专利名称：猪口蹄疫重组免疫复合肽的制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及猪口蹄疫重组免疫复合肽的制备方法及应用，属于生物技术制药工业中 的基因工程生产免疫佐剂的技术领域。
背景技术：
口蹄疫(foot-and-mouth disease ， FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus ， FMDV)引起的烈性传染病，主要感染偶蹄目动物。除动物死亡造成直接经济损失外，动 物在患病期间肉和奶的生产停止导致该地区甚至该国家的畜产品进出口贸易停止，也造 成巨大的经济损失。因此，世界各国都很重视本病的防制。
FMDV感染机体产生中和性抗体需要B细胞和T细胞的参与，感染FMDV的小鼠 血清中既存在T细胞依赖性IgGl和IgG2，也存在非T细胞依赖性IgG3，表明T细胞 在FMDV的抗原构成和免疫应答中起重要的作用。FMDV的VP1 G-H环内有诱导生成 B细胞的位点，也有激发产生Th细胞的位点。试验发现在VP1的41 209氨基酸残基 位上至少存在11个不同的T细胞表位。含有T细胞表位的多肽能增强Th细胞的活性， 并同时协同诱导机体产生抗病毒抗体。含有Asia I型FMDV的B细胞和T细胞表位的 融合蛋白能引起豚鼠免疫反应，该融合表位为抗Asial型FMDV提供了选择。
疫苗是控制FMD的最有效措施，FMD弱毒疫苗和灭活疫苗等常规疫苗都具有良好 的免疫原性，在预防和控制FMD的过程中发挥着重要作用，但在灭活疫苗的生产、使用 过程中有诱发FMD的危险，这促使基因工程疫苗逐渐成为FMD疫苗研究的热点。但基 因工程疫苗在诱导机体免疫反应方面还存在一些不尽如人意之处，因此，研究者试图从 多方面增强FMD疫苗的免疫效果。法氏囊(bursaofFabricus,BF)是禽类重要的中枢免 疫器官，法氏囊超滤物(1KD以下)中含有许多生物活性物质，特别是一些小肽对禽类 具有免疫调节功能，能促进禽类、哺乳动物细胞的分化发育，促进免疫器官的成熟。其 中的囊素三肽(K-H-G)作为BF组织中活性成分的重要组成部分不仅对禽类具有免疫调节 功能，而且对哺乳动物及人类淋巴细胞也具有明显的免疫学及生理学活性。由于天然的 BS只能从鸡的法氏囊组织中提取，来源受到很大的限制，而且其它杂蛋白含量高,纯化 难度大，其实际效果也受到很大程度的影响。化学合成的BS成本高，不适合田间推广。 因此利用基因工程技术,体外大量表达BS活性肽，将可能使BS作为一种有效的免疫增 强剂而得到最为广泛的应用。
本发明为制备重组的猪口蹄疫免疫复合肽提供了切实可行的技术路线，按本方法制 备的猪口蹄疫重组免疫复合肽可作为猪口蹄疫疫苗新型的基因工程多肽疫苗佐剂。
发明内容
技术问题本发明的目的在于研制出具有良好免疫效果的基因工程多肽，为临床上
的猪口蹄疫防治提供一个合适的免疫佐剂。同时提供一种以大肠杆菌为宿主的基因工程 免疫多肽的制备方法。本发明还涉及基因工程猪口蹄疫免疫复合肽在猪口蹄疫防治中的 应用。
技术方案
1) 本发明技术要点之一提供一种基因工程猪口蹄疫免疫复合肽及其基因
