专利名称：通过使用外排泵抑制剂增加肽脱甲酰基酶抑制剂敏感性的方法
技术领域：
本发明涉及肽基脱甲酰基酶(peptidyl deformylase(PDF))抑制剂，并且特别涉及通过使用外排泵抑制剂增强PDF抑制剂对革兰氏阴性菌的效力的方法。
背景技术：
对现有抗生素物质持续出现和扩展的基于靶标的抗性使得明显需要旨在阻止这些机制的化合物修饰，或更优的需要发现针对新的细胞功能的化合物，对于所述的细胞功能，不希望有预先存在的基于靶标的抗性赋予其交叉抗性。抑制PDF至今未开发的功能的一类新的羟胺化合物在这方面表现出极大的前途，特别是针对革兰氏阳性菌，其中包括对于常用抗生素具有特征明确的抗性机制的那些革兰氏阳性菌。见WO 02/102790A1。PDF是在原核生物如细菌中发现的金属肽酶。在原核生物中的蛋白质合成以N-甲酰甲硫氨酸(fMet)开始。在蛋白质合成起始后，甲酰基被PDF移除。该活性对于蛋白质的成熟是关键的。已经表明PDF是细菌生长所需的。由于在真核生物中的合成不依靠fMet起始，所以抑制PDF的制剂是新的抗微生物药物和抗细菌药物开发的有吸引力的候选物。
然而开发这些新制剂的主要潜在的障碍是那些一般机制，所述的机制是造成对大范围结构不相关化合物内在抗性的原因。这些包括膜的非通透性和外排，这在革兰氏阴性菌的情况中表现最强烈，其中已经表明外膜和外排泵协同作用使得多种结构不相关化合物的细胞内聚集最小化。见Nikaido，J Bacteriol，178卷，No.20，第5853-5859页(1996)；Nikaido，Curr Opin Microbiol，1卷，No.5，第516-523页(1998)；和Nikaido和Zgurskaya，J Mol Microbiol Biotechnol，3卷，No.2，第215-218页(2001)。耐药结节细胞分化(RND)家族的革兰氏阴性外排泵看来具有最广泛的底物范围，并且因此与革兰氏阴性的抗药性最普遍相关。在构造上，它们由内膜质子-药物反向转运蛋白、外膜通道和通称的膜融合蛋白质组成，认为所述的膜融合蛋白质作用为促进周质中的内膜成分和外膜成分相互作用。底物排出是通过质子动势推动的，并且近期的数据表明可以将底物从周质或细胞质膜的内小叶中泵出来。见Elkins和Nikaido，JBacteriol，184卷，No.23，第6490-6498页(2002)；Li，Ma，Livermore和Nikaido，Antimicrob Agents Chemother，38卷，No.8，第1742-1752页(1994)；和Yu等人，Science，300卷，No.5621，第976-980页(2003)。
外排泵尤其是RND家族的那些外排泵所符合的广泛的底物范围是这样的，即它们减少具有更高靶标活性的新抗微生物剂有效性的潜力必须在对抗广泛范围或革兰氏阴性范围的药物开发计划中预见并且考虑到。此外，开启或增加外排泵表达的调节突变可以为所给泵赋予针对一些或所有底物的增加的抗性，所述的调节突变大概通过暴露在抗微生物剂或杀生物剂下选择。见Chuanchuen等人，Antimicrob Agents Chemother，45卷，No.2，第428-432页(2001)。外排泵的过量表达子已经被临床分离出来[见Beinlich，Chuanchuen和Schweizer，FEMS Microbiol Lett，198卷，No.2，第129-134页(2001)；Mazzariol等人，Antimicrob AgentsChemother，44卷，No.12，第3441-3443页(2000)；和Ziha-Zarifi等人，Antimicrob Agents Chemother，43卷，No.2，第287-291页(1999)]，并且泵的过量表达可以显著的促成抗药性的增加。因此，尽管对于新剂的交叉抗性以由其它抗生素所选择的基于靶标的突变形式预先存在，抗微生物剂暴露可以选择具有对新剂减少的敏感性的泵的突变体。
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是重要的新出现机会性病原体，代表了基于外排的抗性谱的一端，具有有重叠底物范围的多种RND家族泵和明显不可通透的外膜，已经表明所述的外膜通过限制流入来显著增加泵的效力。见Poole，J Mol Microbiol Biotechnol，3卷，No.2，第255-264页(2001)。可能代表另一端的是流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)，它是重要的呼吸病原体[见Dagan等人，Pediatr Infect Dis J，19卷，No.2，第95-104页(2000)；Gotfried，Am J Med，111卷，Suppl.9A，第25S-29S页(2001)；Pfaller，Ehrhardt和Jones，Am J Med，111卷，Suppl.9A，第4S-12S页(2001)；和Sokol，Am J Med，111卷，Suppl.9A，第19S-24S页(2001)]，仅具有一个已知的RND家族(acrAB同系物)泵[见Fleischmann等人，Science，269卷，No.5223，第496-512页(1995)；和Sanchez，Pan，Vinas和Nikaido，J Bacteriol，179卷，No.21，第6855-6857页(1997)]，并且其特征是相对可通透的外膜。增加的外膜通透性参与限制外排泵对即使是相对较大的底物如红霉素的效力。见Sanchez，Pan，Vinas和Nikaido(1997)，见上。因此，流感嗜血菌可以代表革兰氏阴性病原体的这种实例，即在其中可以希望基于内在抗性和获得抗性的外排引起较少的问题。除此之外，并且与红霉素作为流感嗜血菌acrAB同系物的底物相符的是[见Sanchez，Pan，Vinas和Nikaido(1997)，见上]，在流感嗜血菌临床分离菌中对大环内酯的中等水平的内在抗性也与外排相关。见Peric，Bozdogan，Jacobs和Appelbaum，Antimicrob Agents Chemother，47卷，No.3，第1017-1022页(2003)。还发现流感嗜血菌临床菌株对多种新的PDF抑制剂总体上表现出减少的敏感性。
总体上，上述讨论表明，通过存在于细菌尤其是革兰氏阴性菌中的外排泵对抗细菌剂的主动外排是促成细菌对这些制剂抗性的重要因素。因此，开发和使用与抗细菌剂组合的细菌外排泵抑制剂可以增强细菌尤其是革兰氏阴性菌对于多种抗细菌剂的敏感性，在所述的细菌中由于自细菌外排制剂，其对所述的抗细菌剂具有减少的敏感性。
发明概述一方面，本发明提供了在所提供的哺乳动物中治疗革兰氏阴性菌感染的方法，所述方法包括施用有效量的式(I)化合物
其中X是-CH2-、-S-、-CH(OH)-、-CH(OR)-、-CH(SH)-、-CH(SR)-、-CF2-、-C＝N(OR)-或-CH(F)-，其中R是烷基；R1是芳基或杂芳基；每个R2、R3、R4和R5独立地是氢或烷基，或R2或R3和R4或R5共同形成C4-7环烷基；并且n是0-3，条件是当n是0时，X是-CH2-，或其盐或其前体药物；以及外排泵抑制剂。
在一种有用的实施方案中，本发明提供了在哺乳动物中治疗由具有RND外排泵的革兰氏阴性菌引起的革兰氏阴性菌感染的方法。此方法包括施用有效量的化合物 以及在革兰氏阴性菌中抑制RND外排泵的外排抑制剂。
在另一方面中，本发明提供了增加革兰氏阴性菌对式(I)化合物或其盐或其前体药物的敏感性的方法
其中X是-CH2-、-S-、-CH(OH)-、-CH(OR)-、-CH(SH)-、-CH(SR)-、-CF2-、-C＝N(OR)-或-CH(F)-，其中R是烷基；R1是芳基或杂芳基；每个R2、R3、R4和R5独立地是氢或烷基，或R2或R3和R4或R5共同形成C4-7环烷基；并且n是0-3，条件是当n是0时，X是-CH2-；本方法包括使细菌接触抑制革兰氏阴性菌中的外排泵的有效量式(I)的化合物和外排泵抑制剂。
在一个实施方案中，本发明提供了增加具有RND外排泵的革兰氏阴性菌对下述化合物敏感性的方法 所述方法包括使革兰氏阴性菌接触抑制革兰氏阴性菌中的RND泵的有效量的化合物和外排泵抑制剂。
