以独立的分子形式存在（例如，通过PCR、限制性核酸内切酶 消化或化学或体外合成所产生的cDNA或基因组或cDNA片段）。其还包括作为编码额外多 肽序列的杂交基因的一部分的重组DNA。术语"经分离的核酸"还指的是RNA，例如mRNA分 子，其由经分离的DNA分子编码，或经化学合成，或与至少一些细胞组分分离或基本上不含 至少一些细胞组分，例如其它类型的RNA分子或多肽分子。
[0063] 如本文所用的"样品"意味着动物；来自动物的组织或器官；细胞（在受试者体内、 直接从受试者获取，或维持在培养物中或来自经培养的细胞系的细胞）；细胞裂解物（或裂 解物部分）或细胞提取物；或含有一种或多种来源于细胞或细胞物质（例如，多肽或核酸） 的分子的溶液，其如本文所描述加以分析。样品还可以是含有细胞或细胞组分的任何体液 或排泄物（例如（但不限于）血液、尿液、粪便、唾液、泪液、胆汁）。
[0064] 如本文所用的"预防"意味着使得发展PRRS感染的易感性增加的受试者将发展 PRRS感染的机会减到最低。
[0065] 术语"多个"指的是两个或更多个。应进一步了解，对于核酸或多肽所给出的所有 碱基大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子质量值是近似值，并且是为了描述而提供。 另外，关于物质（例如抗原）的浓度或水平所给出的数值限制规定为近似值。因此，在浓度 指定为至少（例如）200pg的情况下，规定浓度应被理解为至少近似（或"约"）200pg。
[0066] 尽管类似或等价于本文所描述的那些方法和材料可以在本公开的实践或测试中 使用，但下文描述了适合的方法和材料。术语"包含"意味着"包括"。因此，除非上下文另 有要求，否则词语"包含"将被理解为暗示包括规定的化合物或组合物（例如，核酸、多肽、 抗原）或步骤，或化合物或步骤的组，但不排除任何其它化合物、组合物、步骤或其组。
[0067] "免疫原性组合物"是适合投予到人类或动物受试者（例如，在实验环境中）的物 质组合物，其能够引发特异性免疫反应，例如针对病原体，如PRRSV。这样的话，免疫原性组 合物包括一种或多种抗原（例如，完整的经纯化的病毒或其抗原亚单位，例如多肽）或抗原 表位。免疫原性组合物还可以包括一种或多种能够引发或增强免疫反应的额外组分，如赋 形剂、载剂和/或佐剂。在某些情况下，投予免疫原性组合物以引发保护受试者对抗由病原 体诱发的症状或病状的免疫反应。在一些情况下，由病原体引起的症状或疾病是通过在受 试者暴露于病原体之后抑制病原体的复制来预防（或治疗，例如减轻或改善）。在本公开的 上下文中，术语免疫原性组合物将被理解为涵盖打算投予到受试者或受试者群体用于引发 针对病毒的保护性或姑息性免疫反应的目的的组合物（即，疫苗组合物或疫苗）。
[0068] 术语"纯化"（例如，关于病原体或含有病原体的组合物）指的是从组合物中去除 组分的过程，这些组分的存在是不需要的。纯化是相对的术语，并且不需要从组合物中去除 不合需要的组分的所有痕迹。在疫苗生产的情形中，纯化包括以下过程：例如离心、渗析、离 子交换色谱以及尺寸排阻色谱、亲和纯化或沉淀。因此，术语"经纯化"不需要绝对纯度；相 反地，其规定为相对的术语。因此，举例来说，经纯化的病毒制剂是病毒比在其生成环境中 (例如在其自然复制的细胞或细胞群体内）或在人工环境中更加富集的制剂。基本上纯的 病毒的制剂可以经过纯化，以使得所需的病毒或病毒组分代表制剂的总蛋白质含量的至少 50%。在某些实施方案中，基本上纯的病毒将代表制剂的总蛋白质含量的至少60%、至少 70%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%或更高。
[0069] "经分离"的生物组分（例如病毒、核酸分子、蛋白质或细胞器）已经基本上与出现 或产生这种组分的细胞和/或生物体中的其它生物组分分离或纯化分开。已经"分离"的 病毒和病毒组分（例如蛋白质）包括通过标准纯化方法纯化的病毒和蛋白质。这个术语还 涵盖通过在宿主细胞中重复表达而制备的病毒和病毒组分（例如病毒蛋白质）。
