RRSV特异性血清中和抗体，在DPI 0和21以及 DPC 7和15时收集3到5ml血液样品。将经分离的血清等分并且保持在-20°C下。如早先 所描述（46、12)制备肺匀浆用于细胞因子和病毒评估。
[0178] 分离PBMC、肺MNC和TBLN细胞
[0179] 为了分离PBMC，在酸柠檬酸盐葡萄糖溶液中从施以无痛致死术的猪收集血液，并 且如所描述（47)进行加工。按照所描述的程序（48)从个别的猪中分离肺单核细胞（肺 MNC/LMNC)。使用含有EDTA(0. 03% )的无菌冰冷PBS对气道进行灌洗以收集BAL细胞（49)。 在DMEM中收集气管支气管淋巴结（TBLN)、髂淋巴结（ILN)和扁桃体的样品，并且如先前所 描述（48)分离MNC。
[0180] 病毒滴定和病毒中和测试（VNT)
[0181] 如先前所描述（37)通过间接免疫荧光分析法（IFA)来分析血清中和肺裂解物中 的PRRSV滴度和病毒中和抗体滴度。简单地说，对于病毒滴定，将96孔微量滴定板中的 MARC-145细胞的汇合的单层用血清的10倍稀释液处理48小时。为了测量血清和肺裂解 物中的VN滴度，将样品热灭活，用UV处理，进行两倍稀释，并且在37°C下与等体积的每孔 250TCID50的PRRSV(MN184) -起孵育2小时。将100微升的悬浮液转移到含有MARC-145 细胞的汇合的单层的96孔板中，在37°C下于C02孵育箱中孵育24小时。将细胞用80%丙 酮固定，并且用抗PPRSV N的mAb(SD0W-17)和经Alexa-488偶联的抗小鼠 IgG(H+L)染色。 使用甘油-PBS将板封固，并且在荧光显微镜下检查病毒斑。
[0182] 在肺和血液中的PRRSV特异性同型抗体分析
[0183] 通过ELISA来分析血清和肺裂解物中PRRSV特异性IgA和IgG抗体的存在。简 单地说，在4°C下于碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液（pH 9.6)中用预先滴定量的粗的杀死的 PRRsv(MNlSCAgaoygAil)涂布ELISA板过夜，洗涤，并且在室温下用阻断缓冲液（PBS中 的1 % BSA和0· 1 % Tween 20)处理2小时；添加血清（1:100)和肺裂解物（0· 5mg/ml，w/ v)样品并且在室温下孵育2小时。使用与HRP (KPL)偶联的抗猪IgA和IgG二级抗体检测 经结合的病毒特异性同型抗体。最后，使用发色团TMB使板显色并且在450nm下读取。为 了消除背景活性，还包括非PRRSV特异性抗原涂布的对照板，进行阻断，并且用测试样品并 行地处理。从对照板扣除从实验板获得的OD值。
[0184] PRRSV特异性回忆细胞因子反应
[0185] 如先前所描述（48)在不存在或存在杀死的粗PRRSV MN184Ag(50μg/ml)的情况 下使五百万个猪PBMC、TBLN MNC和肺MNC经受离体再刺激，并且分析所收集的上清液以测 量细胞因子。从对应的测试值扣除由不存在PRRSV Ag的情况下培养的免疫细胞分泌的细 胞因子。
[0186] 细胞因子反应的分析和免疫细胞的流式细胞计数分析
[0187] 通过ELISA (48)来分析血清样品、所收集的培养上清液和肺裂解物的Thl (IFN-γ 和IL-12)、Th2(IL-4)、促炎性（IL-6)和免疫抑制性（IL-10和TGF-β )细胞因子。将存 在于肺裂解物中的细胞因子的量标准化为皮克/克肺组织。如先前所描述（48)通过多色 免疫分析法进行流式细胞计数分析以测定不同免疫细胞的表型和频率。简单地说，使用 FACS Aria II (BD Biosciences)流式细胞计数器撷取经免疫染色的细胞的50, 000个事 件并且使用FlowJo软件（Tree Star, Inc.)分析。完成分析以基于下列表型来确定不同 的免疫细胞群体：NK细胞富含部分（CD3-CD4-CD8+) ;T辅助细胞（CD3+CD4+CD8-) ;CD8+T 细胞（CD3+CD4-CD8+] ;T 辅助 / 记忆细胞（CD3+CD4+CD8+) ; γ δ T 细胞（CD8+TcRlN4+); T调控细胞（⑶4+⑶25+Foxp3+);骨髓细胞（⑶172+);以及树突状细胞富含部分 (CD172+CD11C+SLAII+)〇