另一方面，本发明提供了包含式(I)的化合物或其盐或其前体药物、外排泵抑制剂和可药用的载体的药物组合物
其中X是-CH2-、-S-、-CH(OH)-、-CH(OR)-、-CH(SH)-、-CH(SR)-、-CF2-、-C＝N(OR)-或-CH(F)-；其中R是烷基；R1是芳基或杂芳基；每个R2、R3、R4和R5独立地是氢或烷基，或R2或R3和R4或R5共同形成C4-7环烷基；并且n是0-3，条件是当n是0时，x是-CH2-。
附图简述
图1.新PDF抑制剂LBM415和LBK611的结构。
图2.流感嗜血菌中acrAB外排泵基因的基因排列，其显示了用于插入失活的卡那霉素抗性标记(箭头)的位置和方向。同时显示的是插入在ORF HI1462(tolC)中的卡那霉素抗性标记的位置和方向。
图3.在临床分离菌NB65062中缺失acrA的区域(黑色条)。显示了用于PCR的引物位置。由于acrAHIF的位点在NB65062中缺失，引物对acrAHIF/acrAHIR不能生成产物。
图4.对比截短的acrR基因和野生型的acrR，其中截短的acrR基因来自具有对LBM415和LBK611减少的敏感性的4个临床流感嗜血菌分离菌。突变如下NB65016，在核苷酸442后插入1个碱基(C)(移码)；NB65027，在核苷酸366后，缺失8bp-插入GTT(移码)，下游插入另一个碱基；NB65051，在核苷酸322后缺失4bp(移码)；NB65063，C252T替代(终止)。
发明详述
本文引用的所有专利申请、专利和参考文献在此全文引用作为参考。
除非另外说明，在说明书中用到的下列术语具有下列意思。
术语“环烷烃”或“环烷基”包含3环到7环碳原子，并且例如是环丙基、环丁基、环戊基和环己基。
术语“烷基”指的是饱和或不饱和的脂族基，如包括具有1-10个碳原子的直链、支链和环基的链烯基或炔基、环烷基或取代的烷基。当存在“烷基”时，优选的“烷基”是饱和脂族基或环烷基，更优选的是C1-7烷基，特别是C1-4烷基。“烷基”的实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、新戊基、正己基或正庚基、环丙基，并且特别是正丁基。
术语“取代的烷基”指的是用1个或多个取代基取代的烷基基团，优选的是1-3个取代基，包括但并不限于，取代基如卤素、低级烷氧基、羟基、巯基、羧基、环烷基、芳基、杂芳基等。取代的烷基基团的实例包括但不限于-CF3-、-CF2-CF3、羟甲基、1-或2-羟乙基、甲氧基甲基、1-或2-乙氧基乙基、羧甲基、1-或2-羧乙基等。
术语“芳基”指的是具有单环的6-14个碳原子的芳香碳环基团，包括但不限于，基团如苯基；或多种稠环，包括但不限于，基团如萘基或蒽基；并且特别是苯基。
术语“杂芳基”指的是4元到7元的单环芳香杂环，或由4元到7元的单环芳香杂环和稠合苯环组成的二环。杂芳基在环中具有至少1个杂原子，优选的1或2个杂原子，杂原子包括但不局限于，杂原子如N、O和S。优选的杂芳基基团是吡啶基、嘧啶基或苯并二氧戊环基(benzdioxolanyl)。
芳基或杂芳基可以是未取代的或被1个或多个取代基取代，取代基包括但不限于C1-7烷基，特别是C1-4烷基如甲基、羟基、烷氧基、酰基、酸基、SCN、卤素、氰基、硝基、烷硫基、苯基、杂烷基芳基、烷基磺酰基和甲酰基。
本文用到的术语“羰基胺”指的是-NHC(O)-基团，其中基团的氨基部分连接到芳基/杂芳基上，并且基团的羰基部分连接到氮杂环4-7烷、硫杂氮杂环4-7烷或imidazacyclo4-7烷。
术语“杂烷基”指的是上面定义的饱和或不饱和的C1-10烷基，并且特别是包含1或多个作为基团中主要支链或环状链一部分的杂原子的C1-4杂烷基。杂原子可以独立地选自其中R是氢或烷基的-NR-、-S-、-O-和-P-；优选地其中R是氢或烷基的-NR-和/或-O-。杂烷基基团可以在杂原子(如果化合价可行)或在碳原子上连接到分子的其余部分上。杂烷基基团的实例包括但不限于，基团如-O-CH3、-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-O-CH3、-S-CH2-CH2-CH3、-CH2-CH(CH3)-S-CH3和-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-。
杂烷基可以是未取代的或是用1个或多个取代基取代，优选的1-3个取代基，包括但不限于烷基、卤素、烷氧基、羟基、巯基、羧基，并且特别是苯基。基团的杂原子和碳原子可以被取代。杂原子还可以是氧化形式。
本文用到的术语“烷氧基”指的是连接到氧原子上的C1-10烷基，优选的是C1-7烷氧基，更优选的是C1-4烷氧基。烷氧基基团的实例包括但不限于，基团如甲氧基、乙氧基、正丁氧基、叔丁氧基和烯丙氧基。
本文用到的术语“酰基”指的是基团-(O)CR，其中R是烷基，特别是C1-7烷基，如甲基。酰基基团的实例包括但不限于乙酰基、丙酰基和丁酰基。
本文用到的术语“酸基”指的是基团-OC(O)R，其中如上所述R是氢或烷基，特别是C1-7烷基，如甲基或乙基；或苯基或取代的烷基。
本文用到的术语“烷氧羰基”指的是基团-COOR，其中R是烷基，优选的是C1-7烷基，如甲基或乙基。
本文用到的术语“卤素”指的是氯、溴、氟、碘，并且特别是氟。
本文用到的术语“烷硫基”指的是基团-SR，其中R是如上定义的烷基，例如甲硫基、乙硫基、丙硫基、丁硫基等。
本文用到的术语“杂烷基芳基”指的是如用芳基基团特别是苯基取代的杂烷基基团-O-CH2-。苯基基团自身还可以用1个或多个取代基取代，如卤素特别是氟和氯；以及烷氧基如甲氧基。
本文用到的术语“烷基磺酰基”指的是基团-SO2R，其中R是烷基，特别是C1-7烷基，如甲磺酰基。
术语“敏感性”指的是革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌对于本文公开的PDF抑制剂的存在的敏感性。增加细菌对PDF抑制剂的“敏感性”指的是在细菌周围的培养基中较低浓度的PDF抑制剂将会抑制细菌。
本文用到的术语“外排泵”指的是位于细菌细胞膜中的1个或多个蛋白质组分组成的泵，它将底物分子如抗生素转运出细菌。一些革兰氏阴性菌中的外排泵以及所有革兰氏阳性的多药外排泵穿过一层细胞质膜层运出底物，并且其由1个组分(位于细胞质膜上的转运蛋白)组成。在革兰氏阴性菌中，大部分多药外排泵包含3个组分位于细胞质膜(内膜)中的转运蛋白、外膜通道以及连接这两者的周质连接蛋白质。在该排列中，外排泵横贯内膜和外膜，并且因此将底物从胞质或细胞质膜中运出到外部介质中。3组分外排泵的转运蛋白使用质子动势来排出底物交换质子，并且属于主要易化(MF)超家族或属于耐药结节细胞分化(RND)家族。
本文用到的术语“RND外排泵”指的是具有属于RND家族转运蛋白的外排泵。RND转运蛋白的预测结构包含12个跨膜螺旋，但是在跨膜螺旋1和2以及7和8之间还包含2个大的周质结构域。RND外排泵能够泵出大范围的底物，包括几乎所有的亲脂的和两亲的抗生素；化疗剂；代谢抑制物如浅蓝菌素；染料；去污剂如SDS、Triton X-100和胆汁盐；以及溶剂。同源RND外排泵在大肠杆菌(E.coli)、铜绿假单胞菌、流感嗜血菌和淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)中发现。
本文用到的术语“外排泵抑制剂”指的是特异性干扰外排泵转运底物如抗生素的能力的化合物。
本文用到的术语“治疗”包括但不限于，预防、减少和/或消除由细菌感染动物引起的临床症状；预防、减少和/或消除细菌造成的动物感染；或预防、减少和/或消除细菌造成的动物染菌。涉及的细菌优选是革兰氏阴性菌，并且动物优选是哺乳动物。
本文用到的术语“哺乳动物”包括人和其它灵长类、小鼠、大鼠、绵羊、牛、马、狗、猪、猫、狗和其它物种。
本文用到的术语“有效量”指的是当组合使用PDF抑制剂和外排泵抑制剂来治疗动物中的细菌感染或增加细菌对PDF抑制剂的敏感性时，足以抑制PDF的单独的PDF抑制剂和外排泵抑制剂的量。有效量根据下述而不同所使用的特定PDF抑制剂和外排泵抑制剂、所涉及的特定细菌、动物年龄、重量、性别和动物的医学疾病(medical condition)、感染的类型和严重程度以及施用途径，但是仍可以由本领域的技术人员容易的确定。要在治疗细菌感染或增加细菌的敏感性中完全有效所需的PDF抑制剂的有效量大大低于PDF抑制剂在没有外排泵抑制剂下施用所需的量。
