用结构的化合物可通过化学领域的技术人员熟知的化学合成方法获得。
“载体”或“赋形剂”是一种用于使化合物的给药更容易，如提高上述化合物的溶解性的化合物或材料。固体载体包括，如淀粉，乳糖，磷酸二钙，蔗糖和高岭土。液体载体包括，例如无菌水，盐水，缓冲液，非离子型表面活性剂，和食用油如油脂，花生油和芝麻油。另外，一些本领域常用的辅剂也可包括在内。这些和其它这样的化合物在文献中有描述，如Merck目录，Merck & Company Rahway，NJ.药用组合物中不同成分的混合应注意的事项已有描述，如在Gilman等，1990年编《Goodman和Gilman’s治疗的药学基础》(Goodman and Gilman’sThe Pharmacological Basis of Therapeutics)，第8版，Pergamon Press。
在另一个方面，本发明提供了一种遏制表达非四环素特异性外流泵的细菌生长的方法，该方法通过将该细菌与非四环素特异性外流泵抑制剂在低于细菌MIC的浓度的抗菌剂存在下作用，而抑制细菌生长。这种方法可用于，例如防止或解决具有外流泵的细菌对细胞培养的污染。然而，它可用于需要这种生长抑制的任何情况。
在相关的方面中，本发明提供了一种抑制细菌生长的方法，该方法包括将细菌与能降低外流泵的一种组分的表达的外流泵抑制剂接触，这样的抑制剂可以多种不同的方式在表达的调控中起作用。例如，它可能提高阻止外流泵成分表达的阻遏物分子产量。另一种可能的机制是，抑制剂是否阻止了阻遏物分子的释放。这样的阻遏物分子的实例是大肠杆菌中的MarR(Seoane和Levy，1994年，《美国微生物遗传学学会会议摘要》(Abstr.ofthe Am.Soc.for Microbiol.Gen.Meeting)，Las Vegas，NV.Abstr.H-26)。正调节物的一个实例是枯草杆菌中的BmrR(Ahmed等，1994年《生物与化学杂志》(J.Biol.Chem.)。
在另一个相关的方面中，本发明提供了一种减少细菌株群体数量的方法，该方法包括将群体与抑制该群体的细菌表达的外流泵的一种成分的外流泵抑制剂接触，该外流泵对表达该外流泵的细菌的生长是必需的。在具体的实施方案中，该成分为质膜成分。如上所述，这样的外流泵抑制剂可以多种方式起作用，包括但不限于直接与基本成分作用，或抑制该成分的表达。
术语“减少群体数量”意味着该群体的细菌将被杀死。这区别于阻止细菌生长和繁殖的抑菌剂。按照本方面的叙述，外流泵的“基本成分”是对细菌在体内存活，即在宿主中存活所必需的成分。
在另一个方面，本发明提供了一种通过给予动物某种外流泵抑制剂而促进动物生长的方法，该外流泵抑制剂可抑制存在于动物中的细菌株表达的外流泵，并抑制该细菌株的生长。这种生长促进效应可能是降低了细菌的能量消耗，从而提高了动物对食物能量的利用。本方法适用于，例如牛，猪，和鸡和火鸡等家禽。
本发明其它的特点和优点将在下面的优选实施方案的描述和权利要求中表现出来。附图简述

图1表示外流泵分为三大类。
图2为绿脓杆菌外流泵MexA/MexB/OprM的图示，表明了三种组分预期的空间关系。在该图中，MexB横跨质膜，MexA跨过周质空间，而OprM跨过外膜。右边的图表明如果试验化合物抑制了外排作用(如通过抑制一种泵成分)，通常外排的抗生素(如环丙氟哌酸)将在细菌胞质中聚积。
图3显示了实施例1中描述的用过量产生运输环丙氟哌酸的外流泵的菌株和不产生该外流泵的菌株进行筛选的预期结果。过量产生的菌株，在外流泵抑制剂存在下，加入亚MIC浓度的环丙氟哌酸，将不再生长。
图4是实施例2中描述的报道方法的概括图示。
图5显示了实施例3中阳性生长筛选的成分及其相互关系。
图6显示了四种绿脓杆菌菌株中四环素在胞内的聚积。超敏感性菌株799/61表现出了最高的胞内浓度。
图7表明了用于L-苯丙胺酰-L-精氨酰-β-萘酰胺的体外鉴定的四种绿脓杆菌菌株外流泵的特点。
图8显示了L-苯丙胺酰-L-精氨酰-β-萘酰胺分别与四环素，和环丙氟哌酸对图4中鉴定的四种绿脓杆菌菌株中的每一种的协同效应。
图9图示了绿脓杆菌株PAO1在不同浓度的L-苯丙胺酰-L-精氨酰-β-萘酰胺中24小时后对13种抗生素的敏感性的倍数提高。
图10表明了绿脓杆菌株PAO1和K385在20μg/ml L-苯丙胺酰-L-精氨酰-β-萘酰胺存在和不存在时对13种抗生素的敏感性(MICs)。
图11说明了四种两性氟喹诺酮的疏水性程度与由L-苯丙胺酰L-精氨酰-β-萘酰胺引起的敏感性倍数提高的关系，表现出直接的关系。
图12表明了环丙氟哌酸对26株包括临床分离的和实验室的绿脓杆菌株的MIC的减小。
图13-15显示了，3株绿脓杆菌株的杀死时间研究的结果。各菌株均在每种抗生素存在或不存在，有和无L-苯丙胺酰-L-精氨酰-β-萘酰胺的情况下对四环素和环丙氟哌酸进行试验。
图16显示了一些菌种，从这些菌种中选出的菌株用于L-苯丙胺酰-L-精氨酰-β-萘酰胺对环丙氟哌酸的增强作用试验，指出了从每一菌种中选出的、显示出增强作用的部分试验菌株。
图17比较了L-苯丙胺酰-L-精氨酰-β-萘酰胺对大肠杆菌Acr+和Acr-菌株对吖啶橙的敏感性的影响。
图18显示了绿脓杆菌株PAO1和一DNA旋转酶突变株间L-苯丙胺酰-L-精氨酰-β-萘酰胺对环丙氟哌酸敏感性的影响的比较。
图19显示了在CCCP或L-苯丙胺酰-L-精氨酰-β-萘酰胺存在时三种产生外流泵的绿脓杆菌株中四环素聚积的变化。
图20显示了CCCP和L-苯丙胺酰-L-精氨酰-β-萘酰胺对绿脓杆菌株799/61中四环素聚积的影响的差异。
图21提供了L-苯丙胺酰-L-精氨酰-β-萘酰胺的一种结构表达式。优选实施方案的叙述外流泵的生理功能细菌利用运输体从胞质中向胞外介质中外排分子。大多数已知的运输体与不能透膜扩散或扩散非常慢的分子的运输有关。外排到胞外介质的分子包括蛋白质，肽，荚膜多糖，寡聚糖，铁载体和药物。运输体允许分子透过质膜并在革兰氏阴性细菌中透过外膜，并可根据其序列同源性及能量来源分为三个主要家族(H.Nikaido，1994年《科学》(Science)264卷382-388页；Dinh等，1994年《细菌学杂志》(J.Bacteriol.)176卷3825-3831页)。(见图1)。ABC(ATP-结合盒)家族包括药物和酶运输体，这个家族包括与蛋白分泌有关的运输体。例如HlyD与大肠杆菌中溶血素的外排有关，而在绿脓杆菌中碱性蛋白酶由AprE系统外排。哺乳动物细胞中发现的多药外流泵，金黄色葡萄球菌中的P-1糖蛋白和MsrA属于这一类。主要的促进子超家族包括如Tet外流泵的特异性外流泵，并与参与从胞外介质摄取营养的运输系统如Xyl系统有关。这种主要促进子家族以质子动力为能量源。第三个家族重金属耐受性/生节因子家族包括，与铁载体的分泌有关的运输体，例如绿脓杆菌中的MexA，与草木犀根瘤菌中的生节因子的外排有关的运输体，和与抗生素的外排有关的具有广泛底物特异性的外流泵，如绿脓杆菌中的mex泵或大肠杆菌中的Acr.铁离子代谢与外流泵铁离子是生命体中最普通的过渡金属，并是所有病原菌的基本营养物质(Wooldridge和Williams等，1993年《FEMS微生物学评论》(FEMS Microbiol.Rev)12卷325-348页)。铁离子的利用在感染的发生和发展中起着重要作用。人体中胞外的铁离子与高亲和性铁结合蛋白转铁蛋白和乳铁蛋白结合。转铁蛋白和乳铁蛋白通过限制病原微生物铁离子的利用，有助于宿主抵御感染。细菌在体内需要铁离子才能生存和繁殖，从而演化出不同的获取铁离子的方法。细菌合成并向外部介质排放对铁离子具有高亲和力的分子，当这些分子螯合铁离子后，又被运回细胞(Wooldridge和Williams，1993年)。这些分子通常被称作铁载体并对细菌感染的发展是必需的。与铁载体的合成以及它们的外排和摄取有关的系统受外部介质中可利用的铁离子的严格调节。绿脓杆菌合成两种主要的铁载体，绿脓菌荧光素和绿脓菌螯铁蛋白。两种铁载体均能除去转铁蛋白结合的铁离子(Sriyosachati和Cox，1986年，《感染与免疫》(Infect.& Imm.52卷885-891页；C.Wolz，1994年《感染与免疫》62卷4021-4027页)。与绿脓菌螯铁蛋白相比，绿脓菌荧光素是一更有效的铁离子清除剂并对铁离子具有更高的亲和力，它能有效地从转铁蛋白复合物中除去铁离子。绿脓菌荧光素是一大的水溶性分子，分子量1.5KD。它不能穿过膜的脂层扩散，而需要借助运输系统穿过质膜。尽管铁载体的摄取系统在文献中已有描述(Gensberg和Smith 1992年《普通微生物学杂志》(J.Gen.Microbiol.)138卷2381-2387页)，但直至现在其分泌途径本身才被推知。外流泵与铁载体的外排有关，因为需要它们细菌才能分泌铁载体，否则铁载体因其巨大的体积及亲水性而不能越过外膜和内膜。在绿脓杆菌中，mexAB，oprM操纵子的表达受培养基中铁离子含量的调控，并与主要的铁载体绿脓菌荧光素成分的产生与摄取共同受到调控(Poole等，1993a)，由于铁离子的运输对成功的绿脓杆菌感染是必需的(P.Sokol，1987年《感染与免疫》55卷2021-2025页；B.Haas，1991年《感染与免疫》59卷3997-4000页；Woods和Iglewski，1982年《感染与免疫》35卷461-464页)，因此该泵的抑制将干扰细菌铁离子的代谢从而减弱其毒力。主动外排作用作为药物耐受性的机制约在1980年，当S.B.Levy及其同事揭示了大肠杆菌质粒编码的四环素耐药性是基于能量依赖的外流泵后，毒性剂的主动泵出或跨膜外排作用引起的耐药性开始引起了科学家们的兴趣。随后不久又证实了金黄色葡萄球菌的质粒编码的钙耐受性也是基于外排机制。
在许多有机体对许多药剂的耐受中，主动外排起着主要的作用，这已逐步得到认可。在Neu列出的三种临床相关的与降低的通透性有关的耐药机制中，有两种，可能所有三种都主要是由于外排。(i)1987年，Neal和Chater首先证实，天蓝色链霉菌可保护自己免受它产生的亚甲霉素的杀伤，在产生抗菌素的链霉菌属的菌种中，已鉴定了许多抗生素外排基因。它们中的一些属于MF家族，其它的属ABC家族。(ii)金黄色葡萄球菌中的一种新型的质粒介导的大环内酯耐药性，起先认为是由于降低的通透性，已被证实与主动外排有关。(iii)氯霉素耐药性最常见的机制与药物的酶促乙酰化有关。“氯霉素耐药性的非酶促机制”起先也被认为是由于氯霉素内流作用降低，已发现也是由主动外排引起的，因为转座子Tn 1696中的cmLA基因表现为MF家族的一个主动外流运输体。而且，流感嗜血杆菌含一同源的染色体基因，这一(也许许多其它的)菌种中的一些非酶促耐药性很可能是由于主动外排作用。(iv)葡萄球菌中质粒编码的对季铵抗菌剂的耐药性被证实与外排作用有关，即通过MF型的QasA-QacB运输体和Smr型的QacC运输体。这些蛋白质也能泵出一些碱性染料。(v)一种氟喹诺酮诺氟沙星的主动外排在野生型大肠杆菌中首次发现。一个与相似的主动外排过程有关的基因(norA)随后从金黄色葡萄球菌的耐药性突变体的染色体上测序并被证实编码MF家族的一个外排运输体。NorA可泵出许多种氟喹诺酮。外流泵的鉴定当去能的细胞比赋能的细胞聚积更多的底物时，细胞中存在的外流泵可被检测出来。(S.B.Levy，1992年《抗微生物剂化学疗法》(Antimicrob.Agents Chemother.)36卷695-703页)。去能指使能量依赖的外流泵不能利用能量。例如，这可通过使已赋能的膜去极化，消除质子动力(PMF)而完成。由于许多已鉴定的外流泵是受PMF驱动的，因而这种方法是合适的。浓度差异可通过物质在细胞中的积累直接测出，或者用另一种方法，将已积累了某种物质的细胞移入不含该物质的培养基中，在能量存在或不存在的情况下，测出该物质从细胞中失去的速率或培养基获得该物质的速率。对于不同的外排体系，可用到不同的能量阻滞剂，如氰化物，2，4-二硝基苯酚(dnp)和羰基间氯苯腙氰化物(cccp)。对于某些外流泵，其外排活性也可利用带有膜蛋白翻转囊状体来进行研究(S.B.Levy，1992)。
另一种方法，外流泵可通过它们降低底物在细胞中的聚积的能力来鉴定。与药物耐受性有关的外流泵能被鉴定是因为它们能赋予对抗生素的耐药性。细菌中与多药耐受性有关的外流泵通常对广泛的抗生素具有中等水平的耐药性。特异的耐药机制，包括特异的外流泵，对一种抗生素或一组结构上相关的抗生素的耐受水平则高得多。对大量不相关的抗生素表现出低水平耐药性的菌株可能表达一种与抗生素主动外排有关的泵。为了鉴定外流泵是否与一给定菌株的抗生素耐药性有关，应使用怀疑能被外流泵外排的抗生素进行聚积实验。应研究质膜蛋白电泳后的蛋白图谱以鉴定某种蛋白的过量表达或凝胶电泳后蛋白谱中新带的出现。对于革兰氏阴性细菌，也应研究其外膜蛋白。由于外流泵通常存在于大多数细菌，野生型细菌中抗生素本底水平的敏感性可能由天然存在的外流泵引起。用这样的菌株进行聚积实验可证明外流泵的存在。用含抗菌素的培养基可分离出过量表达外流泵的突变体。这些突变体对抗生素具有更强的耐药性并将聚积较低水平的抗生素。它们也能过量表达质膜和/或外膜中的蛋白。相似地，对抗生素高敏感的突变体也可分离出来并如上进行研究。这些突变体将以更高的水平聚积抗生素且膜蛋白以更低水平表达。以抗生素在绿脓杆菌中的聚积为例，在四个不同的绿脓杆菌株中测量了四环素的聚积1)产生本底水平外流泵的野生型菌株PAO1，2)和3)菌株PAO4098E和K385来自PAO1，为两种不同外流泵的过量生产者，4)菌株799/61，一个不产生可检测量的任何外流泵的菌株并对抗生素高敏感。四环素聚积的本底水平与这些菌株产生的外流泵的量相关。菌株799/61比野生型PAO1聚积更多的四环素，而两种过量产生外流泵的菌株则聚积更少量的四环素。(见图6)细菌中的多药外排系统本领域的一个重大发展是发现了能处理多种药物的细菌外流泵，它是哺乳动物细胞中mdr体系的残迹。诸如QacA，Smr，QacE或MyrC的体系能泵出季铵化合物以及碱性染料并常被称为多药外排系统。但是，这些系统的底物至少具有物理相似性，均为带正电荷的两性分子。相反，发现于枯草芽孢杆菌若丹明-6G-耐受性突变体的Bmr运输体，不仅催化阳离子型染料如若丹明-6G和溴乙锭，抗生素嘌呤霉素(碱性)和纺锤菌素(强碱性)，和有机阳离子四苯的主动外排，也催化氯霉素(无电荷)的主动外排。后来也证实它泵出氟喹诺酮，它们中的大多数在中性pH下以两性离子状态存在。金黄色葡萄球菌中的NorA被证实为Bmr同源物并确实表现为泵出阳离子性染料嘌呤霉素和氯霉素，它们是化学结构和物理性质均不相关的溶质。