[0188] 统计分析
[0189] 所有数据都表示为三只猪的平均值+/-SEM。使用GraphPad InStat (软件版本 5.0)，使用单因子变异数分析（ANOVA)继之以事后图基氏检验来进行统计分析以确立K-Ag 与Nano-KAg猪组之间的差异。统计显著性被评定为P〈0. 05。
[0190] 结果
[0191] 包封PRRSV的纳米粒子的体外表征
[0192] 通过扫描电子显微术（SEM)来测定假的以及包封PRRSV Ag的PLGA纳米粒子的形 态，其揭示了粒子的尺寸为200-600nm(图7A)。纳米粒子中的平均蛋白质含量或核心负荷 是0.50-0. 55% (w/w)，其代表了 50-55%的囊封效率。Nano-KAg再分散于PBS中之后，在 最初的48小时内缓慢释放PRRSV蛋白质，之后在接下来的5周观测到逐步释放型态。
[0193] 使用从三只健康的SPF猪收集的BAL-MNC来研宄APC对Nano-KAg的吸收。共焦图 像揭示了 APC优先吸收Nano-KAg，而不是未包封的病毒Ag(K-Ag)，并且受PRRSV感染的细 胞充当阳性对照（图7B)。包裹的纳米粒子将PRRSV Ag递送到早期核内体并且其可比得上 受病毒感染的对照（图7C和D)。此外，如相较于经K-Ag处理的细胞，⑶80/86在APC上显 著增加的表达所指示，包裹Nano-KAg的APC经历了成熟（图7E)。另外，57 %的经Nano-KAg 处理的BAL-MNC对PRRSV蛋白质呈阳性，这可比得上受病毒感染的细胞（图7F ii和iv)。 相比之下，仅9%的经K-Ag处理的BAL-MNC对病毒蛋白质呈阳性（图7F iii)。结果显示， 在纳米粒子中递送的PRRSV Ag被APC吞噬并且在核内体内发现所释放的蛋白质。
[0194] 包封PRRSV Ag的纳米粒子（Nano-KAg)作为候选疫苗的潜力
[0195] 在攻击前研宄中，Nano-KAg的鼻内递送将会诱导粘膜和全身部位处的先天免疫反 应，这由NK细胞、DC和γ δ T细胞的频率显著增加来指示。另外，免疫的自适应臂中所涉及 的免疫细胞，如Th/记忆细胞和CD8+T细胞，相较于经K-Ag免疫的猪在Nano-KAg的肺中显 著增加（图8A-E)。类似地，经Nano-KAg接种疫苗的猪的PBMC显示了 γ δ T细胞和DC的 频率显著增加（图8Η和I)。令人感兴趣的是，经K-Ag接种疫苗的猪的肺中NK细胞和Th/ 记忆细胞的频率下降（图8A和D)。此外，来自经Nano-KAg免疫的猪的肺MNC和PBMC分 泌显著降低的水平的细胞因子IL-10,并且在回忆反应中分泌更高量的IL-6(图8F、G、J)。 另外，在经Nano-KAg而不是K-Ag免疫的猪中分泌先天细胞因子IFN-α (图8K)。
[0196] 经Nano-KAg接种疫苗的猪中肺病变和病毒负荷的显著减少
[0197] 最初，在猪体内使用每只猪0.2和Img的剂量（约IXlO6和5X10 6TCID50的灭活 的病毒）进行针对Nano-KAg候选疫苗的剂量依赖性反应，并且在Img的剂量下检测到明显 的免疫反应。因此，以每只猪Img的剂量进行所有后续试验。在攻击后研宄中，经Nano-KAg 免疫的、经MN184攻击的猪在临床上是健康的，没有发热或呼吸窘迫。相比之下，K-Ag和未 接种疫苗的、经MN184病毒攻击的猪在攻击后的第一周期间有发热，伴有米食量减少。在尸 检期间，相较于另两个经病毒攻击的组，在经Nano-KAg免疫的组中观测到显著减少的大体 肺损伤（图9C)。未接种疫苗和经K-Ag接种疫苗的、经丽184攻击的猪的经H&E染色的肺 切片的显微镜检查显示有严重的肺损伤，伴有单核细胞的大规模浸润和大的受感染区域。 相比之下，在经Nano-KAg免疫的、经病毒攻击的猪中观测到显著减少的肺损伤（图9A)。