本文用到的术语“可药用载体”指的是赋形剂，其用于制备通常安全、无毒并且非生物学也非其它方面不希望的药物组合物，所述的赋形剂包括兽医用途和人类用途可接受的赋形剂。在说明书和权利要求中所用的“可药用载体”包括1种或多于1种的所述载体。
本发明总体上涉及PDF抑制剂和这种发现，即在细菌(特别是革兰氏阴性菌，如流感嗜血菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilus)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、铜绿假单胞菌和淋病奈瑟氏球菌)中，编码RND外排泵组分的基因失活显著性的增加了细菌对PDF抑制剂的敏感性。还发现在革兰氏阴性菌(如流感嗜血菌)中编码抑制RND外排泵表达的阻抑蛋白的基因失活，会减少细菌对所公开的PDF抑制剂的敏感性。这些发现和下列其它证据(见实施例)一起表明，外排泵特别是RND外排泵，在产生细菌(特别是革兰氏阴性菌)对PDF抑制剂的内在抗性中起到了主要的作用。这些发现还表明细菌中外排泵的抑制可以增加细菌(特别是革兰氏阴性菌)对PDF抑制剂的敏感性。
为了此目标，本发明涉及如下所述的PDF抑制剂和外排泵抑制剂组合的用途，其用于治疗动物(特别是人和其它哺乳动物)中的细菌感染并且增加细菌对PDF抑制剂的敏感性。本发明还涉及包含PDF抑制剂和外排泵抑制剂的组合的药物组合物。
本文用到的术语“PDF抑制剂”指的是式(I)的化合物
其中X是-CH2-、-S-、-CH(OH)-、-CH(OR)-、-CH(SH)-、-CH(SR)-、-CF2-、-C＝N(OR)-或-CH(F)-，其中R是烷基；R1是芳基或杂芳基；每个R2、R3、R4和R5独立地是氢或烷基，或R2或R3和R4或R5共同形成C4-7环烷基；并且n是0-3，条件是当n是0时，X是-CH2-，或其盐或其前体药物。
在一个实施方案中，R1是式(II)的杂芳基 其中每个R6、R7、R8和R9独立地是氢、烷基、取代的烷基、羟基、烷氧基、酰基、酸基、SCN、卤素、氰基、硝基、烷硫基、苯基、杂烷基芳基、烷基磺酰基或甲酰基。
在另一个实施方案中，R1优选的是式(II.1)的杂芳基 其中R6、R7、R8和R9如上述式(II)中所定义的，例如，其中a)R6是硝基、烷基、取代的烷基、苯基、羟基、甲酰基、杂烷基芳基、烷氧基、酰基或酸基，优选是烷基(特别是C1-7烷基)、羟基或烷氧基(特别是C1-7烷氧基)；并且R7、R8和R9是氢，或b)R6、R8和R9是氢；并且R7是烷基、取代的烷基、苯基、卤素、烷氧基或氰基，优选是烷基(特别是C1-7烷基)、取代的烷基(特别是取代的C1-7烷基如-CF3)、或烷氧基(特别是C1-7烷氧基)，或c)R6、R7和R9是氢；并且R8是烷基、取代的烷基、卤素、硝基、氰基、烷硫基、酸基、苯基、烷基磺酰基或羧基烷基，优选是烷基(特别是C1-7烷基)、取代的烷基(特别是-CF3)、卤素或羧基烷基，或d)R6、R7和R8是氢；并且R9是烷基、卤素或羟基，或e)R7和R9是氢；并且每个R6和R8独立地是卤素、烷基、取代的烷基、苯基或氰基，或f)每个R7和R9是烷基或取代的烷基；并且R6和R8是氢，或g)R6和R9是氢；R7是烷基或取代的烷基；并且R8是硝基，或h)R8和R9是氢；R6是氰基；并且R7是烷氧基，或i)R7和R8是氢；并且R6是烷基、取代的烷基、烷氧基或SCN；并且R9是烷基或取代的烷基，或j)R6和R7是氢；R8是硝基或卤素；并且
R9是烷基或取代的烷基，或k)R6、R7、R8和R9是氢，或l)R6和R7，与它们连接的碳原子一起形成苯基基团，优选的用羟基取代；并且R8和R9是氢，或m)R6和R7是氢；并且R8和R9，与它们连接的碳原子一起形成苯基基团，或n)n是0，或o)n是0；并且每个R6、R7、R8、R9独立地是氢、烷基或卤素，并且更特别地R6、R7、R8和R9是氢，或p)n是0；R6、R8和R9是氢；并且R7是烷基，或q)n是0；R6、R7和R9是氢；并且R8是烷基或卤素。
在另一个实施方案中，R1是式(II.2)的基团 其中R6、R7、R8和R9如上述为式(II)所定义的，特别地，R7和R8以及与它们连接的碳原子一起形成苯基基团；并且R6和R9是氢。
而在另一个实施方案中，R1是式(III)的基团
其中每个R6、R7、R8和R9独立地是氢、烷基、取代的烷基、苯基、卤素、羟基或烷氧基，例如，其中a)R6和R8是氢；R9是氢或烷基；并且R7是烷基，取代的烷基或苯基，或b)R6、R7和R9是氢；并且R8是卤素、烷基或取代的烷基，或c)R7、R8和R9是氢；并且R6是羟基。
在特别有用的实施方案中，杂芳基是式(III.1)的基团 其中R6、R7、R8和R9如为式(III)所定义的。
在另一个实施方案中，R1是未取代苯基或苯基用烷氧基(如甲氧基)、或芳氧基(如苯氧基)取代。
在特别有用的实施方案中，式(III.1)的化合物是
在另一个实施方案中，R1是式(IV)的基团 其中每个R10和R11独立地是氢或卤素，特别的，R10和R11都是氢或都是卤素。
要意识到式(I)的化合物可以以旋光异构体、外消旋物或非对映异构体的形式存在。例如，当式(I)的化合物中R2和R3是不同的残基或其中R4和R5是不同的残基，那么化合物是不对称的并且可以具有R构型或S构型。可以理解的是式(I)的化合物包含所有的对映异构体和它们的混合物。类似的考虑应用在所述的表现出不对称碳原子的原材料中。
式(I)的化合物可以以游离形式或盐形式存在，例如，以可药用盐的形式。化合物的“可药用盐”指的是生理学可接受和可药用的盐，其具有母体化合物的目的药物活性并且不会引起不需要的毒物学作用。此类盐包括(1)与无机酸形成的酸加成盐，无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或与有机酸形成的酸加成盐，有机酸如乙酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1，2-乙烷-二磺酸、2-羟基乙烷磺酸、苯磺酸、4-氯代苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑磺酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基磺酸、葡糖酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、水杨酸、硬脂酸、粘康酸等；或(2)当母体化合物中存在的酸性质子被金属离子(如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子)置换时形成的盐；或与有机碱的配位物，有机碱如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、tromethamine、N-甲基葡糖胺等。
式(I)的化合物可以作用为前体药物。“前体药物”指的当该前体药物施用给哺乳动物对象时，在体内释放根据式(I)的活性母体药的任何化合物。式(I)的化合物的前体药物按照修饰可以在体内切开以释放母体化合物的方式通过修饰存在于式(I)的化合物中的官能团制备。前体药物包括这样的式(I)的化合物，其中的羟基、氨基或硫氢基基团结合到任何基团上，所述的任何基团可以在体内被切割以分别生成游离的羟基、氨基或硫氢基基团。前体药物的实例包括但不局限于，酯，如乙酸酯衍生物、甲酸酯衍生物和苯甲酸酯衍生物；碳酸酯，如N，N-二甲胺基-羰基；在式(I)的化合物中的羟基官能团的酯等。
式(I)的化合物可以通过本领域的技术人员已知并且在例如WO02/102790 A1中所描述的合成化学方法得到。
一方面，本发明提供了治疗动物(特别是哺乳动物)中细菌感染(特别是革兰氏阴性菌感染)的方法。本方法包括施用有效量的PDF抑制剂(例如式(I)所包含的化合物或其盐或其前体药物)和外排泵抑制剂。