猪口蹄疫重组免疫复合肽基因其特征是由猪口蹄疫辅助性T细胞表位基因和双拷 贝的囊素模拟肽基因通过柔性Linker (G-G-G-S)基因串联而成连接，并在5'端加有肠 激酶识别位点基因序列。该串联基因推导的氨基酸多肽为猪口蹄疫重组免疫复合肽。该 猪口蹄疫重组免疫复合肽其特征在于将T细胞表位多肽和囊素模拟肽串联而成。 一方 面，T细胞表位多肽能增强Thl细胞的活性，并同时协同诱导机体产生抗口蹄疫病毒抗 体。同时，囊素模拟肽能促进B细胞的分化成熟，诱导抗体生成。二者通过柔性氨基酸 连接，在保持独立的空间结构的同时能有效发挥各自的生物学功能。5'端加有肠激酶识 别位点序列，能在该酶的作用下，可获得保持天然N端的猪口蹄疫重组免疫复合肽。
2) 本发明技术要点之二提供了一种能高效表达猪口蹄疫重组免疫复合肽的基因工程菌 的构建方法
为生产成本低的猪口蹄疫重组免疫复合肽，须构建一种高效表达猪口蹄疫重组免疫 复合肽，即能生产猪口蹄疫重组免疫复合肽的基因工程菌，本发明基因工程菌是携带重 组载体的大肠杆菌BL21(DE3)，重组载体是含有猪口蹄疫重组免疫复合肽基因的pET32a载体。
3) 本发明技术要点之三提供一种可溶性的基因工程猪口蹄疫免疫复合肽制备方法
技术领域：
本发明选用大肠杆菌表达系统，pET32a载体以T7启动子，在IPTG诱导下能高效 表达外源基因。将猪口蹄疫重组免疫复合肽棊因插入硫氧还蛋白(TRX)基因C端，利用 硫氧还蛋白分子伴侣作用，获得了可溶性的基因工程猪口蹄疫免疫复合肽融合蛋白。该 融合蛋白，首先经Ni柱亲和层析纯化后，再通过N端带有His标签的肠激酶酶切去除 硫氧还蛋白，可获得保持天然N端的猪口蹄疫重组免疫复合肽。再次进行亲和层析，收 集穿透峰，冷冻干燥，得到纯度极高的猪口蹄疫重组免疫复合肽。
4) 本发明技术要点之四提供了基因工程猪口蹄疫免疫复合肽的应用 本发明利用小鼠动物模型，将猪口蹄疫免疫复合肽配合猪口蹄疫灭活疫苗使用。通
过免疫小鼠的抗体和抗体亚型、脾淋巴细胞增殖、血清中IL-4和IFN-Y的测定。评
价基因工程猪口蹄疫免疫复合肽的免疫佐剂效果。
为实现以上技术要点，下面详细介绍本发明的技术方案
一种高效表达猪口蹄疫重组免疫复合肽的基因工程菌株，其构建包括以下步骤
1)猪口蹄疫重组免疫复合肽基因SEQ.ID.NCU的重叠PCR(SOE)扩增。设计了三条 PCR引物
引物F1， SEQ.ID.N0.2:
GAAATTAAAGGCGTG-3' 引物F2， SEQ.ID.N0.3:
ACGCCTTTAATTTCG-3' 引物F3， SEQ.ID.NO.4:
GGCTAAGTCGACTCG-3,扁
PCR反应体系50^1:10xPCRBuffer, 5ML,MgCl2， 3pL ; dNTP， 10mmol/L， lpL;引 物F1 、 F2禾Q引物F2，终浓度为20pmol/L各2pL; TaKaRa ExTaq 0.5^L;灭菌超纯水， 34单；
PCR反应条件94。C预变性2min,进入TD-PCR循环:94t:30s,退火温度从55。C,每循 环lrnin，共30个循环;72X:延伸6min，经过胶回收后获得猪口蹄疫重组免疫复合肽基因；
2) 高效表达权利要求1所述猪口蹄疫重组免疫复合肽基因的基因工程菌株的构建 上述猪口蹄疫重组免疫复合肽基因PCR产物和pET32a均用五coi I、5WI双酶切,T4 DNA Ligase连接，连接产物转化E.coli DH5a,重组表达质粒进行和Sa/1双酶切鉴定； 酶切鉴定为阳性的质粒测序，命名为pET32a—KCMP;
3) 采用CaCl2转化法，将重组质粒pET32a-KCMP转化进入大肠杆菌BL21 (DE3)
中，筛选阳性克隆。
可溶性的基因工程猪口蹄疫免疫复合肽制备方法，包括以下步骤