[0198] 免疫组织化学分析已经揭示了相较于Nano-KAg猪组，未接种疫苗和经K-Ag免疫 的、经丽184病毒攻击的猪的肺切片中大量的灭活的PRRSV阳性细胞（图IOB和D)。血清 样品和肺匀浆中的PRRSV病毒滴度已经指示了相较于经K-Ag接种疫苗和未接种疫苗的猪， 在经Nano-KAg接种疫苗的猪中，在攻击后（DPC或PC) 7天病毒负荷减少超过1个对数并且 截止DPC 15病毒完全清除（图9E)。经K-Ag接种疫苗的猪也比未接种疫苗的猪更好地清 除病毒血症（图9E)。类似地，相较于经K-Ag免疫的、经MN184病毒攻击的猪，在Nano-KAg 中也减少了肺中的PRRSV负荷（图9F)。而且，相较于对照猪，在经Nano-KAg免疫的猪中血 清和肺匀浆中的PRRSV滴度值（TCID50/ml)显示出降低。
[0199] 血清、肺和鼻拭子中的体液免疫反应
[0200] 相较于未接种疫苗或经K-Ag免疫的、经MN184攻击的猪，经Nano-KAg免疫的猪的 肺匀浆含有显著更高的水平的经分泌的病毒特异性IgA和IgG抗体（图IOA和B)。相较于 未接种疫苗或经K-Ag免疫的、经MN184攻击的猪，检测到在经Nano-KAg免疫的猪的血清样 品中在PC 0时IgA抗体水平增加，并且在PC 15时显著增加（图10D)。在DPC 15时，相较 于经K-Ag免疫的猪，在经Nano-KAg免疫的猪中，血清中的PRRSV特异性IgG抗体水平（图 10E)以及鼻拭子中的IgA和IgG水平（图IOG和H)显著更高。尽管在DPC 15时检测到肺 和血清中增加的PRRSV特异性中和抗体（VN)滴度，但数据不是统计显著的（图IOC和F)。
[0201] 基于纳米粒子的PRRSV疫苗显示出在猪体内增强的先天免疫反应
[0202] 接受Nano-KAg疫苗的、经丽184病毒攻击的猪的肺中具有显著增加的先天IFN-α 产生（图11Α)。相较于模拟的猪，在经K-Ag免疫、经病毒攻击的猪中检测到NK细胞频率 下降四倍；相比之下，在经Nano-KAg疫苗接种的猪中NK细胞群体可比得上模拟的猪（图 11Β)。此外，在未接种疫苗和经K-Ag免疫的、经ΜΝ184病毒攻击的猪中完全抑制肺NK细胞 的细胞毒性功能；然而，在接受Nano-KAg的猪中部分降低（图11C)。相较于K-Ag和未接 种疫苗的、经病毒攻击的猪，在经Nano-KAg接种疫苗的动物的肺中γ δ T细胞和CD4+(而 不是CD8+)T细胞的频率显著增加（图IlDE和F)。观测到在经Nano-KAg免疫的猪的周边 血液中DC的频率显著增加，以及在TBLN中DC和γ δ T细胞的频率显著增加（表1)。
[0203] 表1示出了未接种疫苗或用K-Ag或Nano-KAg经鼻内接种疫苗一次并用PRRSV病 毒株ΜΝ184攻击并且在DPC 15时施以无痛致死术的猪。通过流式细胞计数法来计算存在 于PBMC和TBLN MNC中的不同免疫细胞亚群。a门控⑶172+细胞以计算⑶Ilc和SLAII表 达，并且示出了 DC富含部分（⑶172+⑶Ilc+SLAir)的百分比。b门控⑶3 _细胞以计算⑶4 和⑶8 α表达，并且示出了 NK细胞富含部分（⑶3_CD4TD8a+)的百分比。。门控⑶25+细胞 以计算⑶4和Foxp3表达，并且示出了⑶4+⑶25+Foxp3 +细胞的百分比。每个数值是来自三 只猪的平均百分比+/-SEM。星号代表了接受Nano-KAg与接受K-Ag的猪组之间的统计显著 差异（p〈0. 05)。
[0204] 表1.经Nano-KAg接种疫苗的猪的PBMC和TBLN中免疫细胞的频率
[0205]
【主权项】
1. 一种组合物，其包含灭活的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV)和纳米粒子。
2. 如权利要求1所述的组合物，其进一步包含佐剂。
3. 如权利要求2所述的组合物，其中所述佐剂是分枝杆菌裂解物。
4. 如权利要求2或3中任一项所述的组合物，其中所述佐剂是结核分枝杆菌全细胞裂 解物。