PDF抑制剂和外排泵抑制剂的组合增加了革兰氏阴性菌对PDF抑制剂的敏感性。因此，在使用PDF抑制剂和外排泵抑制剂的组合中，由在外排泵抑制剂缺乏时对特定的PDF抑制剂有抗性(例如具有减少的敏感性)的细菌引起的革兰氏阴性感染可以用特定的PDF抑制剂治疗。另外，细菌在没有外排泵抑制剂时对PDF抑制剂敏感的革兰氏阴性感染，可以使用较低剂量的PDF抑制剂，因此减轻使用高剂量的PDF抑制剂而发生的副作用的危险。
如上所述，大部分革兰氏阴性菌具有3组分的外排泵，所述的外排泵由位于细胞质膜(内膜)中的转运蛋白、外膜通道以及连接这两者的周质连接体蛋白质组成。见Nikaido(1996)，见上；Nikaido，Clin Infect Dis，27卷(Supp.1)，第S32-S41页(1998)；和Zgurskaya和Nikaido，Mol Microbiol，37卷，No.2，第219-225页(2000)。在此排列中，外排泵横贯内膜和外膜，并且因此将底物如抗生素从胞质或细胞质膜中运出到外部介质中。见Zgurskaya和Nikaido(2000)，见上。3组分外排泵的转运蛋白使用质子动势来排出底物交换质子，并且属于MF超家族或属于RND家族。见Nikaido(1998)，见上。
在一个实施方案中，要治疗的革兰氏阴性菌感染由具有RND外排泵的革兰氏阴性菌引起。如上所述，术语“RND外排泵”指的是具有属于RND家族转运蛋白的外排泵，其另外包括在根瘤菌(Rhizobium)中推定的结瘤信号分子的转运蛋白。见Saier等人，FASEB J，12卷，第265-274页(1998)；和Saier等人，Mol Microbiol，11卷，第841-847页(1994)。所有RND外排泵家族的成员具有相似的结构。它们的预测结构包含12个跨膜螺旋，并且在跨膜螺旋1和2以及7和8之间还包含2个大的周质结构域。见Nikaido(1998)，见上；和Zgurskaya和Nikaido(2000)，见上。RND外排泵能够泵出大范围的底物，所述的底物包括几乎所有的亲脂的和两亲的抗生素；化疗剂；代谢抑制物如浅蓝菌素；染料；去污剂如SDS、Triton X-100和胆汁盐；以及溶剂。见Nikaido，Curr Opin Microbiol(1998)，见上；和Nikaido(1996)，见上。介导对临床相关抗生素的抗性的大多数的外排转运蛋白是RND家族的成员。见Saier等人，FASEBJ(1998)，见上。具有RND外排泵的革兰氏阴性菌包括但不限于，粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、大肠杆菌、卡他莫拉氏菌(Moraxellacatarrhalis)、枯草芽孢杆菌、肺炎克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血菌、淋病奈瑟氏球菌、burholderia cepacia、类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)、嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)、鲍曼不动杆菌(acinetobacter baumannii)和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。同源的外排RND泵可以在革兰氏阴性菌如大肠杆菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血菌和淋病奈瑟氏球菌中找到。见Nikaido，Curr Opin Microbiol(1998)，见上。在特别有用的实施方案中，具有RND泵的革兰氏阴性菌是流感嗜血菌。
在治疗革兰氏阴性菌感染的方法的特别有用实施方案中，式(I)的化合物是
在革兰氏阴性菌中对外排泵(特别是RND外排泵)特异性的外排泵抑制剂在本领域中众所周知。例如，美国专利号6,114,310描述了一类常见的外排泵二肽抑制剂，其增强了大范围的抗生素针对多种革兰氏阴性菌的活性。在此常见类中的二肽外排泵抑制剂的实例是具有下列结构的MC-04,124， 已经表明它抑制RND外排泵并且增强一些抗生素针对多种革兰氏阴性菌的活性，所述革兰氏阴性菌如大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血菌和鲍曼不动杆菌。见Cho等人，40th/CAAC(2000)；和Watkins等人，Bioorgan Med Chem Lett，第13卷，第4241-4244页(2003)。增强抗生素针对革兰氏阴性菌活性的RND外排泵抑制剂的其它实例包括具有下列结构的二肽抑制剂MC-207,110
其如在Renau等人，J Med Chem，42卷，第4928-4931页(1999)；和Lomovskaya等人，Antimicrob Agents Chem，45卷，No.1，第105-116页(1991)中所描述的，以及具有下列结构的二肽抑制剂MC-002,595 其如在Lomovskaya等人，Antimicrob Agents Chem(1991)，见上中所描述的。
增强唑烷酮抗细菌剂针对革兰氏阴性菌的活性的RND外排泵抑制剂的另一实例是如在美国专利号6,251,869中所描述的精氨酸衍生物。
对革兰氏阴性菌如铜绿假单胞菌中的RND外排泵特异性的外排泵抑制剂的另一个实例是由放线菌产生的贝那他汀(benastatin)A和B的硫酸盐，例如具有下列结构的MF-EA-371α
以及具有下列结构的MF-EA-371δ 如在Lee等人，(2000)，40th/CAAC(2000)中所描述的。
对于在被诊断出具有革兰氏阴性菌感染的人和其它动物(特别是人和其它哺乳动物)中革兰氏阴性菌感染的治疗，可通过任何常规途径施用PDF抑制剂和外排泵抑制剂或者其药物组合物，施用途径如局部或全身的，例如口服、局部、肠胃外的、皮下的或通过吸入。途径的选择将取决于感染的类型、严重程度和位置、以及引起感染的细菌类型。
达到“有效量”的PDF抑制剂所需的剂量当然将取决于上述多种因素，如施用方式、要治疗的感染的类型和严重程度以及所需的效果。通常，例如对于人类治疗，剂量的有效量的范围是1-3000mg每天(例如1500mg每天)，取决于施用的途径和频率。此剂量相应是大约0.015-50mg/kg体重每天。适当的剂量是例如大约5-20mg/kg体重每天。
所使用的特定的外排泵抑制剂的量将取决于多种因素，如革兰氏阴性菌的类型、革兰氏阴性菌对于特定PDF抑制剂的敏感性以及治疗动物的吸收。应当使用足够量的外排泵抑制剂来使得在治疗动物中的革兰氏阴性菌对可药用水平的PDF抑制剂敏感。特定的外排抑制剂的足够量可以通过这种方法容易的确定，即通过测试PDF抑制剂的最小抑制浓度(MIC)和对比单独使用PDF抑制剂的MIC和与外排泵抑制剂组合使用的PDF抑制剂的MIC。通常，施用的外排泵抑制剂对PDF抑制剂的摩尔比大约是从0.01到10。适当的摩尔比大约是从0.1到1.0。因此，用于治疗动物中革兰氏阴性菌感染的外排泵抑制剂的每日剂量的范围是大约0.0015-5mg/kg体重每天。适当的，每日剂量是大约0.5-2mg/kg体重每天。外排泵抑制剂可以在PDF抑制剂施用前施用，或与PDF抑制剂同时施用。
另一方面，本发明提供了增加革兰氏阴性菌对PDF抑制剂敏感性的方法，包括使细菌接触这种量的PDF抑制剂和外排泵抑制剂，所述量能有效抑制革兰氏阴性菌的外排泵。在用PDF抑制剂和外排泵抑制剂的组合治疗时本方法增加了PDF抑制剂对表达外排泵的革兰氏阴性菌细胞的效力。
在增加革兰氏阴性菌对PDF抑制剂敏感性的方法的一个实施方案中，革兰氏阴性菌的感染由具有RND外排泵的革兰氏阴性菌引起，所述的革兰氏阴性菌如粘质沙雷氏菌、大肠杆菌、卡他莫拉氏菌、枯草芽孢杆菌、肺炎克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血菌、淋病奈瑟氏球菌、burholderia cepacia、类鼻疽伯克霍尔德菌、嗜麦芽窄食单胞菌、鲍曼不动杆菌和恶臭假单胞菌。在另一个实施方案中，具有RND外排泵的革兰氏阴性菌包括大肠杆菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血菌和淋病奈瑟氏球菌。在特别有用的实施方案中，具有RND外排泵的革兰氏阴性菌是流感嗜血菌。可以用于本方法的尤其有用的PDF抑制剂和外排泵抑制剂是如上所描述的。