1)猪口蹄疫重组免疫复合肽的表达
挑取基因工程菌单菌落接种到盛有3 ml LB液体培养基(50pg/ml氮苄青霉素)试 管中，于37'C振摇培养过夜，第二天从中取出一定量的菌体加到另一盛有3 mlLB液 体培养基中，使菌体浓度达到OD6oo"0.1， 37 'C振摇培养2~4小时，当菌体浓度 OD6()()"0.4-0.6时，加入终浓度为1 mM的IPTG进行诱导表达4 6 h，每隔1小时收集 100pL菌液。4000 rpm，离心10min，收集菌体，将收集的菌体用100 nLPBS重悬后， 加等体积的2xSDS凝胶加样缓冲液(100 mmol/L Tris，Cl(pH6.8); 200 mmol/L 二硫苏糖 醇(DTT); 4。/。SDS(电泳级)；0.2%溴酚蓝；20°/。甘油)，100'C煮沸5min以使蛋白质变 形，取10nL加样进行SDS-PAGE凝胶电泳。
2)猪口蹄疫重组免疫复合肽融合蛋白的纯化
将诱导表达的菌液于12 000 rmp离心lOmin收获沉淀，以洗涤液(5 mM咪唑，0.5 MNaCl， 20mMTris-HCl， pH7.9)重悬菌体，后经超声波裂解10 min，随后12 000rmp 离心10 min收获包涵体沉淀和上清，经SDS-PAGE电泳鉴定表达产物主要以可溶性表 达。将此上清用Ni-NTA亲合层析柱进行纯化。3)肠激酶酶切猪口蹄疫重组免疫复合肽及纯化 再通过N端带有His标签的肠激酶切去除硫氧还蛋白，可获得保持天然N端的猪口 蹄疫重组免疫复合肽。再次进行亲和层析，收集穿透峰，将纯化的蛋白用PBS进行透析， 得到纯度极高的猪口蹄疫重组免疫复合肽。并在GeneQuant pro RNA/DNA Calculator 定量后冷冻干燥。
基因工程猪口蹄疫免疫复合肽的应用，包括以下步骤利用小鼠动物模型，将猪口蹄疫 免疫复合肽配合猪灭活疫苗使用。通过免疫小鼠的抗体和抗体亚型、脾淋巴细胞增殖、 血清中IL-4和IFN-Y的测定。评价基因工程猪口蹄疫免疫复合肽的免疫佐剂效果。 有益效果
1提高猪口蹄疫疫苗免疫效果
本发明应用猪口蹄疫重组免疫复合肽作为分子佐剂，将猪口蹄疫辅助性T细胞表 位和双拷贝的囊素模拟肽通过柔性Linker (G-G-G-S)融合形成新型的猪口蹄疫重组免 疫复合肽，可以增强猪口蹄疫灭活疫苗的免疫原性，将猪口蹄疫重组免疫复合肽配合 猪口蹄疫灭活疫苗联合免疫BALB/c小鼠后，.其体液免疫和细胞免疫都比单独的猪口 蹄疫灭活疫苗免疫效果好，并且无任何过敏反应。 2易于实现大量生产
本发明在使用猪口蹄疫重组免疫复合肽作为分子佐剂时选择原核表达载体，其 优点在于技术简单，成本低，产量高，纯化工艺简单，易于实现大量生产。
图1猪口蹄疫免疫复合肽的表达设计图
图2猪口蹄疫免疫复合肽的基因PCR扩增及重组表达载体鉴定图
M. DL2000 Marker; 1, 3 5coi I和5W I双酶切鉴定阳性质粒；2猪口蹄疫免疫复合肽的 基因PCR扩增
图3猪口蹄疫免疫复合肽融合蛋白纯化的SDS-PAGE分析，产物
M.蛋白Marker; 1， 2， 3猪口蹄疫免疫复合肽融合蛋白纯化的收集峰
图4猪口蹄疫免疫复合肽Tricine-SDS-PAGE'
Ml、 M2.蛋白Marker; 1， 2， 3猪口蹄疫免疫复合肽纯化的收集峰 图5淋巴细胞增殖(MTT)分析
1:PBS组2:灭活疫苗组3:灭活疫苗+猪口蹄疫重组免疫复合肽组
图6 口蹄疫病毒抗体和抗体亚型检测
图7小鼠血清中细胞因子的含量 ，