另一个多药外排系统在大肠杆菌的抗解偶联剂羰基间氯苯腙氰化物(cccp)的突变体中得到鉴定。这种运输体EmrB也泵出一些不相关的化合物如乙酸苯基汞，萘啶酮酸(弱酸性)和硫代乳霉素(无电荷)。
大肠杆菌K12的acrA突变体，被认为由于提高了外膜通透性而产生药物超敏感性，表现出灭活多药外排复合体AcrAE。在野生型acrA+菌株中，吖黄素稳定状态的聚积非常低。因为阳离子型染料必须在胞质中浓缩，以应答跨质膜的内部阴离子势能，这意味着吖黄素必须非常活跃地泵出。在一acrA突变体中，稳态聚积至少提高了5倍，表明AcrAE外排系统参予了这种染料的排出。这解开了一个长期存在的谜，因为尽管进行了许多研究，但在AcrA突变体的外膜尚未发现缺陷，而且已证实它们外膜的通透性至少对一种探针是正常的。AcrAE系统的底物范围似乎非常广泛，包括亲水性抗生素如新生霉素，红霉素(一种大环内酯)，梭链孢酸，丝裂霉素C和四环素，以及去污剂十二烷基硫酸钠(SDS)。
大肠杆菌染色体基因束中的一个改变marRAB，也对广泛的抗生素产生明显的抗药性，这些抗生素包括喹诺酮类，氯霉素，四环素和β-内酰胺。(至少对氟喹诺酮和四环素的耐药性似乎与外排有关)。但是MarA是一个影响许多过程的调控蛋白，受这个蛋白影响的泵的性质和数量目前还不清楚。
最近，绿脓杆菌对大量抗微生物剂的固有耐药性被揭示出是因为其外膜的低通透性，也因其外排系统。绿脓杆菌的临床分离株，甚至在不含R质粒时，也表现出对抗微生物剂具有广泛的、不同水平的“固有”耐药性。而且，在对不同药剂如β-内酰胺，氯霉素，四环素和氟喹诺酮的耐药性水平间存在良好的相关性。因而固有的耐药性的不同水平被认为是由外膜通透性相应的差异引起的。然而实验事实推翻了这一假说。当试验不同药物的聚积时，发现甚至绿脓杆菌野生型菌株也能非常有效地泵出四环素，氯霉素和诺氟沙星，而且这种活性与该菌株固有的耐药水平有关。
这种外排系统的遗传同一性由K.Poole及其同事的研究提出。(Poole等，1993a《分子微生物学》10卷529-544页，和Poole等，1993b，《细菌学杂志》175卷7363-7372页。)这些参考文献作为一个整体在此引入作为参考。在对绿脓杆菌Fe3+摄取的研究中，他们克隆了一个操纵子mexA-mexB-oprM，它被认为在铁载体绿脓菌荧光素的外排中起作用。(ORFC产物在上面Poole等的参考文献中被鉴定为OprK，目前被鉴定为OprM(Poole等，未发表的信息)，并在此引入作为参考)，MexB具有RND家族运输体的典型序列。当这个操纵子被插入突变灭活后，该绿脓杆菌株几乎变得与大肠杆菌一样对氯霉素和四环素敏感。这表明这个单一的外排系统是该菌株表现出普遍的药物耐受现象的主要原因。
主动外排似乎也在一些绿脓杆菌的β-内酰胺耐药性中起作用。绿脓杆菌产生一种染色体编码的可诱导β-内酰胺酶，而这个酶与外膜屏障间的协同作用解释了它对一些表现为该酶的强诱导物的化合物的耐受性。但是，具有高的固有耐药性的菌株也对并不诱导β-内酰胺酶并对酶促水解非常稳定的化合物具有的高耐受性。而且，这些菌株中β-内酰胺作用的目标或者β-内酰胺酶的水平或性质并没有改变。这些结果表明它们的β-内酰胺耐药性也是由主动外排引起的。但是，与其它疏水性试剂不同，一些β-内酰胺不能越过质膜屏障，它们的作用物在质膜的周质侧。在这里重提哺乳动物mdr蛋白明显地阻止其底物跨脂双层膜运输是有益的。对双层不通透的β-内酰胺的观察结果给这个观点以有力的支持。
尽管绿脓杆菌外排系统表现出来的广泛的底物特异性有些令人吃惊。但这样广泛的特异性早已为人所知。例如，哺乳动物mdr泵不仅泵出碱性化合物，如阿霉素，也泵出中性化合物，如紫杉醇和弱酸性化合物，如光辉霉素。实际上，哺乳动物mdr泵受疏水性的头孢菌素抑制，估计它是作为其底物类似物。外排系统与外膜屏障外排运输体位于质膜，因此在革兰氏阴性细菌中，可假想药剂被泵入周质中(见图2)。如果这样，外排作用就不可能使这些细菌在没有其它因子下更具耐药性，因为外膜屏障的存在使这些抗微生物剂不容易离开细胞。克服这种屏障的一个方法可能是在革兰氏阴性细胞中MF和RND家族的许多外排运输体与一些辅助蛋白同时存在。这些蛋白被认为是胞质运输体和一外膜通道间的“桥”，从而药物能直接外排到外周介质中而不进入周质(图2)，因为它们与革兰氏阴性细菌中的一组蛋白有关，包括HlyD，LktD，CyaD，AprE和CvaA，它们同样作为桥并帮助直接将其底物蛋白质外排至外部介质中。因而辅助蛋白与外膜中的一些通道蛋白如TolC形成复合物是可能的。最近在绿脓杆菌中发现mexA-mexB-oprM系统支持了这个模型。这个假定的操纵子不仅编码一个辅助蛋白MexA，也编码一个外膜蛋白oprM，而且这个基因组合提示这三种蛋白形成复合物，该复合物可能形成一个对外面介质开放的连续通道(图2)。事实上，OprM与外膜蛋白CyaE和PrtF表现出序列同源性，这些外膜蛋白可能与三成分外排复合物的形成有关，该复合物含一胞质蛋白运输体，一个周质辅助蛋白和一外膜通道，在百日咳杆菌和菊欧文氏菌中它们分别将细胞溶素和蛋白酶B和C直接外排到介质中。而且，OprM的灭活同MexA的灭活一样，可导致对许多药剂的超敏感性。现在还不知道那些不含辅助蛋白的系统是如何有效地将药剂外排到介质中。但是，对那些表达这样的外膜蛋白如OprM和绿脓杆菌过量表达的50kDa蛋白的细菌来说，外膜为这里描述的外流泵抑制剂提供了另一个目标物。
如已提到的，外膜的低通透性单独不能产生临床上显著的耐药性，产生这样高水平的耐药性需要另一种协同因素。在许多系统中，主动外排系统似乎是这样的因素。但这并不意味着外膜屏障不重要。由于许多药物的胞内浓度是内流和外排平衡的结果，因而在如绿脓杆菌的有机体中，很可能许多药剂透过低通透性外膜缓慢的内流作用使得外排作用成为特别有效的耐药机制。也就是说，就算是具有高通透性外膜的有机体如大肠杆菌，尽管具有较有效的外排系统，也不能产生显著水平的耐药性，除非药剂具有大的体积或能降低其跨过外膜的透过率的结构。
在这个方面，大肠杆菌marRAB基因突变体产生更少量的OmpF孔蛋白是非常重要的，它们在大肠杆菌的两个非特异性孔蛋白间产生更大的通道，从而在大多数抗生素的渗透作用中起着决定性作用。随着内流作用的降低，主动外排作用将产生高得多的耐药性。革兰氏阴性细菌中一些质粒编码的外排运输体也可能利用了类似的机制，早在1978年就报道了一个抑制OmpF孔蛋白合成的R质粒。流感嗜血杆菌中与非酶促氯霉素耐药性有关的基因，很可能为CmlA外排运输体(见上)的同源基因，能抑制该有机体主要孔蛋白的合成。克隆的CmlA基因能抑制大肠杆菌中孔蛋白的合成。具有非酶促氯霉素耐药性的伤寒沙门氏菌的一个临床分离株可能带有含OmpF的转座子。这种由一些质粒和转座子编码的外排基因降低外膜通透性的能力迄今被证明只有非常窄范围的耐药性因子。如果这样的活性与广泛底物外排运输体结合起来，将产生重大的保健问题。
常常伴随着OmpF孔蛋白合成抑制的外排运输体的表达提高，可在没有任何遗传改变的情况下发生。因此，氯霉素和四环素提高MarA调节蛋白的转录，从而可能提高一种或多种外排运输体的合成。有意思的是，病原菌在宿主组织中所处的氧分压，已知能产生OmpF阻遏而提高对某些抗菌剂的耐药性，这可能是外排作用提高的结果。相似地，植物组织中应答微生物侵染而产生的水杨酸，已知能阻遏pmpF孔蛋白的合成从而使大肠杆菌暂时提高对氯霉素，四环素，喹诺酮类和氨苄青霉素的耐药性。这个药剂范围进一步表明一种和几种外排系统的介入。
由于抗生素耐药性的特异机制被认为更重要，生产更有效的抗生素的努力通常是在抗生素分子上的特异基团进行修饰，使它们成为常见的抗生素灭活酶的惰性底物。更普遍的耐药性机制的存在迫使人们重新评价这个策略。这些机制产生临床上显著的耐药性见于重要的机会病原体绿脓杆菌的对多种抗生素的固有耐药性确实是由于多药外排运输体和有效的通透性屏障共同作用的结果，在表现出对羧苄青霉素耐药性水平提高的大多数不列颠群岛临床分离株中，外排运输体表达的提高是其耐药性最可能的原因。对制药工业来说，生产能克服这类机制的化合物将是一个重大挑战，因为一些多药外排系统似乎能泵出几乎所有的两亲性化合物。显然，需要更多的关于这些运输体的底物结合过程的信息。另一个可行的方法将是提高药物自发的内流作用，例如，通过赋予药物足够的亲脂性从而外排作用可被快速的内流作用抵消。确实，四环素和氟喹诺酮的更亲脂的衍生物对能泵出这些药物的革兰氏阳性细菌的耐药性菌株活性更高。但在革兰氏阴性细菌中，更亲脂的药物将更慢地通过孔蛋白通道，从而提高亲脂性不可能提高药物的效力。铁载体相关的绿脓杆菌外流泵如上所述，多药外流泵存在于绿脓杆菌中。这种细菌是对许多抗菌剂具有固有耐药性的一种临床上重要的病原体。而且，通常对该有机体有潜在抗菌活性的药物(如卡巴培南和氟喹诺酮)的耐药性的发展所带来的问题出现得越来越频繁。另外，对化学上不相关的抗生素的交叉耐药性可能与氟喹诺酮耐药性相关联。具有交叉耐药性的氟喹诺酮耐药性菌株的体外研究表明耐药性可归因于外膜通透性的改变导致的药物聚积的降低。在有些例子中，这个结论是在这些突变体新外膜蛋白的鉴定基础上产生的。
在绿脓杆菌K385菌株中，50-KDa外膜蛋白的产生伴随着对2，2′-二吡啶及许多抗微生物剂敏感性的降低。(K385菌株是能够在含2，2′-二吡啶(0.5mM)、不含铁的基本培养基中生长的绿脓杆菌铁载体缺陷的突变株)(Poole等，1993a)。前述的诺氟哌酸耐药性绿脓杆菌nfxB和nfxC菌株，随着54-kDa和50-kDa外膜蛋白的产生，也相应表现出对许多抗微生物剂的敏感性降低。但与nfxC突变株不同，K385和nfxB突变株并不表现出OprD水平的降低。对非喹诺酮抗生素表现出交叉耐药性的绿脓杆菌环丙氟哌酸耐药性突变体也表达出一种新的54kDa外膜蛋白。最后，在用美罗匹宁或洛美沙星(lomefloxacin)或氧氟沙星和头孢磺啶合用筛选出的绿脓杆菌多抗生素耐受性突变株中，一个约49kDa的外膜蛋白(OprM)得到鉴定。尽管上述的突变株在耐药性的表型上有一些细微差别，但在所有例子中鉴定的外膜蛋白可能是相同的。如果是这样，很可能在产生nfxB、nfxC、OprM并具有环丙氟哌酸耐受性的突变株中导致耐药性的药物聚积降低不是由于最初认为的外膜通透性的改变，而是由于抗生素的外排作用，只要在OprM(即ORFC产物)和一些细菌外膜外流泵蛋白间具有同源性。令人感兴趣的是，大肠杆菌中喹诺酮耐药性和多抗生素耐药性也部分归因于外排机制。
除OprM外，ORFA-ORFB-oprM(ORFC)操纵子还编码40和108kDa、估计定位于质膜上的两种蛋白。鉴于ORFAB产物和质膜外流泵蛋白间的同源性，似乎ORFAB在抗生素耐受性和抗微生物剂跨质膜外排作用中起作用。由于这个原因，ORFAB特指mexAB(多药外排泵)。
ORFABC(mexA-mexB-oprM)操纵子受铁离子调控，并且，OprM确实在一定的铁离子限制条件下是可诱导的。当生长在铁离子缺乏的BM2基本培养基中时观察不到蛋白质的诱导作用可能是因为BM2的磷酸盐成分中显著的铁离子污染，BM2培养基中铁离子的缺乏不如其它基本培养基。这表明相当的OprM(因此也包括ORFABC[mexA-mexB-oprM])表达需要更严格的铁离子限制。例如，当生长在铁离子缺乏的以HEPES缓冲的基本培养基中时，OprM容易被诱导，这种培养基被铁离子污染的程度更小。当然，与低铁离子含量相对应，在这种培养基中铁载体的产量比在铁离子缺乏的BM2基本培养基中高三至四倍。同样地，在预期能减少可利用的铁离子的铁离子螯合剂2，2′-吡啶存在的条件下生长将使OprM被诱导。观察到的OprM受Zn2+诱导的现象与这种蛋白的铁调控一致，因为已知Zn2+能增强绿脓杆菌中铁离子调节成分包括铁载体及其受体的表达。Zn2+对铁载体产生相似的影响也发现于荧光假单胞菌和维涅兰德固氮菌。在后面的例子中，Zn2+增强铁载体的产量是因为Zn2+抑制了三价铁还原酶活性而导致了胞质中二价铁离子的减少。
ORFABC(mexA-mexB-oprM)除了受铁离子调控外，这个操纵子也与绿脓菌荧光素成分的产生与摄取共同受到调控，这表明它在绿脓菌荧光素的分泌中起作用。观察到的ORFABC(mexA-mexB-oprM)产物与许多细菌外排蛋白的同源性与这个结论明显一致。而且，尽管作为ORFABC(mexA-mexB-oprM)外排系统的底物的抗生素在结构上差别很大，但它们有一些共同特征(一个芳环)，而且大多数都具有结合阳离子包括铁离子的能力。在这个方面，它们类似于绿脓菌荧光素中含几茶酚的发色团。这表明ORFABC(mexA-mexB-oprM)依赖的药物耐受性是某种抗微生物剂与绿脓菌荧光素相似的结果，而绿脓菌荧光素可能是ORFABC(mexA-mexB-oprM)外排系统的真正底物。显然，ORFABC(mexA-mexB-oprM)产物具有非常广泛的底物特异性，可能不仅绿脓菌荧光素，而且其代谢物，均为该外排系统的天然底物。因此，ORFABC(mexA-mexB-oprM)可能不仅在开始的绿脓菌荧光素分泌，而且在再利用的绿脓菌荧光素及其该过程的代谢物的分泌中也起着作用。