例如，可以在体外使用如在Lorian编著的Antibiotics in LaboratoryMedicine，3rdEd.，432页，Williams&Wilkins，Baltimore，MD中所描述的棋盘法，评估特定的外排泵抑制剂在增加革兰氏阴性菌对特定PDF抑制剂的敏感性中的功效。
另一方面，本发明提供了在动物如哺乳动物中，有效治疗细菌感染特别是革兰氏阴性菌感染的药物组合物。组合物包含如上所述的PDF抑制剂和外排泵抑制剂以及可药用的载体。
此组合物可以是本领域已知的任何形式，包括但不限于片剂、胶囊剂、糯米纸囊剂、快速溶解剂(无糯米纸囊)、粉剂、颗粒剂、锭剂、乳膏剂或液体制品，如口服或无菌的肠胃外溶液剂或混悬剂。PDF抑制剂和外排泵抑制剂还可以以微脂粒制剂、微团制剂或微乳剂制剂施用。存在于组合物中的PDF抑制剂还可以作为前体药物施用，其中施用的前体药物在所治疗的哺乳动物中生物转化以形成具有生物活性的药物。
本发明的局部制剂可以作为下列存在，如软膏剂、乳膏剂或洗剂、溶液剂、油膏剂、乳剂、硬膏剂、眼软膏剂和眼或耳的滴剂、浸泡敷料、透皮贴片、喷雾剂和气雾剂；并且可以包含适当的常规添加剂，如防腐剂、协助药物穿透的溶剂、以及软膏剂和乳膏剂中的润滑药。
制剂还可以包含相容的常规载体，如乳膏剂基质或软膏剂基质以及乙醇；或用于洗剂的油醇。例如此类载体的存在是制剂的大约1％到大约99％。例如，它们可以形成高达大约制剂的80％。
口服施用的片剂和胶囊剂可以是单位剂量的存在形式，并且可以包含常规的赋形剂，如结合剂，如糖浆剂、金合欢胶、明胶、山梨糖醇、西黄蓍胶、聚乙烯吡咯烷酮；填充料，如乳糖、糖、玉米淀粉、磷酸钙、山梨糖醇或甘氨酸；片剂润滑剂，如硬脂酸镁、滑石、聚乙二醇或二氧化硅；崩解剂如马铃薯淀粉；或可接受的湿润剂，如十二烷基硫酸钠。片剂可以根据标准药物专业中已知的方法包被。
口服液体制品可以是以如下形式，如水或油的混悬剂、溶液剂、乳剂、糖浆剂或酏剂，或作为在使用前要用水或其它溶媒重组的干燥产物存在。此类液体制品可以包含常规添加剂，例如助悬剂，如山梨糖醇、甲基纤维素、葡萄糖浆、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶或氢化的食用脂肪；乳化剂如磷脂酰胆碱、山梨聚糖单油酸酯(sorbitanmonooleate)或金合欢胶；非水的溶媒(可以包括食用油)，如杏仁油；油酯，如甘油、丙二醇或乙醇；防腐剂如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸，以及常规的增香剂或着色剂(如果需要)。
对于肠胃外施用，利用化合物和无菌溶媒(优选是水)制备流体单位剂型。取决于所使用的载体和浓度，PDF抑制剂和外排泵抑制剂可以在载体或其它适当的溶剂中混悬或溶解。在制备溶液剂中，可以将PDF抑制剂和外排泵抑制剂溶解在水中用于注射并且在充入到适当的小瓶或安瓿前过滤灭菌并封口。优选的，制剂如局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂可以溶解在溶媒中。为了增强稳定性，组合物可以在充入小瓶后冷冻并且在真空下将水移除。之后将干燥的冻干粉末密封在小瓶中，并且提供用于注射的一瓶附加水以在使用前重新组成液体。肠胃外混悬剂用基本一样的方法制备，除了PDF抑制剂和外排泵抑制剂是混悬而不是溶解在溶媒中，并且不能通过过滤灭菌。PDF抑制剂和外排抑制剂可以通过在混悬在无菌溶媒之前暴露在环氧乙烷下来灭菌。优选的，在组合物中包含表面活性剂和润湿剂以促进化合物的均衡分布。
例如如上所说明的，PDF抑制剂可以以游离形式或可药用盐的形式施用。此类盐可以以常规方法制备并且表现出和游离化合物相同级别的活性。
下列实施例用来说明本发明但不以任何方式限制其范围。
实施例方法和材料细菌菌株、质粒和生长培养基本研究中使用的细菌菌株和质粒在下表1中列出。L-肉汤或L-琼脂(Difco)用于大肠杆菌的常规生长。巧克力琼脂板(Remel)用于流感嗜血菌的常规生长。补充了10μg/mL的β-NAD(Fluka)和10μg/mL的氯高铁血红素/维生素K溶液(sBHI)(Remel)的脑心浸液肉汤(Remel)用于流感嗜血菌的液体肉汤培养。如前所述，使用M-IV培养基引起营养下调用于流感嗜血菌中天然感受态的诱导。见Poje和Redfield，Methods MolMed，71卷，No.，第57-70页(2003)。按照所需，向生长培养基中加入50μg/mL(大肠杆菌)或5μg/mL(流感嗜血菌)的卡那霉素。
表1本研究中所用的细菌菌株和质粒
*见Fleischmann等人，(1995)，见上。
**见Hoang，Karkhoff-Schweizer，Kutchma和Schweizer，Gene，212卷，No.1，第77-86页(1998)。
抗微生物剂敏感性测试按照National Committee for Clinical Laboratory Standards(NCCLS)所建立的方法，在HTM中通过使用2倍稀释的肉汤微量稀释来确定抗生素和底物的MIC。见NCCLS，Approved standard M7-A5，Wayne，PA(2003)。PDF抑制剂在Novartis Institutes for BioMedical Research，Cambrdge，MA合成。所有保存的抗生素从Sigma(St.Louis，MO)得到。
DNA操作根据说明，使用来自Gentra Systems Inc.(Minneapolis，MN)的Puregene tissue kit分离流感嗜血菌基因组DNA。用于PCR和测序的寡核苷酸从Genelink(Hawthorne，NY)得到，并且根据提供的说明，使用Molecular Bio-Products Inc.(San Diego，CA)的Easystart mix-in-a-tubesystem实现PCR反应。从分离的菌落中制备的基因组DNA或细胞在PCR反应中用作模板。根据和酶一起提供的说明书使用限制性内切核酸酶和修饰酶。如在说明中所详细说明的，使用Qiagen Inc.(Valencia，CA)的QIAquick PCR纯化或凝胶提取试剂盒，在琼脂糖凝胶电泳后纯化或分离DNA片段。通过Agencourt Inc.(Waltham，MA)进行核苷酸测序。
体外诱变和基因替换为了在流感嗜血菌中构建acrB同系物的插入敲除，使用引物acrBHIF(5’-CCACTTTAATGTATGAGGAAATCCG-3’)(SEQ ID NO.1)和acrBHIR3(5’-CGAATTACGTAAGATAACCTAAGTGCG-3’)(SEQ IDNO.2)以生成包含acrB基因的3.1kb PCR片段，其中使用了流感嗜血菌NB65001基因组模板DNA。根据和试剂盒一起提供的说明书，将acrB PCR产物连接到Invitrogen(Carlsbad，CA)的PCR2.1-Topo中，之后使用EcoRI将acrB片段切除并连接到pEX18Tc中。之后将此构建体在acrB片段中唯一的MfeI位点处线性化，用T4 DNA聚合酶使其成为平端并且连接到1.2kb平端PCR片段上以给出质粒pCDBKm，所述的PCR片段包含使用引物TN903KanF(5’-GCCACGTTGTGTCTCAAAATCTCTG-3’)(SEQ ID NO.3)和TN903KanR(5’CCAGTGTTACAACCAATTAACCAA-3’)(SEQ ID NO.4)从pACYC177中生成的TN903卡那霉素抗性决定子。包含流感嗜血菌DNA摄取序列的177bp DNA片段是使用前面所述的引物从NB65044基因组DNA中PCR扩增的。见Akerler等人，Proc Natl Acad Sci USA，99卷，No.2，966-971页(2002)。根据说明书，将产物克隆到Invitrogen的PCR2.1-Topo中，之后用KpnI切出并连接到pCDBKm的多克隆位点中的KpnI位点以给出pCDBKmUS。已经表明摄取序列的参与会促进更高水平的转化，这可用于将DNA引入不能通过天然转化有效摄取线性DNA的多种分离菌。见Akerley等人(2002)，见上。