[0070] "抗原"是可以刺激动物中的抗体产生和/或T细胞反应的化合物、组合物或物质， 包括被注射、吸收或以其它方式引入到动物体内的组合物。术语"抗原"包括所有相关的抗 原表位。术语"表位"或"抗原决定簇"指的是B和/或T细胞响应的抗原上的位点。"优势 抗原表位"或"优势表位"是对其作出功能显著的宿主免疫反应，例如抗体反应或T细胞反 应的那些表位。因此，关于针对病原体的保护性免疫反应，优势抗原表位是当被宿主免疫系 统识别时保护免受由病原体引起的疾病影响的那些抗原部分。术语"T细胞表位"指的是当 结合到适当的MHC分子时由T细胞（经由T细胞受体）特异性结合的表位。"B细胞表位" 是由抗体（或B细胞受体分子）特异性结合的表位。抗原还可以影响先天免疫反应。
[0071] "免疫反应"是免疫系统的细胞，如B细胞、T细胞或单核细胞对刺激物作出的反 应。免疫反应可以是B细胞反应，其使得特异性抗体产生，如抗原特异性中和抗体。免疫反 应还可以是T细胞反应，如CD4+反应或CD8+反应。在一些情况下，反应对特定抗原具特异 性（即，"抗原特异性反应"）。免疫反应还可以包括先天反应。如果抗原来源于病原体，那 么抗原特异性反应是"病原体特异性反应"。"保护性免疫反应"是抑制病原体的有害功能 或活性，降低由病原体引起的感染，或减少由病原体引起的感染所致的症状（包括死亡）的 免疫反应。保护性免疫反应可以例如通过在空斑减少分析法或ELISA中和分析法中病毒复 制或空斑形成的抑制，或通过测量对体内病原体攻击的抗性来测量。
[0072] 本文所公开的免疫原性组合物适合于预防、改善和/或治疗由病毒感染引起的疾 病。
[0073] 缩写"KAg"表示杀死的抗原并且代表杀死的或灭活的PRRSV。灭活的PRRSV包含 一种或多种免疫原性PRRS病毒蛋白质并且因此灭活的PRRSV可以被视为杀死的抗原。
[0074] 缩写"NP-KAg"表示纳米粒子-杀死的抗原。这代表经纳米粒子囊封的灭活的 PRRSV0
[0075] 如本文所用的术语"病毒样粒子"或"VLP"指的是非复制的病毒外壳。VLP -般由 一种或多种与病毒表面衣壳结构相关联的病毒蛋白质组成，例如，但在PRRSV的情况下不 限于PRRSV的结构蛋白质GP3、GP4、GP5以及基质蛋白质或其组合。VLP可以在适当表达系 统中重组表达蛋白质后自发地形成。VLP当投予到动物时，可以是免疫原性的并且因此可以 在动物体内引起保护性或治疗性免疫反应。产生VLP的方法在本领域中一般是已知的并且 在下文更全面地讨论。在重组表达病毒蛋白质之后VLP的存在可以使用本领域中已知的常 规技术来检测，例如通过电子显微术、生物物理表征等等。参看例如Baker等人，Biophys. J. (1991) 60:1445-1456 ;Hagensee 等人，J. Virol. (1994)68:4503-4505。举例来说，VLP 可 以通过密度梯度离心来分离和/或通过特征性密度条带来鉴别。
[0076] 尽管阐述本公开的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但特定实例中所阐述的 数值尽可能精确地报道。然而，任何数值固有地含有由其相应的测试测量中所发现的标准 偏差必然引起的某些误差。在本说明书通篇所给出的每个数值范围将包括属于这样的较 宽数值范围内的每个较窄数值范围，如同这样的较窄数值范围在本文中全部明确地写出一 样。
[0077] 另外，在本发明的特征或方面依据马库西组（Markush group)或替代物的其它组 来描述的情况下，本领域的技术人员将认识到，本发明由此还依据马库西组或其它组的任 何个别的成员或成员的子组来描述。
[0078] 组合物
[0079] 当人类或非人类动物受外来生物体/病原体攻击时，受攻击的个体通过发动可以 是保护性的免疫反应来作出响应。这种免疫反应是用先天与后天免疫反应系统的协同相互 作用来表征。
[0080] 先天免疫反应形成针对外来生物体/病原体的防御的第一线。先天免疫反应可以 在感染几分钟内以抗原非依赖性、但病原体依赖性的方式触发。先天的并且确实是自适应 的免疫系统可以通过由存在于大多数宿主细胞上的模式识别受体识别对于微生物来说独 特的病原体相关的分子模式来触发。一旦触发，先天系统即产生炎性反应，这种炎性反应活 化细胞和体液的自适应免疫反应系统。