铁离子运输成分广泛的底物特异性的优越性在大肠杆菌铁离子调节外膜蛋白Fin和Cir的研究中也有发现，这两种蛋白据报道与嗜铁铁肠杆菌素水解产物的摄取有关。这些蛋白也可促进含铁螯合基团的抗生素，包括儿茶酚取代的β-内酰胺的摄取。
ORFAB(mexABC)产物与蛋白AcrA和AcrB间引人注目的高度同源性是相同功能的强烈暗示。尽管AcrA和AcrB被认为是与吖啶黄素和其它抗微生物剂耐受性有关的外排蛋白，但吖啶黄素不可能是这些蛋白正常的细胞底物。但是，注意到象绿脓菌荧光素一样，大肠杆菌铁载体肠杆菌素也是一个含儿茶酚的分子是非常有趣的。因此，AcrA和AcrB可能在肠杆菌素和/或它的代谢物的分泌中起作用。ORFAB(mexAB)产物和EnvCD(与AcrAB也具有高度同源性)间已证实的同源性表明大肠杆菌可能利用多系统外排肠杆菌素。β-内酰胺相关的绿脓杆菌外流泵除了上面讨论的mexAB-oprM泵外，另一个绿脓杆菌外流泵也与β-内酰胺耐药性有关。由于β-内酰胺的作用位点位于质膜的外表面，因而β-内酰胺不用进入胞质行使其功能，因此主动外排作为β-内酰胺耐药性的一个重要因子，是令人吃惊的。另外，许多β-内酰胺上羧基的存在意味着它们不能迅速地扩散透过质膜。但是，耐药性被证实并不归因于外膜的低通透性或β-内酰胺酶水平的改变(Li等，1994年《抗微生物剂化学疗法》(AntimicrobAgents Chemother)38卷1742-1752页)。
实验表明在高耐药性的绿脓杆菌中，两种质膜蛋白与一种外膜蛋白高表达。这些蛋白的表达水平明显地高于没有高耐药性的相关菌株。另外，超敏感性突变株K799/61似乎缺乏主动外排系统，因为它基本上不能泵出四环素和氯霉素，这暗示在高耐药性菌株中三种过量产生的蛋白是绿脓杆菌外流泵系统的成分。这项工作常用的材料与方法见Li等1994年《抗微生物剂化学疗法》(Antimicrob.Agents Chemother)38卷1732-1741页和Li等1994年《抗微生物剂化学疗法》38卷1742-1752页。全部这些文献在此引入作为参考。
这些蛋白质的氨基酸序列很容易用本领域的技术人员熟知的方法确定。例如，每种蛋白都可从高水平产生这种外流泵的已鉴定菌株中分离纯化。每种纯化蛋白质的氨基酸序列随后可用标准的氨基酸测序法确定。编码每种蛋白的核酸序列同样可用许多不同方法中的任何一种方便地确定。一种方法是，一个蛋白质一部分的氨基酸序列可转换成一套简并的寡聚核苷酸探针(优选使用低编码简并性的序列)，它们中的每一种约八至二十个核苷酸。这样一套简并的探针随之用于探测该多肽全长的编码序列。一旦探测到，该编码序列可用通常的重组技术操作并测序，以证实它为给定多肽的基因。另一种方法是，外流泵缺陷菌株中对应于丢失或缺陷的外流成分的编码序列可被鉴定并分离及测序。尽管举例说明了这些方法，但其它的方法也可有效地使用，而且在特定的情况下可能是优选的。外流泵必需基因外流泵对绿脓杆菌细胞是重要的。已有很好的间接证据表明外流泵胞质成分的抑制对细胞是致死的。产生无效mexB突变株的唯一方法是利用绿脓菌荧光素产生缺陷的菌株或不能在铁离子缺乏的培养基中生长并且铁离子代谢损伤的菌株。(Poole等，1993年《分子微生物学》(Mol.Microbiol.)10卷529-544页)如果mexB突变株事实上是致死的，那么外流泵胞质成分的抑制剂可能是杀菌的。外流泵的抑制本发明表明致病菌中的外流泵，尤其是多底物外流泵的存在，可用在筛选化合物以发现外流泵抑制剂的方法中。如该术语所示的，也如概述中所述的，这样的抑制剂能降低外流泵从胞质中外排抗菌剂的能力。本发明表明这样的筛选方法可为具有多药外流泵的细菌设计，尤其是绿脓杆菌外流泵，如mexA/mexB/oprM和菌株K385和PAO4098E中过量表达的外流泵。
一种方法是以外流泵抑制剂能减缓抗菌剂从细菌细胞中的外排为基础。当含外流泵的细菌在能被该外流泵外排的抗菌剂存在的情况下生长但该抗菌剂浓度很低而不能明显地抑制细胞生长时，外流泵使该药剂在细胞内保持非常低的浓度。但是，当某种外流泵抑制剂也存在并且其浓度足够高能明显地抑制该外流泵的活性时，它能提高抗菌剂的胞内浓度。抗菌剂浓度的提高将能抑制细胞生长。抗菌剂抑制细胞生长的能力可用两个相关的细菌株证实，其中一种高水平产生外流泵，而另一种不产生。因此，所用抗菌剂的浓度必须足够高以抑制不能高水平产生外流泵的菌株的生长。但也必须足够低以使高水平产生外流泵的菌株的生长不能被明显抑制。因而抑制高水平外流泵菌株生长的化合物被鉴定为假定的外流泵抑制剂。缘于外流泵抑制的生长抑制可通过比较同一菌株在假定的外流泵抑制剂存在、但没有抗菌剂的条件下的生长情况进一步说明。如果在假定的抑制剂和抗菌剂同时存在下的生长情况明显不如只有假定的抑制剂存在时的生长情况，那么生长抑制很可能是由于外流泵抑制，至少占大部分。在这个筛选方法的某些实施方案中，使用过量产生外流泵的菌株是非常有用的。那么抗菌剂的亚抑制浓度应该足够高以抑制该细菌野生型菌株的生长。
另一个筛选广泛底物外流泵如绿脓杆菌外流泵的抑制剂的方法，是基于报道基因的使用，报道基因的表达受一调控序列的控制，而这个调控序列可被浓度足够高的某种化合物如抗菌剂(或一无活性的类似物)诱导。在这个方法中带有可诱导的调控序列的报道基因以单拷贝形式插入细菌染色体的非必需基因中。因此，当带有报道基因结构插入的细菌生长在外流泵抑制剂化合物和某种抗菌剂(在另外一些因子缺乏时其浓度不足以明显抑制细菌生长)存在的条件下时，该抗菌剂的胞内浓度将提高。该抗菌剂胞内浓度的升高是因为外排效率的降低，如上面的方法所述。但是，在抗菌剂达到生长抑制的胞内浓度前，升高的浓度将诱导报道基因的表达。表达的发现表明外流泵的功能被抑制，即正被筛选的化合物为一外流泵抑制剂。
这个方法的一个设计用到了众所周知的调控机制，其中报道基因的表达受四环素的诱导。在这个机制中，四环素紧紧地与tetR阻遏物分子结合，阻止了tetR与tetA操纵位点的结合。没有tetR与tetA操纵位点的结合，该操纵基因下游的报道基因编码序列将被转录并随后翻译出可检测的产物。(Kirsch等，1991年《抗生素杂志》(J.Antibiotics)44卷210-217页)。如上所述，一个含tetR基因，tetA调控序列，和报道基因编码序列的结构插入到绿脓杆菌的非必需基因中。这些重组的细胞随后可如上所述用于筛选具有外流泵抑制剂活性的化合物。
上述方法与Rothstein等《抗菌剂化学疗法》(Antimicrob.AgentsChemother.)37卷1624-1629页所述的工作大不相同。该报道描述了一种用质粒上的tetR基因连同鉴定新四环素的技术筛选大肠杆菌四环素特异性外流泵抑制剂的方法。
第三种筛选方法用被细胞中外流泵运输的化合物(可检测的化合物)的光谱检测作为外流泵抑制的报道。在这个方法中，具有这种外流泵的细胞与可检测的化合物接触。在外流泵抑制剂不存在时，可检测化合物的胞内浓度与抑制外流泵外排作用的化合物存在时该化合物的胞内浓度相比，将维持在低浓度。因此，如果在试验化合物存在时检测到可检测化合物胞内浓度的升高。这表明该试验化合物抑制了泵的外排活性，从而可能是外流泵抑制剂。或者可确定可检测化合物的胞外浓度(悬浮介质中的浓度)。因而可计算出胞内浓度或直接利用胞外浓度。与外流泵抑制剂不存在时相比，抑制剂的存在使得更少的染料或荧光物质能在细胞中聚积，从而染料或荧光物质的胞外浓度将更低。
第四种筛选方法用阳性生长作为外流泵抑制的报道。这种筛选方法以外流泵刺激的抗生素灭活物的诱导为基础。因此微生物可在抑制浓度的抗生素存在下生长。该抗生素的灭活物受外流泵外排的化合物的胞内浓度升高诱导。如果外排该化合物的外流泵受到抑制(如被试验化合物抑制)，灭活物将表达(或激活)，降低以前产生抑制的抗生素的胞内浓度，这将导致可检测的生长。
这种筛选方法的一个实施方案使用同上面第二个筛选方法中一样的四环素敏感的tetA启动子。但是，该启动子连接着一个只有当tetA启动子被诱导后方可生长的基因。这种基因的一个实例是blaS基因，它编码嗜麦芽糖寡养单胞菌(嗜麦芽黄单胞菌)的L-1β-内酰胺酶。这个基因的产物可提供本筛选方法所需的阳性选择。这个融合基因将置于染色体中以获得遗传稳定性。在绿脓杆菌中L-1β-内酰胺酶被诱导后具有全部的功能，而卡巴培南则不能被绿脓杆菌的外流泵分泌。假单胞菌染色体上的β-内酰胺酶不能水解卡巴培南(J.Trias，1989年《抗微生物剂化学疗法》(Antimicrob.Agents Chemother.)33卷1201-1206页)。
筛选株将在低浓度的四环素，试验化合物和卡巴培南存在下生长。如果外流泵被抑制，四环素的胞内浓度将升高，从而诱导tetA启动子，随即是blaS的表达、L-1β-内酰胺酶将水解卡巴培南，从而细胞能够生长。如果泵未被抑制，四环素的胞内浓度将不会升高，细胞也就不能合成L-1β-内酰胺酶，也就不能在卡巴培南存在下生长。
这类筛选方法也能简单地通过改变培养基中卡巴培南的浓度提供滴定必需量的功能，提供一种寻找具有不同抑制能力的化合物的高度灵活的系统。阻滞外流泵不能改变亚胺培南的耐受性，因为这种底物不能被外流泵识别，如果泵被抑制，它也不会有所变化。泵的作用—调控机制外流泵抑制剂可通过抑制泵的正常功能或泵的正常表达或两者都被抑制而抑制外流泵。为了研究泵的调控，膜上泵的存在将被监测。例如可用标准的电泳技术对其进行监测，利用常用的蛋白染色技术(考马斯蓝或银染)或利用抗外流泵成分的抗体进行标准的Western分析，可观察到泵成分对应的带。抑制剂作用的机制将在转录水平进一步研究，例如通过利用从编码外流泵成分的基因序列中获得的探针与基因中的已知序列进行Northern分析，或通过将报道基因处于外流泵启动子的控制下并检测报道基因编码的蛋白质的活性。筛选源化合物及亚结构研究方法的说明本发明的方法适用于筛选多种可能具有外流泵抑制剂活性的源化合物。用不同库的化合物进行初步筛选，但本方法也适用于其它的化合物库。这样的库可以是天然产物库，组合库，或其它小分子库。另外，来自商品化源的化合物也可被试验。这种试验尤其适用于已鉴定的外流泵抑制剂的可商购的类似物。
通过首先限定待筛选化合物为那些具有优选结构特征的化合物，商业来源的具有已知结构的化合物可有效地用于外流泵活性筛选。例如，首先尝试建立一个用于筛选的亚库，它将增加能抑制外流泵的结构。这种尝试的策略包括获得含有哺乳动物外流泵抑制剂中常见结构特点的可商购的化合物。为了加速这种尝试，ISIS计算机程序(MDLInfbrmation Systems，Inc.)被用于可商购的化学试剂目录数据库(MDLInformation Systems，Inc.)的二维亚结构研究。这个数据库含有近175,000种可商购的化合物的结构和订货信息。其它已公开、可商购的化学品数据库也可使用。成功化合物的概述用本发明中的方法鉴定为外流泵抑制剂的实例化合物是L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺。这个化合物的一些体外特征在下面的实施例7中描述。
这个化合物可被认为具有下面结构1-4所代表的通用结构
其中R＝烷基(C1-C4)，氟烷基(C1-C4)，过氟烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，卤素(Br，Cl，F或I)，芳基(C6-C10)，单取代芳基(C6-C10)，[任选地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，卤素(Br，Cl，F或I)，氨基，单取代氨基[任选地用烷基(C1-C4)取代]，双取代氨基[任选地用烷基(C1-C4)的组合取代]，或羟基取代]，双取代芳基(C6-C10)，[烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，卤素(Br，Cl，F或I)和氨基的任意组合]，2-(或3-)-噻吩基，2-(或3-)-呋喃基，或2-(3-或4-)-吡啶基。W＝H，NH2，单取代氨基[任选地用烷基(C1-C4)取代]，双取代氨基[任选地用烷基(C1-C4)的任意组合取代]，氮杂环[如N-吗啉基，N-哌嗪基，N-吡咯烷基，N-咪唑基，N-吡咯基，N-吡唑基，N-三唑基或N-四唑基]，卤素(Br，Cl，F，I)，羟基，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)。R1＝(CH2)nNRbRc，(CH2)nNHC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nSNHC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nN＝CNRbRc，(n＝2-4)，Ra(Rb或Rc)＝H，烷基(C1-C4)，芳基(C6)，取代芳基，苯基，取代苯基[任选地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，卤素(Br，Cl，F或I)，或氨基取代]，或者Ra+Rb＝(CH2)2-3或-CH＝CH-，X＝芳基(C6-C10)，-(CH2)0-2芳基(C6-C10)，取代芳基(C6-C10)[任选地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，卤素(Br，Cl，F或I)，或氨基取代]，取代-(CH2)0-2芳基(C6-C10)[用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，卤素(Br，Cl，F，I)或氨基在芳基部位取代]，2-(或3-)-噻吩基，2-(或3-)-呋喃基，2-(3-或4-)-吡啶基，苯并呋喃基(在苯并呋喃环的任何位置)，苯并噻吩基(在苯并噻吩环的任何位置)。其中存在不对称中心，其绝对立体化学性质可能是R或S构型，或可能是外消旋混合体，都包含在结构通式中。
