不：
[0096] 表5不同封闭液配比的焚光信号扫描结果
[0097]
[0098] 当封闭液中BH4Na浓度一定，乙醇（Ethanol)的浓度在0% -25%之间变化对洗脱 效果并无明显影响（Median值变化不大）；而当乙醇（Ethanol)浓度一定，BH4Na的浓度在 0%-0. 5%之间对洗脱效果影响巨大（Median值变化巨大），可以看到BH4Na浓度为0. 5%时 质量质控探针已被几乎完全洗脱，荧光级别与背景相近（Median值接近背景值）。而BH4Na 浓度为〇. 25 %，乙醇浓度为0 %时与BH4Na浓度为0 %时的所有点阵荧光信号已超过扫描仪 的阈值（Median值恒定为65535)，说明该BH4Na浓度下的洗脱效果比较低直至无洗脱效果。 基于反应原理，其封闭效果应与乙醇和BH4Na的浓度呈正相关，因此应该在可接受的范围内 取这两者的最高值。在本次试验中，可接受的结果（Median值彡1000,SNRm彡2.0)中乙醇 和BH4Na的最高浓度为0. 25%BH4Na，25%乙醇。
[0099] 可以看出，封闭液中冊4似的浓度为0.25%8財似、乙醇浓度为25%时，效果较佳。
[0100] 2. 4探针的筛选
[0101] 按2. 3方法进行基因芯片的点样，探针的布局如图4示，FMDV-0的三条探针为 1-3，FMDV-Asial的五条探针为1-5，FMDV-A的三条探针为1-3，SVDV的五条探针为1-5 ;按 2. 3所优化的水化和封闭条件进行封闭。封闭完后的芯片使用围栏粘贴工具贴上围栏待用。 [0102] 利用如2. 2所示体系、条件进行病毒阳性质粒的PCR扩增，并按照下表所示配制样 品杂交体系。
[0103]
[0104] 将该体系置于PCR仪中，在95 °C条件下变性5min，立即取出置于冰上，冰浴5min。 打开芯片杂交盒，将杂交盒平放在桌面上，在杂交盒底部凹槽内加入约500~1000μ1超纯 水。将芯片正面朝上（围栏面朝上，标签朝向操作者）放入杂交盒内两个定位销之间；放上 芯片盖片，注意有凸台的一面朝向芯片，上端先接触芯片，再缓缓盖下；然后用移液器通过 盖片加样孔缓慢注入15μ1变性后的杂交液，杂交液会凭借液体表面张力在盖片下面的凸 台和芯片表面之间形成一道液膜。盖紧杂交盒盖。安装上铝合金封条，置42°C水浴锅中避 光杂交3h。
[0105] 杂交后，取出芯片放在42°C预热好的洗液I中，42°C震荡清洗4分钟，再用42°C预 热好的洗液II，42°C震荡清洗4分钟，最后用42°C预热好的清水清洗一次，清洗后的芯片 800rpm离心lOmin以去除芯片表面的液体，此芯片可避光保存，在4小时内扫描都有效。
[0106] 结果如图5~图8以及表6所不：
[0107] 表6探针筛选焚光信号
[0108]
[0109] 可以看出，针对口蹄疫0型、AsiaI型，多条探针的亮度不同，说明它们与目的片 段结合的能力均不相同，观察能发现荧光点亮度差异较大。而口蹄疫A型和猪水泡病病毒 则均只有一条探针点有亮度，说明只有一条探针是可以有效结合的。
[0110] 由此，本发明有效的探针如下表所示：
[0111] 表7探针筛选结果
[0112]
[0113] 实验结果说明，本发明人结合多年的经验，分别找到可以有效检测口蹄疫0型病 毒、口蹄疫A型病毒、口蹄疫AsiaI型病毒、猪水泡病病毒的探针，而其他探针则检测效果 不佳。
[0114] 2.5PCR制备检测样品
[0115] 每种病毒分别按照如下体系和条件扩增：
[0116] 引物稀释：根据合成单，将合成的引物干粉加入适量灭菌超纯水，制成100μΜ的 引物贮存液，使用时按照1 :9(引物贮存液：灭菌超纯水）的体积比将其稀释成10μΜ的引 物使用液。
[0117] PCR体系和条件：
[0118]
[0119] PCR体系条件：
[0120]
[0121] 2. 6寡核苷酸检测芯片杂交
[0122] PCR体系和条件：
[0123]
[0124] 3、芯片的性能检测
[0125] 3.1灵敏度研究
[0126]PCR体系：
[0127]
[0128] 按表前表所示体系及程序进行PCR，将所构建的五种阳性质粒分别进行十倍梯度 稀释用作模板，范围从10 °~10 9。PCR结束后使用PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测， 并取肉眼可见与不可见分界处向左向右各两个梯度的PCR产物按2. 3方法进行芯片杂交与 扫描，五种阳性质粒的浓度如下表。
[0129] 质粒浓度：
[0130]