为了构建可读框(ORF)HI1462(tolC)的插入敲除[见Trepod和Mott，Antimicrob Agents Chemother，48卷，No.4，第1416-1418页(2004)]，使用引物HI1462IF (5’-CACGCTTGCTTTGTTGATGTCTGGTGC-3’)(SEQ ID NO.5)和HI1462IR(5’-TCCCGCCATTGAGCTATATACCGCA-3’)(SEQ ID NO.6)，以生成包含来自NB65001基因组DNA模板的绝大部分HI1462的1.3kb PCR片段并且根据说明书将其直接连接到Invitrogen的PCR 2.1-Topo。之后将插入片段作为EcoRI片段回收并且连接到pBluescriptSK的EcoRI位点上。之后，将TN903卡那霉素抗性决定子连接到HI1462中唯一的MluI位点中(已经变成平端)，以生成pCD14Km，所述的TN903卡那霉素抗性决定子是来自pBAD18Tc的1.8kbHaeII片段，并且用T4DNA聚合酶变成了平端。此构建体具有和HI1462处于相同方向的卡那霉素抗性决定子。见图1。
为了构建ORF HI0893的插入突变(acrR的同系物以及acrAB表达的推定的阻抑物)，使用引物acrRHIF2(5’-TAATGATGAAAAGTGCGGTTAATT-3’)(SEQ ID NO.7)和acrRHIR(5’-TTTCTGAATCGCACGCCAAGAGCGT)(SEQ ID NO.8)以生成包含来自NB65001基因组DNA的ORF HI0893的752bp PCR片段。根据和试剂盒一起提供的说明书，将此PCR产物连接到Invitrogen的PCR 2.1Topo中，之后作为EcoRI片段切出并克隆到EcoRI切开的pBluescriptSK中。之后用SfuI将此构建体线性化并且连接到包含TN903卡那霉素抗性决定子的1.2kb平端PCR片段上以生成质粒pCDRKm，所述的TN903卡那霉素抗性决定子使用上述引物从pACYC177中生成。
为了将acrB∷Km和acrR∷Km插入引入到基因组中，按照Poje和Redfield(2003)(见上)中所描述的，流感嗜血菌菌株在sBHI中生长到早期对数期(OD600大约是0.2)，并且通过营养下调在M-IV培养基中诱导天然感受态。按照前面描述的[见Poje和Redfield(2003)，见上]，感受态细胞用pCDBKmUS(用XbaI线性化)或pCDRKm(用ScaI线性化)转化，并且铺于巧克力琼脂上，所述的巧克力琼脂包含用于选择基因组中含有卡那霉素抗性标记细胞的5μg/mL卡那霉素。为了将HI1462∷Km插入物引入到菌株NB65044的基因组中，如前所述，感受态细胞用pCD14Km(用ScaI线性化)转化并且在巧克力琼脂板上选择。为了将此插入物引入菌株NB65027和NB65051中，如前所述使受体细胞成为感受态，用分离自NB65044-CDS0001的基因组DNA转化，并且在包含5μg/mL卡那霉素的巧克力琼脂板上选择。插入物通过PCR证实并且测序使用插入位点侧翼的引物产生的片段。
超敏感性菌株NB65062的PCR分析和acrA缺陷的补偿为了得到包含菌株中NB65062中的acrA基因的区域，使用引物acrRHIF1(5’-GTGCGGTGCCACCGCAAGGACATA-3’)(SEQ ID NO.9)和acrAHIR(5’-TGCAGGCTCTATTGCACCCACAATG-3’)(SEQ IDNO.10)以生成来自NB65062基因组DNA的PCR片段。见图2。将片段凝胶纯化并且确定核苷酸序列。
对于acrA缺陷的补偿，使用上述营养下调法，将包含功能性的acrAB泵、来自NB65044的基因组DNA用于转化NB65062。将转化的细胞铺于包含4μg/mL LBM415或2μg/mL红霉素(都是acrAB外排泵的底物)的巧克力琼脂上。
实施例1acrAB泵在减少对LBM415内在敏感性中的作用在实验室菌株NB65044中acrB的插入失活(见图1)显著性的增加了对LBM415的敏感性，表现为LBM415的MIC从对母体菌株为4μg/mL下降到对acrB-缺陷的衍生物NB65044-CDS0001为0.25μg/mL。见下表2。插入还增加了对LBK611和已知的泵底物红霉素的敏感性[见Sanchez、Pan、Vinas和Nikaido(1997)，见上]，并且更显著的增加了对另一大环内酯(氯林肯霉素)的敏感性，但是没有显著性的影响对泵的非底物四环素的敏感性[见Sanchez、Pan、Vinas和Nikaido(1997)，见上]。见表2。另一个已知的泵的非底物氯霉素也没有受到acrB丧失的影响(数据未显示)。这证明了流感嗜血菌AcrAB泵是对LBM415减少的敏感性的主要驱动者。
表2流感嗜血菌中AcrAB外排泵对针对LBM415、LBK611、和大环内酯的内在抗性的贡献
ERM＝红霉素CLD＝氯林肯霉素TET＝四环素ND＝未做与敏感性菌株相比，抗性菌株中相对缺乏放射性标记的红霉素聚集，基于此，先前已经表明了外排在流感嗜血菌临床分离菌中参与介导适度水平的大环内酯抗性，而针对大环内酯的高水平的抗性与靶突变相关。见Peric，Bozdogan，Jacobs和Appelbaum(2003)，见上。一小部分先前检测的临床分离菌[见Peric，Bozdogan，Jacobs和Appelbaum(2003)，见上]对大环内酯具有超敏感性并且不会聚集放射性标记的红霉素，这说明它们没有外排泵。还要注意的是少数分离菌对大环内酯和PDF抑制剂都具有超敏感性。使用PCR诊断，得到了这些菌株中一些菌株的来自acrR-、acrA-或acrB的片段，表明泵基因即使在超敏感性的菌株中都广泛分布。但是对于超敏感性的菌株NB65062中(见表2)，没有得到acrA的产物，这表明存在基因缺失。使用侧翼引物(见图3)生成包含acrA区域的PCR片段，得到了尺寸明显小于所预测的2kb的片段。片段的核苷酸测序表明了导致acrA绝大部分丧失的873bp的缺失(见图3)。用来自NB65044的具有完整的acrAB基因座的基因组DNA转化NB65062，并且在包含LBM415(4μg/mL)或红霉素(2μg/mL)的巧克力琼脂上选择，得到了这种分离菌，其对两类抗生素都具有减少的敏感性，并且对泵的非底物菌株NB65062-CDS0038和NB65044-CDS0039而言在敏感性上没有变化。见表2。转化体的脉冲凝胶电泳分析给出了和NB65062的限制图谱一样的限制图谱，但是PCR和测序表明全长acrA恢复，证明了超敏感性确实是菌株NB65062中acrAB泵缺乏的结果。这与AcrAB泵提供对PDF抑制剂和大环内酯的内在抗性的作用一致，并且表明了大环内酯和LBM415超敏感性菌株可以由外排泵成分的突变丧失产生，这优于如先前所提出的使其不能获得外排泵来得到这些菌株[见Peric、Bozdogan、Jacobs和Appelbaum(2003)，见上]。来自这些菌株的acrR基因的测序也没有显示与母体菌株不同，这说明了在选择性平板中暴露在LBM415或红霉素期间也没有选出acrR突变。提供预测的多种acr基因PCR产物的其余超敏感性菌株可能具有其它较不明显的损害泵功能的突变，但这还需要证实。
由于至今在流感嗜血菌中仅鉴定了一个RND家族的泵，可以预期它对于流感嗜血菌在已知的流感嗜血菌唯一的天然环境-人宿主中存活起到重要的功能。在某些临床分离菌中该泵的丧失是奇怪的，因为该泵通常存在于流感嗜血菌中但是显然可以在某些情况下丧失，这表明它的作用不是不可缺少的。
实施例2acrAB同系物外排泵的外膜成分的鉴定已经证明了acrAB泵是流感嗜血菌中对PDF抑制剂和大环内酯的内在抗性的主要贡献者，感兴趣的是鉴定泵的外膜通道成分以完成泵的三层型构造(Tripartire architecture)。使用大肠杆菌中acrAB的伙伴TolC外膜通道进行流感嗜血菌基因组的蛋白质同源性检索，表明它和ORFHI1462显著性的相似性(期望值2.9×10-6)。有趣的是，铜绿假单胞菌的mexAB-oprM泵的oprM成分产生和HI1462更接近的匹配，其期望值为2.8×10-22，这说明HI1462是外膜通道的好的候选。与此相符的是，在流感嗜血菌NB65044中HI1462的失活(见图1)增加了对红霉素、氯林肯霉素和LBM415、acrAB泵所有底物的敏感性，但是不影响对泵的非底物四环素NBS65044-CDS0022的敏感性。见表2。近来，另一个组[见Trepod和Mott(2004)，见上]也报道鉴定了HI1462作为此泵的外膜通道。因此在此包括的数据支持了此发现并且将此通道成分的作用扩展到介导对LBM415的抗性中。