尽管L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺是一外流泵抑制剂，但仍需要找到具有增强的生理学外形和外排抑制活性的相关化合物。通常，鉴定具有更好的医药特性的相关化合物的一般方法是准备或获取许多起始化合物的类似物。这些化合物间存在着细微的结构差异。这些类似物随后被试验以确定它们是否保留了活性。鉴定以下因素，如对降解的耐受性，血清结合，总毒性及溶解性。根据这些分析的结果，可确定一个初步的结构活性关系(SAR)，反映了特异的结构特点或取代基与活性水平及其它一些与使用意图(例如作为治疗化合物)相关的因子之间的关系。这一信息随后可用于指导类似物直接进一步的制备和试验，以找到具有改善的综合特点的化合物。对于L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺，参照上面的通式，制备类似物的一个合理的初步方法是制备一系列W不同的类似物以找出在血清中更稳定的化合物。因此，如上所示，这样一套类似物将进行活性筛选和改良的医药特性的分析。药物组合物和给药方式为外流泵抑制剂的特定化合物可通过其本身，或通过与抗菌剂合用，或与合适的载体或赋形剂混合成药物组合物形式给予患者。外流泵抑制剂与抗菌剂合用至少有两种不同的方式。一种是，一定量的外流泵抑制剂与一定量的抗菌剂混合成混合物，如溶液或粉状混合物。在这样的混合物中，抑制剂与抗菌剂的数量比例可以变化以适合具体的合用和预期的治疗。在第二种合用方式中，抑制剂与抗菌剂共价结合，而这种结合的分子在细胞中可被断裂开。但是，术语“合用”也可指其它的可能性，包括抑制剂与另一种抗菌剂的顺次给药。另外，外流泵抑制剂和/或另一种抗菌剂可以药前体的形式给药，即该化合物以在细胞中经修饰后才能形成功能形式的形式给予患者。在治疗兴趣(interest)紊乱的患者时，可以给予这样的具有疗效量的药剂，疗效剂量指这种用量的化合物将导致症状的改善或患者生存期的延长，并可包括微生物感染的消除。
这样的化合物的毒性和疗效可在细胞培养或实验动物中用标准的药物学方法确定，例如，确定LD50(50％群体致死剂量)和ED50(50％群体疗效剂量)。毒性和疗效间的剂量比为治疗指数，并可表示为LD50/ED50的比率形式。具有大的治疗指数的化合物是优选的。从这些细胞培养实验和动物研究中获得的数据可用于配制用于人的剂量范围。优选这类化合物的剂量处于ED50很小或无毒性的循环浓度范围内。依据所用药剂形式和所用给药方式，剂量可在此范围内变化。优选外流泵抑制剂治疗的血清浓度应在0.1-100μg/ml范围内。
对于用于本发明的方法中的任意化合物，其疗效剂量可从细胞培养试验中初步估计。例如，在动物模型中可确定某种剂量以获得循环的血浆浓度范围，该范围内的IC50由细胞培养试验确定。这样的信息可用于进一步精确确定在人中的有效剂量。血浆中的药物水平可以测量，例如用HPLC方法测量。
在更优选的实施方案中，药物组合物中的外流泵抑制剂具有前述的结构通式所示的结构。
恰当的制剂，给药方式和剂量将由具体的医生视患者的情况作出选择。(见Fingl等《治疗的药学基础》(THE PHARMACOLOGICAL BASISOF THERAPEUTICS)1975年，第一章第一页)。应当注意主治医师应知道由于毒性或组织损伤而该如何及何时终止，中断或调整给药。相反，主治医师也应知道当临床反应不够时应将治疗量提到更高的水平(防止毒性)。例如条件的严格性可部分地通过标准的预后评价方法进行估价。而且，剂量和可能的给药频率将随患者的年龄，体重和对药物的反应的不同而变化。与上面类似的程序也可用于兽医学。
依据所治疗的特异感染，可配制这样的药剂并系统地或局部地给药。配药和给药方法可见于《雷明顿制药科学》(Remington’sPharmaceutical Sciences)，第18版，Mack Publishing Co.Easton.PA(1990年)。合适的给药方式包括口腔，直肠，经皮，阴道，经粘膜，或肠道给药；非肠道给药，包括肌肉，皮下，髓内注射，以及鞘内，直接心室内，静脉内，腹膜内，鼻内，或眼内注射，仅例举一部分。
为了注射，本发明的药剂应配制成水溶液，优选生理上相容的缓冲液如Hank’s溶液，Ringer’s溶液，或生理盐缓冲液。对于经粘膜的给药，在制剂中使用了适合于待渗透屏障的渗透剂。这样的渗透剂在本领域中是熟知的。
用药用载体将本发明中公开的用于实现发明的化合物配制成适合全身给药的药剂，也在本发明的范围内。选择正确的载体和合适的制造工艺，本发明的组合物，尤其是配制成溶液的组合物，可经非肠道给药，如通过静脉内注射。这些化合物可用本领域熟知的药用载体方便地配制成适于口服的药剂。这样的载体能使本发明的化合物配制成能被所治疗的患者口服吸收的药片，药丸，胶囊，液体，胶，糖浆，淤浆，悬液等。
本发明中适用的药物组合物包括那些含有有效量的活性成分能达到所需目的的组合物。有效量的确定是本领域的技术人员容易办到的，尤其是在参看了这里提供的详细的公开内容后。除了活性成分外，这些药物组合物可含有合适的药用载体，包括赋形剂和辅助剂，它们能有利于将活性化合物加工为药用制剂。为口服给药配制的制剂可以为药片、糖衣丸，胶囊或溶液的形式。本发明中的药物组合物可用已知的方式制造，例如利用传统的混合，溶解，粒化，糖衣化，悬浮(levitating)，乳化，胶囊包裹，夹裹(entrapping)或冻干等方法。
用于非肠道给药的药物制剂包括水溶形式的活性化合物的水溶液。另外，活性化合物的悬浮液也可制成合适的油状注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或溶媒包括脂肪油如芝麻油，或合成的脂肪酸酯如油酸乙酯或甘油三脂，或脂质体。水溶性的注射悬浮液可含有提高悬浮液粘性的物质，例如羧甲基纤维素钠，山梨醇，或右旋糖苷。悬浮液中也任选地含有合适的稳定剂和助溶剂使化合物可形成高度浓缩的制剂。
用于口服的药用制剂可通过将活性化合物与固体赋形剂结合，任选地将混合物捣碎，加工颗粒混合物，并加入合适的辅助剂后获得，根据需要，可制成药片或糖衣核。合适的赋形剂尤为填充剂，如糖，包括乳糖，蔗糖，甘露醇，或山梨醇；纤维素制品如玉米淀粉，小麦淀粉，水稻淀粉，马钤薯淀粉，明胶，西黄蓍胶，甲基纤维素，羟脯氨酰甲基纤维素，羧甲基纤维素钠，和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。根据需要，可加入分解剂，如交联聚乙烯吡咯烷酮，琼脂或藻蛋白酸或其盐，如藻蛋白酸钠。
糖衣核上应提供合适的包被，为了这个目的，可用浓缩的糖溶液，其中可选择性地包含阿拉伯胶，滑石粉，聚乙烯吡咯烷酮，carbopol凝胶，聚乙二醇，和/或二氧化钛，漆溶液，和合适的有机溶剂或溶剂混合物。染料或色素可用在药片或糖衣片包被中以鉴别或描述活性化合物药剂的不同组合的特征。
用于口服的药用制剂包括用明胶制成的推入配合的胶囊以及用明胶和增塑剂如甘油和山梨醇制成的柔软、密闭的胶囊。推入配合的胶囊可含有与填充剂如乳糖，粘合剂如淀粉，和/或润滑剂如滑石粉或硬脂酸镁混合的活性成分，还可选择性地含有稳定剂。在软胶囊中，活性化合物可溶于或悬浮于合适的液体中，如脂肪油，液体石蜡，或液体聚乙二醇。另外也可加入稳定剂。实施例实施例1外流泵抑制剂筛选-生长抑制筛选本试验是以能增强抗菌剂作用的分子的筛选为基础。在这个筛选方法中用到了两个绿脓杆菌菌株。菌株K385，是由K.Poole分离的一种具有多药耐药性的突变株，它能过量表达外流泵，菌株K613，一种敏感性的oprM∷Hg突变株(Poole等，1993a；Poole等，1993b)。被试验的未知分子加在培养基中，而培养基用菌株K385接种。如果试验分子抑制了外流泵，它将增强抗菌剂的作用从而抑制生长。在抗菌剂不存在时也试验这些化合物以检测它们固有的抑菌活性。筛选方法在Mueller-Hinton肉汤培养基中菌株K385的新鲜接种液在35℃培养过夜，随后用同样的培养基稀释至1/50。培养约60分钟后培养物在600nm处的OD值达到0.2-0.3。然后用新配制的Mueller-Hinton肉汤培养基稀释至1/50。每孔含50μl Mueller-Hinton培养基的微量滴定板用50μl稀释的培养物接种，在50μl培养基中含20μg/ml的试验化合物和0.5μg/ml的环丙氟哌酸。含同样体积的Mueller-Hinton肉汤培养基和试验化合物但没有环丙氟哌酸的第二套微量滴定板也用50μl稀释的培养物接种。起始生长条件为100μl Mueller-Hinton肉汤培养基中含10μg/ml的试验化合物和0.25μg/ml的环丙氟哌酸。滴定板置于35℃孵箱中孵育20小时。生长情况用微量板读数仪(Thermomax微量板读数仪，Molecular Devices)在600nm下测量。用到了以下对照未接种的Mueller-Hinton肉汤，生长在含0.25μg/ml环丙氟哌酸和不含环丙氟哌酸的Mueller-Hinton肉汤培养基中的K385菌株，生长在含0.25μg/ml环丙氟哌酸和不含环丙氟哌酸的Mueller-Hinton肉汤培养基中的K613菌株。未接种的Mueller-Hinton肉汤用于确立生长基线。环丙氟哌酸存在时试验化合物以双份进行试验。比较菌株K385在0.25μg/ml环丙氟哌酸存在下的生长情况，10μg/ml L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺的加入增强了环丙氟哌酸的作用。以所测的OD600计，生长被抑制了99％。在环丙氟哌酸不存在时，10μg/ml L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺对生长的抑制为1％。
用过量产生与K385菌株不同的另一种外流泵的菌株PAO4098E可进行相似的筛选。在这个筛选方法中试验增强剂所用的环丙氟哌酸的浓度为0.2μg/ml而不是0.25μg/ml。
如果试验化合物抑制外流泵，环丙氟哌酸的胞内浓度将升高，细胞生长将被抑制。增强环丙氟哌酸作用的化合物将被鉴定并进一步评价。
如上面所讨论的，在优选实施方案中，利用其它表达外流泵的菌种和被这些外流泵外排的抗生素，也可进行相似的筛选。实施例2第二种筛选方法-测量四环素的胞内浓度一种更特异的方法是以用tetR调控域控制报道基因的表达为基础。tetR是一为人熟知的调控系统，对四环素浓度敏感，当细胞内四环素浓度升高时它能诱导TetA的合成。如果外流泵被阻断，四环素的胞内浓度将升高，受TetR控制的蛋白质将被诱导。
tetR及其调控区已被克隆，而且一个tetA-lacZ融合基因也处于TetR的控制下。这一构建物将被插入绿脓杆菌的非必需染色体基因中，以这种菌株的利用为基础将建立一种筛选方法。这种构建物与Rothstem等报道的有所不同，i)融合基因在tetA的不同位置构建，ii)不为寻找四环素特异外流泵抑制剂而设计，而为寻找多底物外流泵抑制剂而设计，iii)该构建物将插入染色体而不是质粒中。
菌株PAO1将用于本筛选方法。它将在一非必需基因中含有上述的构建物。PAO1将生长在含亚抑制浓度的四环素和β-半乳糖苷酶底物的培养基中。在菌株接种前或培养物已开始生长后，被试验的化合物将加入培养基中。如果试验化合物抑制了外流泵，四环素的胞内浓度将升高，而LacZ将被合成。LacZ的存在可用β-半乳糖苷酶底物检测。实施例3第三种筛选方法—生色试剂的聚积一种特异的筛选方法是以非生长的绿脓杆菌或其它细菌中生色或荧光试剂(或其它可检测的化合物)的摄入为基础。(在此之后的本实施例将仅指染料。)一种或多种类型的外流泵的抑制将导致染料聚积的增多。因此，如果外流泵被阻断，染料的胞内浓度将升高从而可用分光光度法测量，或者在某些情况下，可用目测估计。
绿脓杆菌株PAM1001将被用于本实施例的筛选方法，但其它过量表达相同的或其它外流泵的绿脓杆菌株或具有感兴趣的外流泵(如其它非四环素特异性外流泵)的其它菌种也可同样用于本方法。PAM1001生长在标准培养基中，细胞通过离心收获。细胞转移至Eppendorf离心管中并用合适的缓冲液重悬浮至最佳的光密度。在环境温度下培养一段时间前，染料和待试验的化合物均加入培养基中。悬浮液离心后细胞沉淀用分光光度法分析(程序A)或者抽提沉淀细胞中的染料并用分光光度法或荧光分光光度法(程序C)测量染料的量。如上所述，也可测量悬浮液培养基中的染料浓度(程序B)。在这种情况下，如果细胞聚积更多量的染料，上清中染料的量及其光吸收将下降，这三种程序的方法实例描述如下细胞制备将冻存的PAM1001划线接种到Mueller-Hinton琼脂平板中并于35℃培养过夜。收获2-4个克隆，用于接种至含2mlMueller-Hinton肉汤的管中，于旋转摇床中以200-250rpm，35℃培养过夜。在一250ml三角锥瓶中用相同的培养基将过夜培养物1∶100稀释至40ml，并在上述相同生长条件下生长至中对数期(用Perkin ElmerLamda Bio分光光度计测600nm处OD值等于1)。室温低速(4000g20分钟)离心收集细胞并用40ml含0.2％葡萄糖的0.05M磷酸钾缓冲液(pH6.9)洗涤一次，以1∶10初体积重悬于相同的缓冲液中。用这种方式制备的细胞被用于三种程序之中。