A: IFN-Y含量1: PBS组2:灭活疫苗组3:灭活疫苗+猪口蹄疫重组免疫复合肽组 B: IL-4含量1: PBS组2:灭活疫苗组3:灭活疫苗+猪口蹄疫重组免疫复合肽组
具体实施例方式
1猪口蹄疫重组免疫复合肽基因的重叠PCR(SOE)扩增根据大肠杆菌偏嗜密码子设计猪口蹄疫重组免疫复合肽基因，分别在引物F1加上五co/ I 酶切位点、引物F3中加上终止密码子和5WI酶切位点。猪口蹄疫重组免疫复合肽的表 达设计图见(图1)
引物F1， SEQ.ID.N0.2:
GAAATTAAAGGCGTG-3'五coi I 引物F2， SEQ.ID.NO.3:
ACGCCTTTAATTTCG-3' 引物F3， SEQ.ID.N0.4:
GGCTAAGTCGACTCG-3' &/I
引物由上海Invitrongen公司合成
PCR反应体系50^1:10xPCRBuffer, 5nL，MgCl2， 3pL ; dNTP， 10mmol/L， lpL; 引物F1 、 F2和引物F2，终浓度为20pmol/L各2pL; TaKaRa ExTaq 0.5pL;灭菌超 纯水，34.5pL;
PCR反应条件9fC预变性2min，进入TD-PCR循环:94"C30s,退火温度从55'C,每循 环lmin,共30个循环;72t;延伸10min， PCR产物经含有溴化乙锭(Ethidium Bromide, EB) 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切下目的条带，随后按胶回收试剂盒(大连TaKaRa 公司)使用说明进行回收，并对回收产物进行电泳鉴定约144bp大小片段即为猪口蹄疫 重组免疫复合肽基因(图2)，对基因序列测定后，推导其编码的猪口蹄疫重组免疫复合 肽为48个氨基酸。
2猪口蹄疫重组免疫复合肽基因的基因工程菌株构建
用￡coR I ， I对猪口蹄疫重组免疫复合肽基因和质粒载体pET-32a进行双酶切, 并置于37 "C水浴作用2 h，酶切产物同样经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，胶回收试剂盒 进行回收鉴定。经过酶切的猪口蹄疫重组免疫复合肽基因和pET-32a载体按1: 3的摩 尔比4。C过夜连接。取连接产物加入含有100nL感受态DH5a的聚丙烯离心管中，轻轻 混匀后冰浴30min。将聚丙烯离心管从冰中取出后42。C热休克90sec，然后立即冰浴2 min。加入800 pL37 。C预热的LB培养基，于37。C振摇(100 150rpm) 45 min。取100 pL菌液均匀涂布含氨苄青霉素(Amp) 50吗/ml的琼脂LB平板，在37 'C正置20 min后， 倒置培养16~20 h。按《分子克隆实验指南》上的碱裂解法提取质粒。对提取质粒进行 五ca I和I双酶切鉴定。以酶切出现144bp左右大小DNA片段的质粒为阳性质粒(图 2)。并将阳性质粒命名为pET32a-KCMP。送上海Invitrongen公司测序。采用CaCl2转 化法，将重组质粒pET32a-KCMP转化进入大肠杆菌BL21 (DE3)中，筛选阳性克隆，
即为基因工程菌株。
3猪口蹄疫重组免疫复合肽的表达