有趣的是，HI1462在其编码一半的C端上表现出和另一个ORFHI1340完全的同一性。除了此相似性，丧失HI1462对于针对泵的底物的特异性敏感性的显著影响证明了其作为通道的作用，这可能伴随着少量临床相关的来自HI1340的贡献。至少在NB65044中，HI1462和HI1340在它们N端部分的不同可以说明与不同的泵相互作用。实际上，存在仅通过一个基因ftsN分别分离自acrAB的emrAB泵的同系物HI0898和HI0899可以与HI1340作用。在流感嗜血菌中emrAB泵的失活不会影响对大范围化合物的敏感性[Trepod和Mott(2004)，见上]，表明那个家族泵典型的该泵不会有效的排出抗生素。然而，在排出化合物优于emrAB泵的acrAB泵存在时它会被灭活，所以在那种情况下该泵的缺乏不能显示出它泵出一些或所有测试底物的能力。备选的，HI1340能与acrAB泵作用但是不会显著性表达。HI1340作为外排泵成分的潜在的作用仍需确定。
实施例3acrAB和在流感嗜血菌临床菌株中对PDF抑制剂减少的敏感性在一些细菌的临床分离菌中对抗生素减少的敏感性与外排泵的过量表达相关。历史上，临床分离菌中阻抑物突变和/或泵基因的过量表达的鉴定已经足够将减少的抗性归因于外排，这可能是通常的情况，但是在阻抑物基因突变和/或泵的表达状态与对特定抗生素的抗性之间并不总是存在明确的关联。见Sobel、McKay和Poole，Antimicrob Agents Chemother，47卷，No.10，第3202-3207页(2003)。因此，为了直接说明acrAB泵是否在那些对PDF抑制剂具有最低敏感性的临床菌株中在介导减少的敏感性中起到重要作用，在菌株NB65016、NB65027、NB65051、NB65063、NB65069和NB65076中灭活acrB(见图1)，所有所述的菌株表现出对LBM415、LBK611和氯林肯霉素减少的敏感性。所有情况中泵的丧失显著增加了对两类抗微生物剂的敏感性，而对泵的非底物没有影响(见下表3)，这为acrAB泵广泛分布并且是这些菌株所表现出的减少的敏感性的主要贡献者提供了直接的证明。此外，在菌株NB65027和NB65051中HI1462的失活(见图1)类似的增加了特异性的对泵的底物的敏感性(见表3)，进一步证明了在临床分离菌中作用的acrAB泵中此外膜通道的作用。
表3在多种流感嗜血菌临床分离菌中acrAB外排泵对针对LBM415和LBK611的减少的敏感性的贡献和acrR在调节抗性中的作用
ERM＝红霉素CLD＝氯林肯霉素TET＝四环素注意●菌株NB65044-CDS0011和NB65044-CDS0014是在含有8μg/mLLBM415的巧克力琼脂板上选择的acrR突变体。
●NB65044-CDS0011 acrR在位置253上具有C→T核苷酸改变，引入了终止子。
●NB65044-CDS0014在位置164上具有T→C的核苷酸改变，以得到L→P的氨基酸置换。
实施例4acrR是acrAB泵的表达的阻抑物在具有对LBM415和大环内酯减少的敏感性的流感嗜血菌临床分离菌中，acrAB外排泵是对于针对这些制剂的减少的敏感性的主要贡献者，该证明表明了增加的泵的表达导致敏感性的减少。尽管外排泵调节新出现的描述变得越来越复杂，仍有很多情形是泵的过量表达是调节基因简单突变的结果。例如，铜绿假单胞菌nalB菌株过量表达mexAB-oprM是由于在mexR基因中的突变来，所述的mexR基因编码阻抑物，其紧接着位于mexAB-oprM基因的上游。见Poole等人，Antimicrob AgentsChemother，40卷，No.9，第2021-2028页(1996)。在流感嗜血菌中，紧接着位于acrAB上游的ORF HI0983(见图1)编码参与调控acrAB表达的acrR/tetR家族阻抑物。对来自NB65016、NB65027、NB65051和NB65063的HI0893的核苷酸测序显示出插入/缺失或点突变的存在导致移码或终止子的引入。见图4。对来自NB65069和NB65076的acrR基因测序显示出点突变导致相对于acrR基因的公开序列的氨基酸改变(数据未显示)。acrR突变的此优势强烈的表明由于acrR阻抑物功能的丧失，这些菌株中acrAB外排泵过量表达。
实施例5流感嗜血菌acrR在调节对LBM415和大环内酯的敏感性中的作用为了进一步检测acrR是否是acrAB泵表达的负调节物，以及acrR功能的丧失是否因此导致对LBM415和大环内酯的减少的敏感性，将acrR基因在实验室菌株NB65044中插入灭活。见图1。这导致对LBM415敏感性减少了2倍，并且对LBK611和氯林肯霉素的敏感性减少了4倍，但是没有改变对泵的非底物四环素NB65044-CDS0008的敏感性。见表3。这说明acrR作用为acrAB基因表达的负阻抑物。但是卡那霉素盒(cartridge)以与下游acrAB基因座相同方向存在于acrR中(见图1)，并且不能排除由于极性作用产生acrAB增加的表达。因此，为了进一步阐明acrR突变在减少对LBM415和大环内酯的敏感性中的作用，测试了NB65044暴露在8μg/mL的LBM415下时是否会选择出具有改变的acrR基因的突变体。在包含8μg/mL的LBM415的巧克力琼脂上选择出了菌株NB65044的突变体(频率；10-8-10-9)，并且对来自10个分离的突变体的acrR基因的检测显示在所有10个分离菌中acrR突变(数据未显示)。
这些突变体中的两个(NB65044-CDS0011和NB65044-CDS0014，分别具有引入的终止子和氨基酸改变)的敏感性测试(见表3的说明)显示对LBM415和LBK611的敏感性减少了8倍，以及对氯林肯霉素的敏感性减少了4倍，另外对四环素的敏感性没有改变。见表3。此外，表达模式显示出在两种突变体以及acrR失活的菌株NB65044-CDS0008中，acrAB转录物的多度增加(大约2.5倍)，这证明了泵的表达增加。还观察到了acrR转录物的多度类似的增加，表明了acrR的自身调节，该自身调节是对许多外排泵调节基因如铜绿假单胞菌中的mexZ和mexR所观察到的现象。在所选择的acrR突变体NB65044-CDS0011和NB65044-CDS0014以及菌株NB65044-CDS0008之间抗药性模式的相似性表明，在菌株NB65044-CDS0008中泵的过量表达不是由来自TN903盒启动子的极性作用产生的，其中acrR的失活是通过插入与下游acrAB基因座相同方向的TN903卡那霉素抗性决定子。总结起来，这些数据表明对LBM415减少的敏感性可以通过由acrR突变引起acrAB外排泵过量表达的形式突变得到。这和先前在流感嗜血菌中acrR失活的报告形成对比，在先前的报告中在acrR敲除的菌株中没有观察到对大范围化合物的敏感性改变。见Trepod和Mott(2004)，见上。增加的泵的表达并不总是同样地影响所有的泵的底物，特别是在泵的表达适度增加的情况下，所述的泵如已经以显著水平表达的mexAB-oprM或acrAB。由于泵的效力可能特异性的与个体底物性质相关，所以由适度的泵过量表达产生的敏感性的显著改变只能对某些集合的泵的底物观察到，所述的泵的底物在典型水平的泵的表达下被有效排出，在此情形中包括LBM415、LBK611和氯林肯霉素。
实施例6在流感嗜血菌和大肠杆菌中通过PABN和利血平对LBM415的增强流感嗜血菌NB65044-CDS0011用于流感嗜血菌测试。此菌株具有增加的泵的表达，认为这能导致对泵抑制的更灵敏的检测。
对于大肠杆菌测试，使用菌株NB27006。此菌株缺乏天然的AcrAB泵(在H Okusu等人，J.Bacteriol.1996 178306-308中描述)并且是克隆流感嗜血菌acrAB泵基因的适当宿主。
流感嗜血菌MIC测定在96孔无菌平板中操作，所述的无菌平板沿着一个轴是LBM415的范围，沿着另一个轴是外排抑制剂的范围。所使用的培养基是HTM(Remel)。使用BBL prompt system将接种物设置为每孔大约10-5个细菌。