程序A—细胞颜色的改变在含上述缓冲液的Eppendorf管(1.5ml大小)中细胞被稀释至600 nm下1OD。龙胆紫(终浓度1μg/ml)和合适浓度的试验化合物加入管中至终体积为1ml。细胞悬液于室温温育5分钟并在Eppendorf离心机中以14,000rpm离心2分钟。如果外流泵被抑制，细胞沉淀将变成紫红色。当外流泵抑制剂L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺加至40μg/ml。暴露于龙胆紫和L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺中的细胞悬浮液的沉淀变成紫色，而未暴露在龙胆紫和L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺中的细胞悬浮液的沉淀并不变色。程序B—上清光吸收的改变在含上述缓冲液的Eppendorf管(1.5ml大小)中将细胞稀释至600nm 0.5OD。龙胆紫(终浓度8μg/ml)和L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺加入管中，终体积1ml。于室温将细胞悬液温育5分钟，在Eppendorf离心机中以14,000rpm离心2分钟，收集上清测590nm处的光吸收。这一程序的实例结果如下所示
程序C-细胞沉淀中染料的抽提在含上述缓冲液的Eppendorf管(1.5ml大小)中细胞稀释至600nm 0.5OD。龙胆紫(16μg/ml终浓度)和100μg/ml L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺加入管中至终体积0.5ml。细胞悬液于室温温育5分钟，在Eppendorf离心机中以14,000rpm离心2分钟。洗涤细胞一次并将其重悬于20μl缓冲液中；加入400μl1-丙醇，温育10分钟并离心。收集上清并用分光光度法于590nm测龙胆紫水平。实例结果如下<
上述用已知外流泵抑制剂作为试验化合物的筛选方法的实例程序的结果证明染料聚积筛选法可用于鉴定其它的外流泵抑制剂。实施例4第四种筛选方法—阳性生长筛选本试验为一阳性生长筛选即通过细菌细胞的生长来表明外流泵抑制剂的存在。本试验利用了受可诱导的调控区控制的β-内酰胺酶基因。为了这种筛选方法，一个含tetR基因，tetA启动子和blaS基因的构建物插入到绿脓杆菌株PAO1染色体中的非必需基因中，blaS基因编码来自嗜麦芽黄单胞菌的β-内酰胺酶；卡巴培南是这个β-内酰胺酶的有效底物。菌株PAO1不能产生能以卡巴培南为有效底物的β-内酰胺酶，另外，卡巴培南不能被绿脓杆菌的外流泵外排。在能有效利用卡巴培南的β-内酰胺酶不存在时，高浓度的卡巴培南将克服绿脓杆菌外膜的低通透性从而抑制细菌的生长。因此，如果blaS基因的表达未被诱导，由于卡巴培南的存在绿脓杆菌细胞将死亡。然而，如果四环素在培养基中以非常低的水平存在，而外流泵抑制剂以能有效抑制外排四环素的外流泵的浓度存在，四环素的胞内浓度将升高，从而诱导blaS基因的表达，将水解卡巴培南使得细菌能够生长。
本试验还可滴定弱外流泵抑制剂的活性。利用培养基中不同浓度的卡巴培南可完成这种滴定。不足的抑制剂将不能完全诱导blaS基因的表达，从而不能导致高卡巴培南浓度下的阳性细胞生长，因为少量被诱导的β-内酰胺酶不能水解足够量的卡巴培南，但在低卡巴培南浓度下，将能诱导出足够的β-内酰胺酶，水解足够的卡巴培南，使细胞得以生长。因此，本试验提供了检测弱外流泵抑制剂及强外流泵抑制剂的方法。实施例5目标物的评价为了评估外流泵在致病原因中的作用，我们获得了PAO1中编码外流泵成分的mexA和oprK。用标准的基团置换法构建得到该菌株。不能获得mexB的无效突变菌株可能因为该突变是致死的。mexA和oprK无效突变株对抗生素更敏感，并将用于动物模型以试验这些突变株在中性白细胞减少的小鼠中的毒力。实施例6成功化合物的评价通过一种或多种上述的筛选方法(生长抑制，报道物诱导，或阳性生长筛选)筛选证明为外流泵抑制剂的化合物将检测其增强绿脓杆菌对无关抗生素诺氟哌酸和四环素敏感性的能力。随后，用一定范围的抗生素，如四环素，氟喹诺酮，β-内酰胺，和氨基糖苷确定这些分子的增强作用，也将检测外流泵抑制剂化合物的抗菌活性。
而且，也将检测这些化合物对其它泵(如MexC-MexD-OprL系统，NorA，TetA，MDR)的抑制作用，已鉴定的化合物也将在分子水平检测其抑制外流泵的能力。实施例7一种成功化合物—L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺的鉴定用实施例1中所述的生长抑制筛选，化合物L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺被鉴定为外流泵抑制剂。根据化合物的结构与预期的治疗用途适用性先选出一组化合物，在这些化合物中进行筛选。这个化合物的结构如图21所示。这种鉴定之后，这个化合物受到如实施例7所述的体外鉴定。实施例8成功化合物—L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺的性质A.L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-蒸酰胺用于鉴定外流泵的存在。
L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺可用于鉴定受其抑制的外流泵的存在。这种鉴定将以受L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺抑制的泵外排的抗生素的增强作用为基础，或通过监测泵的底物如蛋白质的分泌来鉴定。B.体外简介(profile)L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺提高了绿脓杆菌野生型PAO1菌株以及两种外流泵过量产生的菌株K385和PAO4098E对四环素和环丙氟哌酸的敏感性(图7和8)。利用棋盘格试验，也明确地证明了这三个菌株对L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺与四环素或环丙氟哌酸合用的协同作用。L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺对外流泵缺陷的突变株K799/61对四环素和环丙氟哌酸的敏感性没有影响(图8)。L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺在高浓度(32μg/ml)下也显示出固有的抗菌活性，绿脓杆菌四个菌株的MIC如表2所示。应当注意到两种外流泵过量生产者对L-苯丙氨酰-L精氨酰-β-萘酰胺的敏感性明显低于野生型或外流泵缺陷的突变株(图8)。
利用绿脓杆菌PAO1和K385，我们已表明L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺也具有增强许多被绿脓杆菌特异地泵出的抗生素(四环素，氯霉素，哌拉西林，头孢他啶以及包括环丙氟哌酸和诺氟哌酸在内的七种氟喹诺酮)的活性的功能，但是，非绿脓杆菌MDR/绿脓菌荧光素外流泵(Li等，1994a；Li等，1994b)底物的药物如亚胺培南和庆大霉素的MIC，在L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺存在时仍保持不变。
图9图示了绿脓杆菌株PAO1对被测的每种抗生素的敏感性的倍数提高，而图10列出了它们的MIC。四种两性氟喹诺酮的相对疏水性与L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺引起的对绿脓杆菌株PAO1和K385的MIC的降低程度呈正比关系(图11)。
L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺降低了环丙氟哌酸对所测绿脓杆菌所有的实验室菌株和临床分离株(n＝26)的MIC。这个菌株群中有18个临床分离株和8个实验室菌株。用肉汤培养基微量稀释法，研究了这个菌株群对环丙氟哌酸及环丙氟哌酸与L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺合用的敏感性。环丙氟哌酸对这个菌株群的MIC90为2μg/ml。而加入终浓度为20μg/ml的L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺后，则降至0.125μg/ml(图12)。
用绿脓杆菌的三个菌株，PAO1，K385，和PAO4098E进行了L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺与亚抑制浓度的四环素或环丙氟哌酸合用的时间杀灭研究。研究表明终浓度为20μg/ml的L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺的加入，完全恢复了四环素对这三种菌株的抑菌活性。同样，在存在20μg/ml L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺时，低至0.2μg/ml的环丙氟哌酸对所有测试的菌株均有杀菌活性(图13-15)。
我们也证实大多数肠杆菌科和假单胞菌属的种类对环丙氟哌酸的敏感性可被L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺提高。L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺增强了环丙氟哌酸对金黄色葡萄球菌的一个临床分离株的作用。其MIC从16μg/ml降至4μg/ml(图16)。
我们也研究了L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺对大肠杆菌AcrAB泵缺陷突变株的影响，该菌株在H.Nikaido的实验室中通过转座子诱变获得。我们发现L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺提高了亲本菌株NH817—一种Acr阳性表型的大肠杆菌K12对吖啶橙的敏感性。AcrAB泵缺陷型的菌株NH818比亲本菌株对吖啶橙更敏感，且其敏感性水平不受L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺影响(图17)。
L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺表现出能增强环丙氟哌酸抗带有已知的DNA回旋酶突变的绿脓杆菌株(PAO236 NalA)的作用。革兰氏阴性细菌对抗微生物剂的总体敏感性由外膜通透性(包括外排作用)和药物对目标物的亲和力两者的相对贡献确定。如果在NalA菌株中喹诺酮的外排作用受到影响，引起生长抑制所必需的表观喹诺酮浓度将降低，导致对喹诺酮的敏感性增强(图18)。
四环素聚积实验用于测量绿脓杆菌中外流泵的活性。该实验测定[3H]-四环素在细菌中的聚积，并使其最优化以测量四环素在绿脓杆菌中的聚积。在四种不同的绿脓杆菌菌株中测量了四环素的聚积1)产生基础水平外流泵的野生型菌株PAO1，2)来自PAO1并过量产生两种不同外流泵的菌株PAO4098E和K385和3)菌株799/61，一种不能产生可检测量的外流泵并对抗生素过敏感的菌株。
在合成外流泵的细菌，PAO1，PAO4098E或K385的细胞悬液中，加入L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺抑制外流泵的正常功能，在1mM或0.1mM L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺存在时，四环素聚积显著提高。当CCCP加入细胞悬液中后也会出现相似的抑制方式(图19)，CCCP为一质子导体，它能破坏被外流泵用作源能量的质子梯度。
当在不能产生外流泵的菌株799/61中测量四环素聚积时，L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺的加入并不改变四环素聚积的稳态水平。质子导体CCCP的加入降低了菌株799/61中的四环素聚积。当CCCP加入细胞悬液中且pH在膜两边达到平衡，将达到一个新的四环素稳态平衡。当CCCP存在时，细胞悬液中加入L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺不会改变四环素聚积的稳态水平，正如所预料的那样它是不影响质子梯度的特异性外流泵抑制剂(图20)。
本结果清楚地表明L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺抑制了绿脓杆菌中外流泵的功能。L-苯丙氨酰-L-精氨酰-β-萘酰胺不能影响质子梯度，不能作为质子解偶联剂。实施例9成功化合物的体内评价细菌外流泵抑制剂首先在体外鉴定。那些显示出能有效抑制外流泵和那些与抗生素显示出协同作用的化合物被挑选出来进行体内评估。将用标准的方法进行功效试验。用鼠败血症模型可进行初步的功效评估(M.G.Bergeron.1978年，Scand.J.Infect.Dis.增刊14卷189-206页；S.D.Davis，1975年，《抗微生物剂化学疗法》(Antimicrob.AgentsChemother.)8卷50-53页)。在这个模型中超致死量的细菌用于攻击这些啮齿动物。改变治疗时间和抗生素剂量中的一项或二项来进行治疗。在这些实验中，抗生素和外流泵抑制剂的剂量均不同。增效剂(外流泵抑制剂)与抗生素合用与单独使用抗生素相比对致死感染的保护作用明显提高表明为阳性结果。