挑取基因工程菌株单菌落接种到盛有3 ml LB液体培养基(50 pg/ml氨苄青霉素) 试管中，于37 'C振摇培养过夜，第二天从中取出一定量的菌体加到另一盛有3 ml LB 液体培养基中，使菌体浓度达到OD6W)"0.1， 37 r振摇培养2~4小时，当菌体浓度 OD,"0.4-0.6时，加入终浓度为1 mM的IPTG进行诱导表达4~6 h，每隔1小时收集 lOO[iL菌液。4000rpm，离心10min，收集菌体，将收集的菌体用100 ^LPBS重悬后， 加等体积的2xSDS凝胶加样缓冲液(100 mmol/L Tris《l(pH6.8); 200 mmol/L 二硫苏糖 醇(DTT); 4。/。SDS(电泳级)；0.2%溴酚蓝；20%甘油)，100。C煮沸5min以使蛋白质变 形，取10 加样进行SDS-PAGE凝胶电泳，SDS-PAGE电泳凝胶的配制及电泳条件参 照分子克隆手册。
将上述液体混匀后覆盖在分离胶之上，随后插入梳子，于室温下放置10 min待胶 凝固后，拔去梳子，向电泳槽内倒入Tris-甘氨酸电泳缓冲液(25 mmol/LTris; 250 mmol/L 甘氨酸(电泳级)(pH8.3); 0.1% SDS)，加样结束后接通电源。电源负极端接上槽，正极 端接下槽。在浓縮胶中电压为80V，进入分离胶中电压调整为120V。直到样品到达分 离胶底部后关闭电源，取出凝胶，用考马斯亮蓝染色lh，随后在脱色摇床上脱色1-2h， 观察结果。
4猪口蹄疫重组免疫复合肽融合蛋白的纯化'
将诱导表达的菌液于12 000 rmp离心10 min收获沉淀，以洗涤液(5 mM咪唑，0.5 MNaCl， 20mMTris-HCl， pH7.9)重悬菌体，后经超声波裂解10 min，随后12 000rmp 离心10 min收获包涵体沉淀和上清，经SDS-PAGE电泳鉴定表达产物主要以可溶性表 达。将此上清用蛋白质Ni柱亲和层析进行纯化，具体操作过程如下；
将树脂摇匀后，向柱子里加入5.0ml树脂悬液，置于室温下使其自然沉降，确保柱 床体积为2.5 ml，随后分别加入3倍体积得纯水、5倍体积lxCharge buffer、 3倍体积 lxBinding buffer。当lxBinding buffer流到柱床底部时，向柱子里加入表达产物，控制 流速，以每小时25 ml的流量过柱，确保蛋白能充分地结合到柱子上。接着加入25ml lxBingding buffer进行洗涤，随后用15 ml lxWash buffer洗涤，最终用15ml的lxElute buffer洗脱蛋白，即得到猪口蹄疫重组免疫复合肽融合蛋白的纯化产物，分子量约 26KDa。该融合蛋白在猪口蹄疫重组免疫复合肽N端连有硫氧还蛋白。(图3)。 5肠激酶酶切猪口蹄疫重组免疫复合肽及纯化
再通过N端带有His标签的肠激酶切去除硫氧还蛋白，可获得保持天然N端的猪 口蹄疫重组免疫复合肽。再次进行Ni柱亲和层析，收集穿透峰，将纯化的蛋白用PBS 进行透析，得到纯度极高分子量约6KDa的猪口蹄疫重组免疫复合肽(图4)。并在 GeneQuant pro RNA/DNA Calculator定量后冷冻干燥。 6免疫小鼠
用上述纯度极高分子量约6KDa的猪口蹄疫重组免疫复合肽，配合猪口蹄疫疫苗联 合免疫，评价其免疫增强效果。6周龄雌性BALB/c小鼠分为3组(灭活疫苗组、灭活 疫苗+猪口蹄疫重组免疫复合肽组、PBS对照组)，每组10只，猪口蹄疫重组免疫复合 肽所用剂量为20ug/鼠。采用腹膜内注射，间隔两周免疫一次，共免疫三次。并且最后 一次免疫一周尾静脉采血。检测口蹄疫病毒抗体和抗体亚型以及血清中il-4和ifn-y 的含量。同时分离脾脏淋巴细胞检测脾淋巴细胞增殖。O型FMD灭活疫苗为中牧股份 兰州生物药厂产品。 7四甲基偶氮唑蓝法(MTT)