[0131] 实验结果如图9~12以及表7所示：
[0132] 表7芯片灵敏度荧光信号值
[0133]
[0134] 阳性判断标准为Median值彡500,SNRm彡1· 5·
[0135] 可以看出，本芯片检测方法的检测限为：FMDV-0 0. 00001180μg/mL，FMDV-A 0· 00000184μg/mL，FMDV-AsiaI0· 000129μg/mL，SVDV0· 00000247μg/mL，灵敏度高。
[0136] 3. 2特异性研究
[0137]PCR体系：
[0138]
[0139] 按前表所示体系及程序进行PCR，模版分别为下表所示细菌、病毒中提取的基因组 cDNA〇
[0140]
[0141] 实验结果如图13~16以所示：本实验引物均分别只对目标病毒的cDNA有较好的 扩增效果，对其他病毒的cDNA未有扩增，说明其特异性好。
[0142] 3. 3重复性研究
[0143] 在芯片点样制备方法与杂交条件相同的条件下，试验中分别对两个生产厂家、三 批芯片进行了点样、杂交。
[0144] 如图17~20所示，使用了两个厂家（北京博奥生物有限公司晶芯@!醛基基片、上海 百傲科技有限公司BaiO,醛基基片）的醛基基片进行了实验，目标探针均有较强杂交信号， 因此能说明芯片的重复性良好。
[0145] 3. 4稳定性研究
[0146] 制备芯片在抽真空、低温的条件下，至少能保存四个月，位置质控、阳性质控、样品 杂交信号无衰减，证明该芯片稳定性较好。
[0147] 综上，本发明基因芯片和试剂盒可以有效检测口蹄疫病毒和猪水泡病病毒，特异 性强、敏感性高、耗时短，检测快速，具有良好的应用前景。
【主权项】
1. 一种检测口蹄疫病毒和/或猪水泡病病毒的基因芯片，其特征在于：它包括固相载 体以及固定在固相载体上的探针；所述探针包括SEQIDNO:1~4所示任意一个或者任意 多个基因片段，用于检测口蹄疫病毒〇型、口蹄疫病毒A型、口蹄疫病毒AsiaI型和/或猪 水泡病病毒。2. 根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于：它还包括质控探针，其核苷酸序列如 SEQIDNO: 13 ~14 所示。3. -种检测口蹄疫病毒和/或猪水泡病病毒的试剂盒，其特征在于：它包括权利要求 1或2所述的基因芯片以及扩增试剂；其中，扩增试剂包括SEQIDNO:5~6、SEQIDNO: 7~8、SEQIDNO:9~10和/或SEQIDNO:11~12所示引物对，用于扩增口蹄疫病毒0 型、口蹄疫病毒A型、口蹄疫病毒AsiaI型，和/或猪水泡病病毒。4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述引物对中，上游引物与下游引物的 摩尔比为1:1。5. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述SEQIDNO:5、7、9、11所示上游引 物标记有荧光染料。 6. SEQIDNO:1~4所示任意一个或者任意多个基因片段在制备检测口蹄疫病毒0型、 口蹄疫病毒A型、口蹄疫病毒AsiaI型和/或猪水泡病病毒的基因芯片的用途。7. 根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述还包括质控探针，其核苷酸序列如 SEQIDNO: 13 ~14 所示。 8. SEQIDNO:5 ~6、SEQIDNO:7 ~8、SEQIDNO:9 ~10 和 / 或SEQIDNO:11 ~ 12所示引物对以及SEQIDNO:1~4所示任意一个或者任意多个基因片段所示基因片段 在制备检测口蹄疫病毒0型、口蹄疫病毒A型、口蹄疫病毒AsiaI型和/或猪水泡病病毒 的试剂盒中的用途；其中，引物对为扩增试剂，SEQIDNO:1~4所示基因片段为检测探针。
【专利摘要】本发明公开了一种检测口蹄疫病毒和/或猪水泡病病毒的基因芯片和试剂盒。本发明基因芯片和检测试剂盒和检测方法可以准确、有效的检测口蹄疫病毒和猪水泡病病毒，且特异性强、灵敏度高、耗时短，检测快速，应用前景良好。
【IPC分类】C12Q1/68, C12R1/93, C12Q1/70
【公开号】CN105349695
【申请号】CN201510280036
【发明人】文心田, 黄小波, 欧阳达, 曹三杰, 文翼平, 伍锐
【申请人】四川农业大学
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年5月28日