所用的第二种功效模型为小鼠软组织感染模型(Vogelman等，1988年，《感染性疾病杂志》(J.Infect.Dis.)157卷287-298页)。在这个模型中，用合适滴度的细菌感染麻醉小鼠的后大腿肌肉。小鼠为嗜中性白细胞减少的(在-4，-2和0天用125mg/kg环磷酰胺治疗)或免疫活性的小鼠。感染剂量通常为每只动物105-106克隆形成单位。外流泵抑制剂和/或抗生素的合用进行的治疗可在感染后，也可在感染前。在全部时间范围内监测大腿肌肉中细菌的增殖(或死亡)。有效的合用比单独使用抗生素显示出更高的活性。活性被定义为在鼠组织中被试细菌生长速率的降低。
另一用于评价外流泵抑制剂功效的模型为扩散室模型(Malouin等，1990年《感染与免疫》(Infect Immun)58卷1247-1253页；Day等，《感染杂志》(J.Infect)2卷39-51页；Kelly等，1989年《感染与免疫》(Infect.Immun)57卷344-350页)。在这个模型中，用外科手术在啮齿动物的腹膜腔中置入一扩散室。该室可由聚丙烯圆柱组成，圆柱的两端用半透膜覆盖。扩散进或出小室的腹膜液为微生物提供了营养。当抗生素/外流泵抑制剂存在和不存在时细菌的增殖与单独使用抗生素时相比较。合用和单独使用抗生素的剂量分布用于评估抗微生物剂/合用的功效。
用于外流泵抑制剂/抗生素合用的严格试验的第三个模型为心内膜炎模型(J.Santoro和M.E.levinson，1978年《感染与免疫)》(InfectImmun.)19卷915-918页)。大鼠和兔子均能有效地用于这个模型。外流泵抑制剂与抗生素合用的效果与单独使用抗生素的效果进行比较。终点通常为在治疗结束时残留在心脏增殖体中的存活细胞。
所提供的感染模型实例并非限制性的，其它的模型合适用于特定的感染微生物。尤其是，在某些情况下细胞感染模型可用来替代动物模型。
这里描述的实施方案并不意味着对本发明进行限制。本领域的技术人员将明白本发明可用许多细菌株或种，或其它细胞类型进行实施。
其它的实施方案包括在下面的权利要求中。
权利要求
1.一种筛选非四环素特异性外流泵抑制剂的方法，包括在亚抑制浓度的抗菌剂存在时，确定潜在的非四环素特异性外流泵抑制剂是否抑制细菌的生长其中所说的细菌产生一非四环素特异性外流泵。
2.权利要求1的方法，其中所说的细菌过量产生非四环素特异性外流泵。
3.权利要求2的方法，进一步包括比较过量产生外流泵的细菌与不能过量产生外流泵的另一种细菌的生长情况，其中如果过量产生外流泵的细菌的生长比所说的第二种细菌的生长受到更大程度的抑制，那么该试验化合物为一非四环素特异性外流泵抑制剂。
4.一种筛选非四环素特异性外流泵抑制剂的方法，包括在试验化合物存在和不存在时，将具有非四环素特异性外流泵的细菌细胞与被该外流泵运输的染料或荧光物质接触；和比较该试验化合物存在和不存在时染料或荧光物质的胞内浓度；其中该试验化合物存在时与不存在时相比，染料或荧光物质的胞内浓度升高表明该试验化合物为一非四环素特异性外流泵抑制剂。
5.权利要求4的方法，其中所说的染料选自龙胆紫和孔雀绿。
6.权利要求4的方法，其中所说的比较包括确定染料在悬浮培养基中的浓度变化。
7.一种筛选非四环素特异性外流泵抑制剂的方法，包括确定在试验化合物和亚抑制浓度的第二种化合物存在时，在一表达非四环素特异性外流泵的重组细菌中，第二种化合物的胞内浓度是否升高，其中所说的确定包括检测受第二种化合物浓度升高诱导的调控序列控制的报道基因的表达，和其中如果该试验化合物存在时比其不存在时报道基因的表达水平更高，那么该试验化合物为一非四环素特异性外流泵抑制剂。
8.权利要求7的方法，其中所说的第二种化合物为抗菌剂。
9.权利要求8的方法，其中所说的调控序列受四环素升高的浓度诱导。
10.权利要求9的方法，其中调控序列为tetA调控序列，它含有一结合TetR的操纵位点。
11.权利要求7的方法，其中所说的报道基因表达一种酶。
12.权利要求11的方法，其中所说的报道基因为β-半乳糖苷酶基因。
13.权利要求7的方法，其中所说的报道基因提供比色报道。
14.一种试验外流泵抑制剂的方法，包括如下步骤a.将表达外流泵的重组微生物细胞与一试验化合物接触，和b.确定在该试验化合物存在时，重组的微生物细胞是否生长，其中当外流泵被抑制后比未被抑制时，所说的微生物细胞将生长更好，其中如果该试验化合物存在时比不存在时所说的重组微生物细胞生长得更好，那么该试验化合物为一外流泵抑制剂。
15.权利要求14的方法，包括将该重组微生物细胞与一试验化合物，一诱导剂，和一高于该重组微生物细胞非诱导MIC的浓度的抗微生物剂接触，进一步包括确定在试验化合物存在时诱导剂的胞内浓度是否升高，其中诱导剂升高的胞内浓度诱导产生所说的抗微生物剂的灭活因子。
16.权利要求15的方法，其中所说的重组微生物细胞为重组细菌细胞，而所说的抗微生物剂为抗菌剂。
17.权利要求16的方法，其中重组细菌细胞含人工插入的DNA结构，该结构含一受该诱导剂升高的胞内浓度诱导的启动子，与一编码抗菌剂灭活因子的序列一起转录，其中诱导剂升高的胞内浓度诱导编码抗菌剂灭活因子的序列表达。
18.权利要求17的方法，其中诱导剂诱导β-内酰胺酶基因的表达，而所说的抗菌剂为β-内酰胺。
19.权利要求18的方法，其中诱导剂为四环素，β-内酰胺酶基因为blaS基因，β-内酰胺为卡巴培南。
20.权利要求17或19的方法，其中启动子为tetA启动子，而重组细菌细胞表达tetR基因。
21.权利要求18或19的方法，其中β-内酰酶基因是染色体插入的。
22.权利要求1-21中任意一种方法，其中外流泵为绿脓杆菌型外流泵。
23.权利要求22的方法，其中外流泵为绿脓杆菌外流泵。
24.权利要求23的方法，其中细菌为绿脓杆菌。
25.权利要求24的方法，其中绿脓杆菌为菌株K385或PAO4098E。
26.权利要求1-21中任意一种方法，其中至少一种细菌选自下面绿脓杆菌，荧光假单胞菌，食酸假单胞菌，产碱假单胞菌，恶臭假单胞菌，嗜麦芽糖寡养单胞菌，洋葱伯克氏菌，嗜水气单胞菌，大肠杆菌，弗氏柠檬酸杆菌，鼠伤寒沙门氏菌，伤寒沙门氏菌，副伤寒沙门氏菌，肠炎沙门氏菌，痢疾志贺氏菌，弗氏志贺氏菌、索氏志贺氏菌，阴沟肠杆菌，产气肠杆菌，肺炎克雷伯氏菌，产酸克雷伯氏菌，粘质沙雷氏菌，土拉热弗朗西丝氏菌，摩氏摩根氏菌，奇异变形菌，普通变形菌，产碱普罗威登斯菌，雷氏普罗威登斯菌，斯氏普罗威登斯菌，乙酸钙不动杆菌，溶血不动杆菌，小肠结肠炎耶尔森氏菌，鼠疫耶尔森氏菌，假结核耶尔森氏菌，中间耶尔森氏菌，百日咳博德特氏菌，副百日咳博德特氏菌，支气管炎博德特氏菌，流感嗜血菌，副流感嗜血菌，溶血嗜血菌，副溶血嗜血菌，杜氏嗜血菌，多杀巴斯德氏菌，溶血巴斯德氏菌，粘膜炎布兰汉氏球菌，幽门螺杆菌，胚胎弯曲杆菌，空肠弯曲杆菌，大肠弯曲杆菌，布氏疏螺旋体，霍乱弧菌，副溶血弧菌，侵肺军团菌，单核细胞增生利斯特氏菌，淋病奈瑟氏球菌，脑膜炎奈瑟氏球菌，阴道加德纳氏菌，脆弱拟杆菌，吉氏拟杆菌，拟杆菌3452A同源群，普通拟杆菌，卵拟杆菌，多形拟杆菌，单形拟杆菌，埃氏拟杆菌，内脏拟杆菌，艰难梭菌，结核分枝杆菌，鸟分枝杆菌，胞内分枝杆菌，麻风分枝杆菌，白喉棒杆菌，溃疡棒杆菌，肺炎链球菌，无乳链球菌，酿脓链球菌，粪肠球菌，屎肠球菌，金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，腐生葡萄球菌，中间葡萄球菌，猪葡萄球菌猪亚种，溶血葡萄球菌，人葡萄球菌，解糖葡萄球菌。
27.权利要求1-21中任意一种方法，其中外流泵选自mexA/mexB/oprM和绿脓杆菌株K385过量表达的外流泵。
28.权利要求14-21中任意一种方法，其中重组细菌来自绿脓杆菌株，菌株K385，或菌株PAO4098E。
29.一种治疗动物中微生物感染的方法，包括给予遭受感染的动物足以降低外流泵活性的量的外流泵抑制剂，其中外流泵抑制剂降低该动物中微生物的致病性或体内生存能力。
30.一种治疗动物中微生物感染的方法，包括给予遭受感染的动物某种抗微生物剂和足以降低外流泵活性的量的外流泵抑制剂，其中外流泵抑制剂提高微生物对该抗微生物剂的敏感性。
31.一种动物的预防治疗方法，包括给予有微生物感染危险的动物外流泵抑制剂，其中该外流泵抑制剂降低动物中微生物的致病性。
32.一种动物的预防治疗方法，包括给予有微生物感染危险的动物某种抗微生物剂和外流泵抑制剂，其中外流泵抑制剂提高微生物对该抗微生物剂的敏感性。
33.权利要求29-32中任意一种方法，其中所说的动物为哺乳动物。
34.权利要求29-32中任意一种方法，其中所说的微生物感染与细菌有关。
35.一种增强抗微生物剂抗微生物活性的方法，包括将微生物与该抗微生物剂和可有效抑制该微生物中外流泵的量的非四环素特异性外流泵抑制剂接触。
36.权利要求35的方法，其中所说的微生物为细菌。
37.权利要求34或权利要求36的方法，其中所说的细菌感染与选自下面的一种细菌有关绿脓杆菌，荧光假单胞菌，食酸假单胞菌，产碱假单胞菌，恶臭假单胞菌，嗜麦芽糖寡养单胞菌，洋葱伯克氏菌，嗜水气单胞菌，大肠杆菌，弗氏柠檬酸杆菌，鼠伤寒沙门氏菌，伤寒沙门氏菌，副伤寒沙门氏菌，肠炎沙门氏菌，痢疾志贺氏菌，弗氏志贺氏菌，索氏志贺氏菌，阴沟肠杆菌，产气肠杆菌，肺炎克雷伯氏菌，产酸克雷伯氏菌，粘质沙雷氏菌，土拉热弗朗西丝氏菌，摩氏摩根氏菌，奇异变形菌，普通变形菌，产碱普罗威登斯菌，雷氏普罗威登斯菌，斯氏普罗威登斯菌，乙酸钙不动杆菌，溶血不动杆菌，小肠结肠炎耶尔森氏菌，鼠疫耶尔森氏菌，假结核耶尔森氏菌，中间耶尔森氏菌，百日咳博德特氏菌，副百日咳博德特氏菌，支气管炎博德特氏菌，流感嗜血菌，副流感嗜血菌，溶血嗜血菌，副溶血嗜血菌，杜氏嗜血菌，多杀巴斯德氏菌，溶血巴斯德氏菌，粘膜炎布兰汉氏球菌，幽门螺杆菌，胚胎弯曲杆菌，空肠弯曲杆菌，大肠弯曲杆菌，布氏疏螺旋体，霍乱弧菌，副溶血弧菌，侵肺军团菌，单核细胞增生利斯特氏菌，淋病奈瑟氏球菌，脑膜炎奈瑟氏球菌，阴道加德纳氏菌，脆弱拟杆菌，吉氏拟杆菌，拟杆菌3452A同源群，普通拟杆菌，卵拟杆菌，多形拟杆菌，单形拟杆菌，埃氏拟杆菌，内脏拟杆菌，艰难梭菌，结核分枝杆菌，鸟分枝杆菌，胞内分枝杆菌，麻风分枝杆菌，白喉棒杆菌，溃疡棒杆菌，肺炎链球菌，无乳链球菌，酿脓链球菌，粪肠球菌，屎肠球菌，金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，腐生葡萄球菌，中间葡萄球菌，猪葡萄球菌猪亚种，溶血葡萄球菌，人葡萄球菌，解糖葡萄球菌。
38.权利要求34或36的方法，其中外流泵抑制剂为非四环素特异性外流泵抑制剂。
39.权利要求34或36的方法，其中外流泵抑制剂为绿脓杆菌型外流泵抑制剂。
40.权利要求30和32-39中任意一种方法，其中所说的微生物感染为细菌感染，而所说的抗微生物剂为抗菌剂。
41.权利要求40的方法，其中所说的抗菌剂为喹诺酮。
42.权利要求40的方法，其中所说的抗菌剂为四环素。
43.权利要求40的方法，其中所说的抗菌剂为β-内酰胺。
44.权利要求40的方法，其中所说的抗菌剂为香豆霉素。
45.权利要求40的方法，其中所说的抗菌剂为氯霉素。
46.权利要求40的方法，其中所说的抗菌剂为糖肽。
47.权利要求40的方法，其中所说的抗菌剂为氨基糖苷。
48.权利要求40的方法，其中所说的抗菌剂为大环内酯。
49.权利要求40的方法，其中所说的抗菌剂为利福霉素。
50.一种抑制微生物细胞膜上膜通道功能的方法，包括将膜通道与膜通道抑制剂接触，其中抑制剂降低膜通道的外排能力。
51.权利要求50的方法，其中膜通道的一个多肽与mexA/mexB/oprM外流泵或绿脓杆菌K385过量表达的外流泵的一个多肽至少有50％的氨基酸序列相似性。
52.一种能有效治疗动物的微生物感染的药物组合物，含有外流泵抑制剂。
53.权利要求52的药物组合物，能有效治疗动物的细菌感染。
54.权利要求52的药物组合物，能有效治疗动物的微生物感染。
55.一种当给予动物足以降低外流泵活性的量时能有效治疗动物的微生物感染的药物组合物，包含外流泵抑制剂和抗微生物剂。
56.权利要求55的药物组合物，其中该组合物能有效治疗哺乳动物的微生物感染，其中所说的微生物为细菌。
57.权利要求56的药物组合物，它能有效地治疗动物的细菌感染，其中抗微生物剂为抗菌剂。
58.一种以足以降低外流泵活性的量与抗微生物剂一道给予动物时能有效治疗动物的微生物感染的药物组合物，包括一种药用载体和一种外流泵抑制剂。
59.权利要求58的药物组合物，能有效治疗动物的细菌感染，其中抗微生物剂为抗菌剂。
60.权利要求59的药物组合物，能有效治疗哺乳动物的微生物感染，其中所说的微生物为细菌。
61.权利要求52，55或58的药物组合物，其中所说的外流泵抑制剂具有结构1-4中任何一种结构