单独灭活疫苗免疫的小鼠组0D570平均值为0. 46±0. 032b，灭活疫苗+猪口蹄疫重组 免疫复合肽组为0.72土0.012 PBS组为O. 15±0.033、这三组经统计学分析，灭活疫苗 +猪口蹄疫重组免疫复合肽组和单独灭活疫苗组差异显著(P<0.05)，这一结果表明灭 活疫苗+猪口蹄疫重组免疫复合肽组淋巴细胞增殖强于单独灭活疫苗组(图5)。
8 口蹄疫病毒抗体和抗体亚型检测
IgG亚型检测结果表明常规灭活疫苗主要诱导IgGl的产生，而灭活疫苗+猪口蹄疫重 组免疫复合肽组不但能诱导高水平IgGl的产生，而且诱导IgG2a的产生的能力好于灭活 苗。灭活疫苗和猪口蹄疫重组免疫复合肽二者联合免疫后诱导小鼠的抗体分泌水平强于 灭活疫苗单独免疫(图6) 。 ■
9 血清中il-4和ifn-y的测定
应用定量ELISA对血清中的IL-4和IFN-Y进行定量分析发现灭活苗主要诱导IL-4的分 泌，免疫复合肽组但是加入免疫复合肽组诱导IFN-Y的分泌明显高于灭活苗组。如图7。<110>南京农业大学
<120〉猪口蹄疫重组免疫复合肽的制备方法及应用
<130>说明书
<140> 00
<141> 2008-09-18
<160> 5
<170> Patentln version 3.1
<210〉 1
<211〉 147
<212> DNA
〈213〉人工合成
<220>
<221〉猪口蹄疫重组免疫复合肽的基因
<222〉 (1)..(147) <223〉
<400> 1
ggcggcggcg gcagcgatga tgeitgataaa attagcatta gcga組taa aggcgtgatt 60 gtgcata肌a ttga肌ccat tctgtttggc ggcggcggca gcaccccgaa cctgaaacat 120 ggcaccccga acctgaaaca tggctaa 147
<210> 2
<211> 66
<212〉 DNA <213>人工合成 <220>
<221> 引物F1
<222> (l)..卿 <223>
<400> 2
ccggaattcg gcggcggcgg cagcgatgat gatgataaaa t;agcattag cgaaattaaa 60
ggcgtg
<210〉3
<211>66
〈212>DNA
<213>人工合成
〈220〉
〈221〉引物F2
〈222〉(1)…(66)
<223>
<400>3
ggggtgctgc cgccgccgcc aaacagaatg gtttcaattt tatgcacaat cacgccttta GO
atttcg
<210〉4
〈211>65
<212〉DNA
<213>人工合成
<220〉
<221>引物F3
<222>(1)…(65)
〈223><400> 4
gcggcggcag caccccgaac ctgaaacatg gcaccccgaa cctgaaacat ggctaagtcg 60 actcg 65 <210> 5 <211> 48 <212〉 PRT <213>人工合成 〈220〉
<221>猪口蹄疫重组免疫复合肽 <222> (1)..(48) <223〉 <400〉 5
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Asp Asp Asp Lys lie Ser lie 1 5 10