大肠杆菌MIC测定按照上述操作，但是使用Mueller-Hinton测试培养基。
编码流感嗜血菌AcrAB泵的成分的基因从NB65044基因组DNA中PCR扩增，使用引物acrA prom F1(5’-AATTACGTAAGATAACCTAAGTGCG-3’)(SEQ ID NO.11)和在流感嗜血菌和大肠杆菌中通过MC-207,110和利血平对LBM415的acrBR3增强(5’-TATTAGCGGAATTATCTGAAG-3’)(SEQ ID NO.12)。将含有acrAB的产物克隆到Topo PCR2.1(Invitrogen)中并且转化到Top10感受态细胞中(Invitrogen)。将具有插入片段的质粒分离并且测序以确保在PCR和克隆期间没有引入突变。之后将此质粒转化到缺乏其天然AcrAB-TolC泵功能的大肠杆菌株NB27006中。由于已知LBM415被AcrAB-TolC泵出，通过MC-207,110对LBM415的活性增强与所报道的此化合物妨碍RND家族泵功能的能力相符合。还观察到MC-207,110增强了在流感嗜血菌中被AcrAB-TolC相对有效排出的另一个底物氯林肯霉素。对于非泵底物四环素不存在于MC-207,110对LBM415增强中所观察到的增强。总结起来，数据(未显示)表明对LBM415的作用确实是MC-207,110干扰AcrAB-TolC外排泵排出的总体能力产生的。但是利血平不会增强LBM415或氯林肯霉素(数据未显示)。利血平是基于例如ABC转运蛋白的外排的明确的抑制剂，但是对RND家族泵几乎没有活性。
实施例7在大肠杆菌中针对流感嗜血菌AcrAB外排成分的MC-207,110的活性MC-207,110的这种活性，即在过量表达AcrAB泵成分的流感嗜血菌中增强两种泵的底物氯林肯霉素和LBM415但是不影响泵的非底物四环素的活性，表明MC-207,110在流感嗜血菌中较弱的作用为AcrAB-TolC泵的抑制剂。为了进一步检测此作用，将流感嗜血菌的acrAB基因克隆到大肠杆菌NB27006中并且用于反式互补其中的AcrAB泵的缺陷。已经表明大肠杆菌天然的AcrAB-TolC泵能赋予针对LBM415的显著性的内在抗性(MIC一般为128μg/ml以及更高)。相应的，AcrAB-TolC泵功能的缺陷菌株是敏感的(MIC一般为约1μg/ml)。使用流感嗜血菌acrAB基因对大肠杆菌菌株NB27006中泵缺陷的补偿导致对LBM415抗性显著性的增加(MIC 32μg/ml)。这表明acrAB基因在大肠杆菌中有功能并且它们能和大肠杆菌TolC外膜通道形成功能性单元。
由于外排泵被此类因素如外膜通透性所影响，并且认为大肠杆菌具有比流感嗜血菌通透性小的外膜(可能引起外排对抗药性影响的增加)，推论出流感嗜血菌AcrAB泵的抑制的检测在大肠杆菌的背景中更加敏感。与此相符，在用流感嗜血菌acrAB基因反式补偿的大肠杆菌NB2007中，观察到了MC207,110对于LBM415和氯林肯霉素的活性增强。另外，没有检测到四环素的增强。这是令人感兴趣的，因为天然大肠杆菌AcrAB-TolC泵不排出四环素。这表明流感嗜血菌泵的抗生素底物模式在大肠杆菌菌株中被保存。此数据另外支持了这种观点，即MC-207,110能干扰流感嗜血菌AcrAB-TolC泵对LBM415的外排。
权利要求
1.在哺乳动物中治疗革兰氏阴性菌感染的方法，其包括施用有效量的式(I)化合物或其盐或其前体药物以及外排泵抑制剂； 其中X是-CH2-、-S-、-CH(OH)-、-CH(OR)-、-CH(SH)-、-CH(SR)-、-CF2-、-C＝N(OR)-或-CH(F)-，其中R是烷基；R1是芳基或杂芳基；每个R2、R3、R4和R5独立地是氢或烷基，或R2或R3和R4或R5共同形成C4-7环烷基；并且n是0-3，条件是当n是0时，X是-CH2-。
2.权利要求1的方法，其中杂芳基是式(III)的残基 其中每个R6、R7、R8和R9独立地是氢、烷基、取代的烷基、苯基、卤素、羟基或烷氧基。
3.权利要求11的方法，其中式(III)的化合物是
4.权利要求2的方法，其中细菌感染由具有RND外排泵的革兰氏阴性菌引起。
5.权利要求4的方法，其中革兰氏阴性菌选自大肠杆菌(E.coli)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、流感嗜血菌(H.influenzae)和淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)。
6.权利要求5的方法，其中革兰氏阴性菌是流感嗜血菌。
7.用于治疗在哺乳动物中由具有RND外排泵的革兰氏阴性菌引起的革兰氏阴性菌感染的方法，所述方法包括施用有效量的化合物 以及在革兰氏阴性菌中抑制RND外排泵的外排抑制剂。
8.权利要求7的方法，其中革兰氏阴性菌选自大肠杆菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血菌和淋病奈瑟氏球菌。
9.权利要求8的方法，其中革兰氏阴性菌是流感嗜血菌。
10.增加革兰氏阴性菌对式(I)的化合物或其盐或其前体药物的敏感性的方法 其中X是-CH2-、-S-、-CH(OH)-、-CH(OR)-、-CH(SH)-、-CH(SR)-、-CF2-、-C＝N(OR)-或-CH(F)-，其中R是烷基；R1是芳基或杂芳基；每个R2、R3、R4和R5独立地是氢或烷基，或R2或R3和R4或R5共同形成C4-7环烷基；并且n是0-3，条件是当n是0时，X是-CH2-；所述方法包括使细菌接触有效量抑制革兰氏阴性菌中的外排泵的式(I)的化合物和外排泵抑制剂。
11.权利要求10的方法，其中杂芳基是式(III)的残基 其中每个R6、R7、R8和R9独立地是氢、烷基、取代的烷基、苯基、卤素、羟基或烷氧基。
12.权利要求11的方法，其中式(III)的化合物是
13.权利要求10的方法，其中革兰氏阴性菌中的外排泵是RND外排泵。
14.权利要求13的方法，其中革兰氏阴性菌选自大肠杆菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血菌和淋病奈瑟氏球菌。
15.权利要求14的方法，其中革兰氏阴性菌是流感嗜血菌。
16.用于增加具有RND外排泵的革兰氏阴性菌对下述化合物的敏感性的方法， 包括使革兰氏阴性菌接触有效量抑制革兰氏阴性菌中的RND泵的化合物和外排泵抑制剂。
17.权利要求16的方法，其中革兰氏阴性菌选自大肠杆菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血菌和淋病奈瑟氏球菌。
18.权利要求17的方法，其中革兰氏阴性菌是流感嗜血菌。
19.药物组合物，其包含式(I)的化合物或其盐或其前体药物、外排泵抑制剂和可药用的载体； 其中X是-CH2-、-S-、-CH(OH)-、-CH(OR)-、-CH(SH)-、-CH(SR)-、-CF2-、-C＝N(OR)-或-CH(F)-，其中R是烷基；R1是芳基或杂芳基；每个R2、R3、R4和R5独立地是氢或烷基，或R2或R3和R4或R5共同形成C4-7环烷基；并且N是0-3，条件是当n是0时，x是-CH2-。
20.权利要求19的药物组合物，其中式(I)的化合物的杂芳基是式(III)的残基 其中每个R6、R7、R8和R9独立地是氢、烷基、取代的烷基、苯基、卤素、羟基或烷氧基。
21.权利要求20的药物组合物，其中式(III)的化合物是
22.权利要求19的药物组合物，其中外排抑制剂抑制革兰氏阴性菌中的RND外排泵。
23.权利要求22的药物组合物，其中革兰氏阴性菌选自大肠杆菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血菌和淋病奈瑟氏球菌。
24.权利要求23的药物组合物，其中革兰氏阴性菌是流感嗜血菌。
全文摘要
本发明提供了通过使用外排泵抑制剂增加PDF抑制剂对革兰氏阴性生物的敏感性的方法和组合物。
文档编号A61P31/04GK1976703SQ200580022039
公开日2007年6月6日 申请日期2005年6月29日 优先权日2004年6月30日
发明者C·R·德昂, N·S·赖德 申请人:诺瓦提斯公司