其中R＝烷基(C1-C4)，氟烷基(C1-C4)，过氟烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，卤素(Br，Cl，F，或I)，芳基(C6-C10)，单取代芳基(C6-C10)[任选地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，卤素(Br，Cl，F，I)，氨基，单取代氨基[任选地用烷基(C1-C4)取代]，双取代氨基[任选地用烷基(C1-C4)任意组合的取代]，或羟基取代]，双取代芳基(C6-C10)[任选地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，卤素(Br，Cl，F，I)，和氨基的任意组合取代]，2-(或3-)-噻吩基，2-(或3-)-呋喃基，或2-(3-或4-)-吡啶基。W＝H，NH2，单取代氨基[任选地用烷基(C1-C4)取代]，双取代氨基[任选地用烷基(C1-C4)的任意组合取代]，氮杂环[如N-吗啉基，N-哌嗪基，N-吡咯烷基，N-咪唑基，N-吡咯基，N-吡唑基，N-三唑基，或N-四唑基]，卤素(Br，Cl，F，I)，羟基，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，R1＝(CH2)nNRaRb，(CH2)nNRbRc，(CH2)nNHC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nSNHC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nN＝CNRbRc，(n＝2-4)；Ra(Rb或Rc)＝H，烷氧基(C1-C4)，芳基(C6)，取代芳基，苯基，取代苯基[任选地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，卤素(Br，Cl，F或I)，或氨基取代]，或者Ra+Rb＝(CH2)2-3或-CH＝CH-，X＝芳基(C6-C10)，-(CH2)0-2芳基(C6-C10)，取代芳基(C6-C10)[任选地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，卤素(Br，Cl，F或I)，或氨基取代]，取代-(CH2)0-2芳基(C6-C10)[用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，卤素(Br，Cl，F或I)，或氨基在芳基部位取代]，2-(或3-)-噻吩基，2-(或3-)-呋喃基，2-(3-或4-)-吡啶基，苯并呋喃基[在苯并呋喃环的任意位置]，苯并噻吩基[在苯并噻吩环的任意位置]。其中存在非对称中心，其绝对立体化学性质可能是R或S-构型，或为外消旋混合物。
62.权利要求61的药物组合物，其中所说的外流泵抑制剂具有结构1，其中R＝烷基(C1-C4)，氟烷基(C1-C4)，过氟烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，卤素(Br，Cl，F，或I)，芳基(C6-C10)，单取代芳基(C6-C10)[用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，卤素(Br，Cl，F或I)，氨基，单取代氨基[任选地用烷基(C1-C4)取代]，双取代氨基[任选地用烷基(C1-C4)的任意组合取代]，或羟基任意取代]，双取代芳基(C6-C10)[任选地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，卤素(Br，Cl，F或I)和氨基的任意组合取代]，2-(或3-)-噻吩基，2-(或3-)-呋喃基，或2-(3-或4-)-吡啶基。W＝H，NH2，单取代氨基[任选地用烷基(C1-C4)取代]，双取代氨基[任选地用烷基(C1-C4)的任意组合取代]，氮杂环[如N-吗啉基，N-哌嗪基，N-吡咯烷基，N-咪唑基，N-吡咯基，N-吡唑基，N-三唑基，或N-四唑基]，卤素(Br，Cl，F，I)，羟基，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，R1＝(CH2)nNRaRb，(CH2)nNRbRc，(CH2)nNHC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nSNHC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nN＝CNRbRc，(n＝2-4)，Ra(Rb或Rc)＝H，烷基(C1-C4)，芳基(C6)，取代芳基，苯基，取代苯基[任选地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，卤素(Br，Cl，F，或I)，或氨基取代]，或者Ra+Rb＝(CH2)2-3或-CH＝CH-，X＝芳基(C6-C10)，-(CH2)0-2芳基(C6-C10)，取代芳基(C6-C10)[任选地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，卤素(Br，Cl，F或I)，或氨基取代]，取代-(CH2)0-2芳基(C6-C10)[用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，卤素(Br，Cl，f或I)，或氨基在芳基部位取代]，2-(或3-)-噻吩基，2-(或3-)-呋喃基，2-(3-或4-)-吡啶基，苯并呋喃基[在苯并呋喃环的任何位置]，苯并噻吩基[在苯并噻吩环的任何位置]。其中存在非对称中心，其绝对立体化学性质可能是R或S-构型，或为外消旋混合物。
63.权利要求62的药物组合物，其中R＝烷基(C1-C4)，氟烷基(C1-C4)，过氟烷基(C1-C4)，芳基(C6-C10)，单取代芳基(C6-C10)[任选地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，卤素(Br，Cl，F或I)，氨基，单取代氨基[任选地用烷基(C1-C4)取代]，双取代氨基[任选地用烷基(C1-C4)的任意组合取代]，或羟基取代]，双取代芳基(C6-C10)[任选地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，卤素(Br，Cl，F或I)和氨基的任意组合取代]，2-(或3-)-噻吩基，2-(或3-)-呋喃基，或2-(3-或4-)-吡啶基。W＝H，NH2，单取代氨基[任选地用烷基(C1-C4)取代]，双取代氨基[任选地用烷基(C1-C4)的任意组合取代]，氮杂环[如N-吗啉基，N-哌嗪基，N-吡咯烷基，N-咪唑基，N-吡咯基，N-吡唑基，N-三唑基，或N-四唑基]，卤素(Br，Cl，F，I)，羟基，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，R1＝(CH2)nNRbRc，(CH2)nNHC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nSNHC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nN＝CNRbRc，(n＝2，-4)，Ra(Rb或Rc)＝H，烷基(C1-C4)，芳基(C6)，取代芳基，苯基，取代苯基[任选地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，卤素(Br，Cl，F或I)，或氨基取代]或者Ra+Rb＝(CH2)2-3或-CH＝CH-，X＝芳基(C6-C10)，-(CH2)0-2芳基(C6-C10)，取代芳基(C6-C10)[任选地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，卤素(Br，Cl，F或I)，或氨基取代]，取代-(CH2)0-2芳基(C6-C10)[用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，卤素(Br，Cl，F或I)，或氨基在芳基部位取代]，2-(或3-)-噻吩基，2-(或3-)-呋喃基，2-(3-或4-)-吡啶基，苯并呋喃基[在苯并呋喃环的任何位置]，苯并噻吩基[在苯并噻吩环的任何位置]。其中存在非对称中心，其绝对立体化学性质可能是R或S构型，或为外消旋混合物。
64.权利要求63的药物组合物，其中R＝烷基(C1-C4)，氟烷基(C1-C4)，芳基(C6-C10)，单取代芳基(C6-C10)[任选地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，氨基，单取代氨基[任选地用烷基(C1-C4)取代]，双取代氨基[任选地用烷基(C1-C4)的任意组合取代]取代]，2-(或3-)-噻吩基，2-(或3-)-呋喃基，或2-(3-或4-)-吡啶基。W＝H，NH2，单取代氨基[任选地用烷基(C1-C4)取代]，双取代氨基[任选地用烷基(C1-C4)的任意组合取代]，氮杂环[如N-吗啉基，N-哌嗪基，N-吡咯烷基，N-咪唑基，N-吡咯基，N-吡唑基，N-三唑基，或N-四唑基]，R1＝(CH2)nNRbRc，(CH2)nNHC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nN＝CNRbRc，(n＝2-4)；Ra(Rb或Rc)＝H，烷基(C1-C4)，芳基(C6)，或者Ra+Rb＝(CH2)2-3或-CH＝CH-，X＝芳基(C6-C10)，-(CH2)0-2芳基(C6-C10)，取代芳基(C6-C10)[任选地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，卤素(Br，Cl，f或I)，或氨基取代]，取代-(CH2)0-2芳基(C6-C10)[任选地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，卤素(Br，Cl，F或I)，或氨基取代]，2-(或3-)-噻吩基，2-(或3-)-呋喃基，或2-(3-或4-)-吡啶基，其中存在非对称中心，其绝对立体化学性质可能为R或S构型，或为外消旋混合物。
65.权利要求61的药物组合物，其中所说的外流泵抑制剂具有结构2，其中R＝芳基(C6-C10)，单取代芳基(C6-C10)[任选地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，卤素(Br，Cl，F或I)，氨基，单取代氨基[任选地用烷基(C1-C4)取代]，双取代氨基[任选地用烷基(C1-C4)的任意组合取代]，或羟基取代]，2-(或3-)-噻吩基，2-(或3-)-呋喃基，或2-(3-或4-)-吡啶基，R1＝(CH2)nNRbRc，(CH2)nNHC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nSNHC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nN＝CNRbRc，(n＝2-4)，Ra(Rb或Rc)＝H，烷基(C1-C4)，芳基(C6)，取代芳基，苯基，取代苯基[任选地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，卤素(Br，Cl，F或I)，或氨基取代]或者Ra+Rb＝(CH2)2-3或-CH＝CH-，X＝芳基(C6-C10)，-(CH2)0-2芳基(C6-C10)，取代芳基(C6-C10)[任选地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，卤素(Br，Cl，F或I)，或氨基取代]，取代-(CH2)0-2芳基(C6-C10)[用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，卤素(Br，Cl，F或I)，或氨基在芳基环上取代]，2-(或3-)-噻吩基，2-(或3-)-呋喃基，2-(3-或4-)-吡啶基，苯并呋喃基[在苯并呋喃环任何位置上]，苯并噻吩基[在苯并噻吩环的任何位置上]。其中存在非对称中心，其绝对立体化学性质可能为R或S-构型，或为外消旋混合物。
66.权利要求65的药物组合物，其中R＝芳基(C6-C10)，单取代芳基(C6-C10)[任选地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，卤素(Br，Cl，F或I)，氨基，单取代氨基[任选地用烷基(C1-C4)，取代]，双取代氨基[任选地用烷基(C1-C4)的任意组合取代]，或羟基取代]，2-(或3-)-噻吩基，2-(或3-)-呋喃基，或2-(3-或4-)-吡啶基。R1＝(CH2)nNRbRc，(CH2)nNHC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nSNHC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nN＝CNRbRc，(n＝2-4)，Ra(Rb或Rc)＝H，烷基(C1-C4)，芳基(C6)，取代芳基，苯基，取代苯基[任选地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，卤素(Br，Cl，F或I)，或氨基取代]或者Ra+Rb＝(CH2)2-3或-CH＝CH-，X＝芳基(C6-C10)，-(CH2)0-2芳基(C6-C10)，取代芳基(C6-C10)[任选地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，卤素(Br，Cl，F或I)，或氨基取代]，取代-(CH2)0-2芳基(C6-C10)[任选地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，卤素(Br，Cl，F或I)，或氨基取代]，2-(或3-)-噻吩基，2-(或3-)-呋喃基，2-(3-或4-)-吡啶基，苯并呋喃[在苯并呋喃环的任何位置上]，苯并噻吩[在苯并噻吩环的任何位置上]。其中存在非对称中心，其绝对立体化学性质可能为R或S-构型，或为外消旋混合物。