[0081] 自适应免疫反应经过几天或几周变得有效并且提供了控制并且通常消除外来生 物体/病原体所需的抗原特异性反应。自适应反应是由对病原体显现出特异性的T细胞 (细胞介导的免疫）和B细胞（抗体介导的免疫或体液免疫）来介导。一旦活化，这些细胞 即对同一种病原体具有持久的记忆。
[0082] 个体对外来生物体/病原体产生免疫，从而预防或至少减少受外来生物体/病原 体感染的机会的能力是疾病控制中的强有力的工具并且是接种疫苗背后的原理。
[0083] 疫苗通过使免疫系统准备好对病原体作出反应来发挥功能。典型地，疫苗包含抗 原，其为外来生物体/病原体或由生物体/病原体产生的毒素或其一部分，其以无毒、非感 染性、非致病性的形式被引入到将接种疫苗的受试者的体内。疫苗中的抗原使得受试者的 免疫系统对抗原所来源的生物体/病原体"致敏"或"敏感"。受试者的免疫系统随后暴露 于生物体/病原体或毒素引起快速而稳固的特异性免疫反应，这种免疫反应在生物体/病 原体或毒素可以倍增并且感染或损害宿主生物体中足够多的细胞以导致疾病症状之前控 制或破坏这种生物体/病原体或毒素。
[0084] 在许多情况下，有必要增强对存在于疫苗中的抗原的免疫反应以刺激免疫系统到 足以使得疫苗有效的程度，即，赋予免疫。为此，已经设计出被称为佐剂（或免疫增强剂） 的添加剂，其增强了对疫苗组合物中的抗原的体内免疫反应。
[0085] 佐剂组分相对于由单独的抗原引发的免疫反应可以增加对抗原的免疫反应的强 度和/或持续时间。佐剂组分所需的功能特征是其增强对靶抗原的适当免疫反应的能力。
[0086] 本文描述了用于制备所公开的组合物的组分以及用于本文所公开的方法中的组 合物本身。本文公开了这些和其它材料，并且应了解，当公开了这些材料的组合、亚群、相互 作用、组等时，尽管可能未明确地公开这些化合物的每个不同的个别和集体的组合和排列 的特定参考，但本文中特别涵盖和描述每一者。因此，如果公开了一类分子A、B和C并且公 开了一类分子D、E和F以及组合分子A-D的一个实例，那么即使没有个别地叙述每一者，也 个别地并且集体地涵盖每一者，这意味着组合A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E和C-F被视 为公开的。同样地，也公开了这些的任何亚群或组合。因此，举例来说，A-E、B-F和C-E的 子组应被视为公开的。这个概念适用于本申请的所有方面，包括（但不限于）制造和使用 所公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果存在多种可以进行的额外步骤，那么应了解， 这些额外步骤中的每一者可以与所公开的方法的任何特定的实施方案或实施方案的组合 一起进行。
[0087] 本文描述了包含免疫原性猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV)抗原和纳米粒子的 组合物。
[0088] 本文所描述的组合物、免疫原性组合物和疫苗可以进一步包含一种或多种佐 剂。佐剂可以是改进其它试剂，例如本文所描述的抗原的作用的任何组合物、药理或免疫 剂。佐剂的实例包括（但不限于）分枝杆菌裂解物（包括结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis)全细胞裂解物）、耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis)(包括耻垢分 枝杆菌全细胞裂解物）、霍乱毒素 B亚单位以及大肠杆菌（E. coli)热不稳定突变毒素。佐 剂的其它实例包括进化上保守的分子，所谓的PAMP，其包括脂质体、脂多糖（LPS)、抗原的 分子笼、细胞细胞壁的组分，以及内吞的核酸，如双链RNA (dsRNA)、单链DNA (ssDNA)和含有 未甲基化的CpG二核苷酸的DNA。佐剂的额外实例包括（但不限于）含铝佐剂，其包括抗原 吸附在上面的矿物（或矿物盐，如氢氧化铝、磷酸铝、羟基磷酸铝）的悬浮液。佐剂的额外实 例包括（但不限于）无铝佐剂，其在没有任何这样的铝盐的情况下配制。无铝佐剂包括油 和水乳液，如油包水和水包油（以及其变型，包括双重乳液和可逆乳液）、脂糖、脂多糖、免 疫刺激核酸（如CpG寡核苷酸）、脂质体、Toll样受体激动剂（特别是TLR2、TLR4、TLR7/8 和TLR9激动剂），以及这些组分的各种组合。