Lys Gly Val lie Val His Lys lie Glu Thr lie Leu Phe
20 25 Gly Ser Thr Pro Asn Leu Lys His Gly Thr Pro Asn Leu 35 40 45
Ser Glu lie 15
Gly Gly Gly 30
Lys His Gly
权利要求
1、一种基因工程猪口蹄疫重组免疫复合肽基因，其序列为SEQ.ID.NO.1所示的核苷酸序列。
2、 一种基因表达的猪口蹄疫重组免疫复合肽，其序列为SEQ.ID.N0.5所示的氨基酸序 列。
3、 权利要求2所述猪口蹄疫重组免疫复合賊的应用。
4、 一种高效表达权利要求2所述猪口蹄疫重组免疫复合肽基因工程菌株，其构建包括 以下步骤1) 猪口蹄疫重组免疫复合肽基因的重叠延伸拼接PCR扩增SOE-PCR: 设计三条PCR引物引物F1， SEQ.ID.N0.2:GAAATTAAAGGCGTG-3' 引物F2， SEQ.ID.N0.3:ACGCCTTTAATTTCG-3' 引物F3， SEQ.ID.N0.4:GGCTAAGTCGACTCG-3'PCR反应体系50jxl:10xPCRBuffer, 5pL，MgCl2， 3pL ; dNTP， 10腿ol/L， lpL; 引物F1 、 F2和引物F2，终浓度为20pmol/L各2pL; TaKaRa ExTaq 0.5pL;灭菌超 纯水，34.5pL;PCR反应程序94r预变性2min，进入TD-PCR循环:94t)30s，退火温度从55°C, 每循环lmin,共30个循环;72'C延伸6min，经过胶回收后获得猪口蹄疫重组免疫复合 肽基因；2) pET32a重组表达载体的构建上述猪口蹄疫重组免疫复合肽基因PCR产物和pET32a均用五co及I、 &/I双酶切,T4 DNA Ligase连接，连接产物转化E.coli DH5a，重组表达质粒进行五coi I和I双酶 切鉴定；酶切鉴定为阳性的质粒测序，命名为pET32a—KCMP;3) 重组表达质粒pET32a—KCMP转化大肠杆菌BL21，筛选阳性克隆，即为所获得的高效表达猪口蹄疫重组免疫复合肽基因的基因工程菌株。
5、 用权利要求4所述基因工程菌株制备的可溶性基因工程表达产物猪口蹄疫重组免疫 复合肽。
6、 权利要求5所述表达产物猪口蹄疫重组免疫复合肽的应用。
全文摘要
本发明涉及猪口蹄疫重组免疫复合肽的构建方法和应用，属于生物工程技术领域。该免疫多肽佐剂为口蹄疫病毒新型辅助T细胞表位(I-S-I-S-E-I-K-G-V-I-V-H-K-I-E-T-I-L-F)和囊素模拟肽(T-P-N-L-K-H-G)通过柔性Linker融合而成。融合基因插入表达载体，转化大肠杆菌，获得高效表达猪口蹄疫重组免疫复合肽的基因工程菌，通过液体培养、纯化制得的猪口蹄疫重组免疫复合肽融合蛋白，该融合蛋白经N端带有His标签的肠激酶去除硫氧还蛋白，再经亲和层析纯化，可获得单一的猪口蹄疫重组免疫复合肽，样品纯度极高。该重组免疫复合肽可作为口蹄疫疫苗的新型多肽免疫佐剂。动物免疫实验证实，安全性好，无毒副作用。能够有效增强机体细胞免疫和体液免疫水平。
文档编号A61K39/39GK101376887SQ20081015572
公开日2009年3月4日 申请日期2008年10月8日 优先权日2008年10月8日
发明者斌 周, 曹瑞兵, 臣 王, 陈溥言, 魏建超 申请人:南京农业大学