67.权利要求66的药物组合物，其中R＝芳基(C6-C10)，单取代芳基(C6-C10)[任选地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，氨基，单取代氨基[任选烷基(C1-C4)的取代]，双取代氨基[任选地用烷基(C1-C4)的任意组合取代]，或羟基取代]，2-(或3-)-噻吩基，2-(或3-)-呋喃基，或2-(3-或4-)-吡啶基。R1＝(CH2)nNRbRc，(CH2)nNHC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nN＝CNRbRc，(n＝2-4)，Ra(Rb或Rc)＝H，烷基(C1-C4)，芳基(C6)，或者Ra+Rb＝(CH2)2-3或-CH＝CH-，X＝芳基(C6-C10)，-(CH2)0-2芳基(C6-C10)，取代芳基(C6-C10)[任选地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，卤素(Br，Cl，F或I)，或氨基取代]，取代-(CH2)0-2芳基(C6-C10)[用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，卤素(Br，Cl，F或I)，或氨基在芳基部位取代]，2-(或3-)-噻吩基，2-(或3-)-呋喃基，2-(3-或4-)-吡啶基，其中存在非对称中心，其绝对立体化学性质可能为R或S-构型，或为外消旋混合物。
68.权利要求61的药物组合物，其中所说的外流泵抑制剂具有结构3其中R＝烷基(C1-C4)，芳基(C6-C10)，单取代芳基(C6-C10)[任选地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，卤素(Br，Cl，F或I)，氨基，单取代氨基[任选地用烷基(C1-C4)取代]，双取代氨基[任选地用烷基的任意组合取代]取代]，双取代芳基(C6-C10)[任选地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，卤素(Br，Cl，F或I)，和氨基的任意组合取代]，2-(或3-)-噻吩基，2-(或3-)-呋喃基，或2-(3-或4-)-吡啶基。W＝H，NH2，单取代氨基[任选地用烷基(C1-C4)取代]，双取代氨基[任选地用烷基(C1-C4)的任意组合取代]，氮杂环[如N-吗啉基，N-哌嗪基，N-吡咯烷基，N-咪唑基，N-吡咯基，N-吡唑基，N-三唑基，或N-四唑基]，R1＝(CH2)nNRbRc，(CH2)nNHC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nN＝CNRbRc，(n＝2-4)，Ra(Rb或Rc)＝H，烷基(C1-C4)，芳基(C6)，取代芳基，苯基，取代苯基[任选地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，卤素(Br，Cl，F或I)取代]或者Ra+Rb＝(CH2)2-3或-CH＝CH-，X＝芳基(C6-C10)，-(CH2)0-2芳基(C6-C10)，取代芳基(C6-C10)[任选地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，卤素(Br，Cl，F或I)，或氨基取代]，取代-(CH2)0-2芳基(C6-C10)[用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，卤素(Br，Cl，F或I)，或氨基在芳基部位取代]，2-(或3-)-噻吩基，2-(或3-)-呋喃基，2-(3-或4-)-吡啶基，其中存在非对称中心，其绝对立体化学性质可能为R或S-构型，或为外消旋混合物。
69.权利要求68的药物组合物，其中R＝烷基(C1-C4)，芳基(C6-C10)，单取代芳基(C6-C10)[任选地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，卤素(Br，Cl，F或I)，氨基取代]，双取代芳基(C6-C10)[任选地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，卤素(Br，Cl，F或I)，氨基的任意组合取代]，2-(或3-)-噻吩基，2-(或3-)-呋喃基，或2-(3-或4-)-吡啶基。W＝H，NH2，单取代氨基[任选地用烷基(C1-C4)取代]，双取代氨基[任选地用烷基(C1-C4)的任意组合取代]，氮杂环[如N-吗啉基，N-哌嗪基，N-吡咯烷基，N-咪唑基，N-吡咯基，N-吡唑基，N-三唑基，或N-四唑基]，R1＝(CH2)nNRbRc，(CH2)nNHC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nN＝CNRbRc，(n＝2-4)，Ra(Rb或Rc)＝H，烷基(C1-C4)，芳基(C6)，取代芳基，苯基，取代苯基[任选地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)取代]或者Ra+Rb＝(CH2)2-3或-CH＝CH-，X＝芳基(C6-C10)，-(CH2)0-2芳基(C6-C10)，取代芳基(C6-C10)[任选地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，卤素(Br，Cl，F或I)，或氨基取代]，取代-(CH2)0-2芳基(C6-C10)[用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)在芳基部位取代]，2-(或3-)-噻吩基，2-(或3-)-呋喃基，2-(3-或4-)-吡啶基，其中存在非对称中心，其绝对立体化学性质可能为R或S-构型，或为外消旋混合物。
70.权利要求69的药物组合物，其中R＝烷基(C1-C4)，芳基(C6-C10)，2-(或3-)-噻吩基，2-(或3-)-呋喃基，或2-(3-或4-)-吡啶基，W＝H，NH2，单取代氨基[任选地用烷基(C1-C4)取代]，双取代氨基[任选地用烷基(C1-C4)的任意组合取代]，氮杂环[如N-吗啉基，N-哌嗪基，N-吡咯烷基，N-咪唑基，N-吡咯基，N-吡唑基，N-三唑基]，R1＝(CH2)nNRbRc，(CH2)nNHC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nN＝CNRbRc，(n＝2-4)，Ra(Rb或Rc)＝H，烷基(C1-C4)，芳基(C6)，取代芳基，苯基，或者Ra+Rb＝(CH2)2-3或-CH＝CH-，X＝芳基(C6-C10)，-(CH2)0-2芳基(C6-C10)，取代芳基(C6-C10)[任选地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)取代]，2-(或3-)-噻吩基，2-(或3-)-呋喃基，2-(3-或4-)-吡啶基，其中存在非对称中心，其绝对立体化学性质可能为R或S-构型，或为外消旋混合物。
71.权利要求61的药物组合物，其中所说的外流泵抑制剂具有结构4其中R＝烷基(C1-C4)，芳基(C6-C10)，单取代芳基(C6-C10)[任选地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，卤素(Br，Cl，F或I)，氨基，单取代氨基[任选地用烷基(C1-C4)取代]，双取代氨基[任选地用烷基(C1-C4)的任意组合取代]取代]，双取代芳基(C6-C10)[任选地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，卤素(Br，Cl，F或I)，和氨基的任意组合取代]，2-(或3-)-噻吩基，2-(或3-)-呋喃基，或2-(3-或4-)-吡啶基。R1＝(CH2)nNRbRc，(CH2)nNHC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nN＝CNRbRc，(n＝2-4)，Ra(Rb或Rc)＝H，烷基(C1-C4)，芳基(C6)，取代芳基，苯基，取代苯基[任选地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，卤素(Br，Cl，F或I)取代]，或者Ra+Rb＝(CH2)2-3或-CH＝CH-，X＝芳基(C6-C10)，-(CH2)0-2芳基(C6-C10)，取代芳基(C6-C10)[任选地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，卤素(Br，Cl，F或I)，或氨基取代]，取代(CH2)0-2-芳基(C6-C10)[用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，卤素(Br，Cl，F或I)，或氨基在芳基部位取代]，2-(或3-)-噻吩基，2-(或3-)-呋喃基，2-(3-或4-)-吡啶基，其中存在非对称中心，其绝对立体化学性质可能为R或S-构型，或为外消旋混合物。
72.权利要求71的药物组合物，其中R＝烷基(C1-C4)，芳基(C6-C10)，单取代芳基(C6-C10)[任选地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，卤素(Br，Cl，F或I)，氨基取代]，双取代芳基(C6-C10)[任选地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，卤素(Br，Cl，F或I)，氨基的任意组合取代]，2-(或3-)-噻吩基，2-(或3-)-呋喃基，或2-(3-或4-)-吡啶基，R1＝(CH2)nNRbRc，(CH2)nNHC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nN＝CNRbRc，(n＝2-4)，Ra(Rb或Rc)＝H，烷基(C1-C4)，芳基(C6)，取代芳基，苯基，取代苯基[任选地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)取代]，或者Ra+Rb＝(CH2)2-3或-CH＝CH-，X＝芳基(C6-C10)，-(CH2)0-2芳基(C6-C10)，取代芳基(C6-C10)[任选地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)，卤素(Br，Cl，F或I)，或氨基取代]，取代-(CH2)0-2芳基(C6-C10)[用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)在芳基部位取代]，2-(或3-)-噻吩基，2-(或3-)-呋喃基，2-(3-或4-)-吡啶基，其中存在非对称中心，其绝对立体化学性质可能为R或S-构型，或为外消旋混合物。
73.权利要求72的药物组合物，其中R＝烷基(C1-C4)，芳基(C6-C10)，2-(或3-)-噻吩基，2-(或3-)-呋喃基，或2-(3-或4-)-吡啶基。R1＝(CH2)nNRbRc，(CH2)nNHC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nC＝(NRa)NRbRc，(CH2)nN＝CNRbRc，(n＝2-4)，Ra(Rb或Rc)＝H，烷基(C1-C4)，芳基(C6)，取代芳基，苯基，或者Ra+Rb＝(CH2)2-3或-CH＝CH-，X＝芳基(C6-C10)，-(CH2)0-2芳基(C6-C10)，取代芳基(C6-C10)[任选地用烷基(C1-C4)，烷氧基(C1-C4)，烷硫基(C1-C4)取代]，2-(或-3-)-噻吩基，2-(或-3-)-呋喃基，2-(3-或4-)-吡啶基。其中存在非对称中心，其绝对立体化学性质可能为R或S-构型，或为外消旋混合物。
74.一种含抗菌剂、外流泵抑制剂和药用载体的抗菌制剂。
75.一种抑制表达非四环素特异性外流泵的细菌生长的方法，包括在低于细菌MIC的浓度的抗菌剂存在下，将该细菌与非四环素特异性外流泵抑制剂接触，
76.一种抑制细菌生长的方法，包括将细菌与外流泵抑制剂接触，其中该抑制剂降低在该细菌中正常表达的某一外流泵组分的表达。
77.一种减少一个菌株群体的方法，包括将该群体与外流泵抑制剂接触，其中该抑制剂抑制在该细菌群体中表达的外流泵的某一组分，该组分对表达该外流泵的细菌生长是必需的。
78.权利要求77的方法，其中该必需组分是外流泵的质膜成分。
79.一种促进动物生长的方法，包括给予该动物外流泵抑制剂，其中该外流泵抑制剂抑制该动物中细菌株表达的外流泵，和其中该外流泵抑制剂降低该动物中细菌株的生长。
全文摘要
本发明提供了筛选包括外排抗生素的外流泵在内的微生物外流泵抑制剂的方法。该筛选方法的基础是,当细菌细胞与某种外流泵抑制剂接触后,某种化合物,例如抗生素或染料在细胞内的浓度将提高。另外,本发明还提供了含这些外流泵抑制剂的药用组合物,以及用这些组合物治疗微生物感染的方法。
文档编号A61K38/05GK1188512SQ96194896
公开日1998年7月22日 申请日期1996年4月19日 优先权日1996年4月19日
发明者S·查伯尔兰德, S·J·赫克尔, V·J·李, J·特莱斯 申请人:迈克罗赛药品公司