[0089] 在一些实施方案中，本文所描述的组合物、免疫原性组合物和疫苗可以进 一步包含结核分枝杆菌全细胞裂解物、耻垢分枝杆菌全细胞裂解物和母牛分枝杆菌 (Mycobacterium vaccae)全细胞裂解物。
[0090] 本文所描述的组合物、免疫原性组合物和疫苗可以包含一种或多种纳米粒子。纳 米粒子（与术语"纳米载体"可互换使用）的实例可以见于例如美国专利申请20100233251 中。纳米载体的实例包括（但不限于）由一种或多种聚合物组成的纳米载体。在一些实施 方案中，一种或多种聚合物是水溶性的、非粘附性的聚合物。在一些实施方案中，聚合物是 聚乙二醇（PEG)或聚氧化乙烯（PEO)。在一些实施方案中，聚合物是聚烷二醇或聚氧化烯。 在一些实施方案中，一种或多种聚合物是可生物降解的聚合物。在一些实施方案中，一种或 多种聚合物是生物相容的聚合物，其为水溶性的、非粘附性的聚合物与可生物降解的聚合 物的偶联物。在一些实施方案中，可生物降解的聚合物是聚乳酸（PLA)、聚（乙醇酸）（PGA) 或聚（乳酸/乙醇酸）（PLGA)。在一些实施方案中，纳米载体由PEG-PLGA聚合物组成。
[0091] 在一些实施方案中，纳米载体通过自组装而形成。自组装指的是以可预测的方式 使用将自身定位的组分形成纳米载体的过程，从而可预测地并且可再现地形成纳米载体。 在一些实施方案中，纳米载体是使用自身相对于彼此定位的两亲生物材料形成，以形成可 预测的尺寸、成分和成分布置的纳米载体。在一些实施方案中，纳米载体是微米粒子、纳米 粒子或皮米粒子。在一些实施方案中，微米粒子、纳米粒子或皮米粒子是自组装的。
[0092] 在一些实施方案中，纳米载体具有正ζ电势。在一些实施方案中，纳米载体在中 性PH下具有净正电荷。在一些实施方案中，纳米载体在其表面处包含一个或多个胺部分。 在一些实施方案中，胺部分是伯胺、仲胺、叔胺或季胺。在一些实施方案中，胺部分是脂族 胺。在一些实施方案中，纳米载体包含含胺聚合物。在一些实施方案中，纳米载体包含含胺 脂质。在一些实施方案中，纳米载体包含在中性pH下带正电荷的蛋白质或肽。在一些实施 方案中，纳米载体是乳胶粒子。在一些实施方案中，在其表面上具有一个或多个胺部分的纳 米载体在中性PH下具有净正电荷。
[0093] 纳米粒子可以帮助递送灭活的PRRSV和/或也可以是免疫原性的。递送可以到达 所关注的特定部位，例如粘膜。在一些实施方案中，纳米粒子可以建立灭活的PRRSV的延时 释放以增强和/或延长免疫反应。在一些实施方案中，纳米粒子与灭活的PRRSV缔合以使 得组合物可以引发免疫反应。缔合可以是例如其中纳米粒子与灭活的PRRSV偶合或偶联。 偶合和偶联意味着纳米粒子与灭活的PRRSV之间存在化学键联。在一些实施方案中，灭活 的PRRSV被包封或囊封在纳米粒子内。在一些实施方案中，灭活的PRRSV通过水/油/水 乳液法被包封在纳米粒子内。在一些实施方案中，纳米粒子是聚（丙交酯-共-乙交酯） (PLGA)。取决于用于聚合的丙交酯与乙交酯的比率，可以获得和利用不同形式的PLGA。这 些形式典型地关于所用的单体的比率加以鉴别（例如，PLGA 75:25鉴别为组合物是75% 乳酸和25%乙醇酸的共聚物）。在本发明中可以使用不同比率，例如90:10、80:20、70:30、 60:40、50:50、40:60、30:70、20:80、10:90,以及高于这些比率和在这些比率之间的数值。适 合的纳米粒子的额外实例包括甲壳素（chitosin)、磷酸钙、各种细菌如大肠杆菌、分枝杆 菌、钩端螺旋体的脂质以及其混合物。在一个实例中，组合物可以通过混合约180mg PLGA与 约5mg灭活的PRRSV (或约36mg PLGA与Img灭活的PRRSV)而得到。灭活的PRRSV的包封 (囊封）效率可以变化。在一个实施方案中，基于包封中所用的总PRRSV蛋白质的量计算， 纳米粒子是50-55%包封/囊封的。经包封的灭活的PRRSV可以作为包封/囊封的抗原与 未包封/未囊封