5. 如权利要求2所述的组合物，其中所述佐剂是选自由以下组成的组：耻垢分枝杆菌 全细胞裂解物、霍乱毒素B亚单位和大肠杆菌热不稳定突变毒素。
6. 如权利要求1所述的组合物，其中所述纳米粒子是免疫原性的。
7. 如权利要求1到6中任一项所述的组合物，其中所述纳米粒子与所述灭活的PRRSV 缔合。
8. 如权利要求1到6中任一项所述的组合物，其中所述纳米粒子与所述灭活的PRRSV 偶联。
9. 如权利要求1到6中任一项所述的组合物，其中所述灭活的PRRSV被包封在所述纳 米粒子内。
10. 如权利要求1到9中任一项所述的组合物，其中所述灭活的PRRSV通过水/油/水 乳液法被包封在所述纳米粒子内。
11. 如权利要求1到10中任一项所述的组合物，其中所述纳米粒子是聚（丙交 酯-共-乙交酯）（PLGA)。
12. 如权利要求11所述的组合物，其中所述PLGA是50/50PLGA。
13. 如权利要求1到10中任一项所述的组合物，其中所述纳米粒子是选自由以下组成 的组：甲壳素、磷酸钙、各种细菌如大肠杆菌、分枝杆菌、钩端螺旋体的脂质以及其混合物。
14. 如权利要求1到12中任一项所述的组合物，其比率为约180mgPLGA比约5mg灭活 的PRRSV。
15. 如权利要求1到14中任一项所述的组合物，其中所述灭活的PRRSV是PRRSV的 丽184病毒株。
16. 如权利要求1到15中任一项所述的组合物，其中所述灭活的PRRSV是用UV光灭 活。
17. -种疫苗，其包含于载体中的如权利要求1到16中任一项所述的组合物。
18. -种引发猪体内针对PRRSV的免疫反应的方法，其包括向所述猪投予如权利要求1 到16中任一项所述的组合物或如权利要求17所述的疫苗。
19. 如权利要求18所述的方法，其中所述免疫反应是针对PRRSV感染的保护。
20. -种减少猪的繁殖或呼吸衰竭的方法，其包括以下步骤： b. 提供如权利要求1到16中任一项所述的组合物或如权利要求17所述的疫苗；以及 c. 将所述组合物或疫苗投予到猪。
21. -种刺激猪体内的免疫反应的方法，其包括：向所述猪投予如权利要求1到16中 任一项所述的组合物或如权利要求17所述的疫苗。
22. 如权利要求18到21中任一项所述的方法，其中所述组合物或疫苗是以介于 IOOug/猪与500ug/猪之间的剂量投予。
23. 如权利要求18到21中任一项所述的方法，其中所述组合物或疫苗是以单次剂量投 予。
24. 如权利要求18到21中任一项所述的方法，其中所述疫苗是以两次剂量投予。
25. 如权利要求24所述的方法，其中所述两次剂量是以约两周的时间间隔投予。
26. 如权利要求18到25中任一项所述的方法，其中所述组合物或疫苗经鼻内投予。
【专利摘要】本文公开了用于治疗或预防受试者的猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)感染的方法和组合物。本文描述了包含免疫原性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗原和纳米粒子的组合物。本文所描述的组合物、免疫原性组合物和疫苗可以进一步包含一种或多种佐剂。佐剂可以是改进其它试剂，例如本文所描述的抗原的作用的任何组合物、药理或免疫剂。在一些实施方案中，本文所描述的组合物、免疫原性组合物和疫苗可以进一步包含结核分枝杆菌全细胞裂解物、耻垢分枝杆菌全细胞裂解物和母牛分枝杆菌全细胞裂解物。
【IPC分类】A61K39-12
【公开号】CN104797269
【申请号】CN201380033324
【发明人】R·J·高拉普拉, V·德维夫蒂, C·马尼凯姆, R·帕特森
【申请人】俄亥俄州国家创新基金会
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2013年4月24日
【公告号】CA2871786A1, EP2841097A1, US9005665, US20140004193, US20150265696, WO2013163337A1