一种利用单核苷酸多态性检测鸡嫩度性状的方法及引物的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用单核苷酸多态性检测鸡嫩度性状的方法及引物，通过对鸡CAPN1和CAST基因CDS区进行SNPs检测，利用F1引物在CAPN1基因的外显子6检测到1个SNP位点，该SNP位点在GenBank序列(GenBank?NO:NC_006090.1)上具体为3535位由G→A；利用F2引物在CAST基因的外显子11检测到1个SNP位点，该SNP位点在GenBank序列(GenBank?NO:NC_006127.2)上具体为37752位由A→T；并在优质肉鸡中分析单个位点不同基因型和嫩度性状的关系。
【专利说明】—种利用单核苷酸多态性检测鸡嫩度性状的方法及引物
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用分子生物学技术检测鸡嫩度性状的方法及引物。本发明的目的是提供一种用分子生物学技术，即单核苷酸多态性来检测鸡嫩度性状的方法。
【背景技术】
[0002]随着生活水平的不断提高，人们对优质鸡的需求日渐扩大，优质鸡的生产由过去的家庭式副业生产逐渐转向规模化大生产。优质鸡主要强调的是肉质，我国地方鸡种一般都具有生长速度慢、肉质好的特点。由于基因及其表达的差异是导致生物性状多样性的根本原因，肉质性状的差异根本上也是由于基因及其表达的差异所引起。另一方面，随着肉鸡育种理论和实践的不断充实和发展，使现代肉鸡的生长速度达到很高的水平，但随之产生的负面效应是腹脂的大量沉积，这造成了鸡肉品质的低劣，最明显的是风味的下降。鸡肉的加工学性状、组织学性状，尤其是食用品质(嫩度、风味、多汁性、系水力等)都直接受到肌纤维组织学特性的影响。因此，研究调控鸡肌纤维生长发育的相关基因作用机制十分有必要。
[0003]肉质体系的评 价是一个复杂的系统，一方面影响肌肉品质的因素复杂，另一方面肉质体系的评价指标复杂。影响肉质的因素复杂，主要受到基因和环境的影响，以及它们之间的互作，基因因素主要包括品种、性别、基因型等，环境因素主要有营养水平、饲养方式、宰前和宰后的处理方式。基因和环境共同影响了肉的组织和结构、宰前和宰后肉的化学组成，从而影响到肉的食用品(Harmegnies et al, 2006 ；Smulders et al, 2006)。肉质评价体系就目前常见的指标一般有客观标准与主观标准。客观标准是指肉质的物理、化学和生物学等特性，以及卫生检验指标；主观标准是指人的感官评定。鸡肉品质一般包括感官品质、保存性、深加工品质、营养价值和卫生质量。感官品质是指颜色、肉的PH值、系水力、肉嫩度和肉的风味。
[0004]嫩度反映了肉品的组织结构，这一性状用肌肉剪切力来测量。嫩度主要受肌肉纤维的组织学和生化特性的影响。红肌纤维直径小，肌红蛋白丰富，适于有氧代谢；白肌纤维直径大，糖原含量丰富但肌红蛋白与脂肪酸较少，适于无氧代谢。肌肉中肌纤维的组成会影响到肉品的嫩度。纤维越细，肉质越嫩，我国的地方鸡种比同周龄的国外肉鸡的纤维细(耿照玉等，2003)。
[0005]随着分子生物学的发展，动物育种工作也有了更为强有力的工具一分子标记辅助选择(MAS)，有关鸡肉质性状的候选基因也被进行了广泛的研究。同时这些重要候选基因的基因型研究也为优质鸡的定性工作提供了新的视野，甚至有可能以分子水平上的研究为基础发展出更为客观和准确的测评体系。
[0006]随着对优质肉鸡的选育，鸡肉肌纤维有变粗、嫩度有下降的趋势，改善嫩度势在必行。目前嫩度测定还只能在屠宰后进行，若用传统的方法进行选育，则不但加大选育成本，且遗传进展缓慢。标记辅助选择(MAS)为解决这一问题提供了新的思路。选择与数量性状位点(QTL)相连锁的分子遗传标记(基因或非基因标记)，通过多基因型的识别，即可实现对个体的直接选择，从而达到尽快提高生产性能的目的。各国研究人员的研究成果表明了钙蛋白酶系统基因作为牛肉肉品质嫩度性状候选基因的潜力，同时指出钙蛋白酶系统控制着肌纤维蛋白的降解，与肌肉增长和宰后嫩度的变化密切相关，这对研究鸡肉肉质有重要的借鉴意义。
[0007]PCR-SSCP分析法是一种发展很快并且己经被广泛应用的分子生物学方法。SSCP是现今检测SNP极其重要的技术之一。该方法在简便性、重复性、检测灵敏性等方面不断有新的改进，从而使其更加完善。PCR-SSCP与测序技术相结合能够准确找到SNP位点。
[0008]钙蛋白酶(calpain)广泛存在于各组织，CAPN是细胞质中主要的蛋白水解酶，在肌原纤维蛋白降解中起着重要的作用。肌肉增长和宰后嫩度的变化与蛋白质水解程度密切相关。
【发明内容】
[0009]本发明所要解决的技术问题是提供一种利用单核苷酸多态性检测鸡嫩度性状的方法及引物。
[0010]本发明的技术方案如下:
[0011]本发明以鸡CAPNl和CAST基因作为影响嫩度的候选基因，通过对鸡CAPNl和CAST基因CDS区进行SNPs (single nucleotide polymorphisms)检测，并在优质肉鸡中分析单个位点不同基因型和嫩度性状的关系，目的在于寻找与嫩度高度相关的遗传标记，为优质肉鸡的分子育种提供理论依据。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图11%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA结果；
[0013]图2CAPNl基因PCR-SSCP电泳与测序图；
[0014]图3CAST 基因PCR-SSCP电泳与测序图；
【具体实施方式】
[0015]以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
[0016]本试验鸡群主要来源于四川大恒家禽育种有限公司培育的8个优质肉鸡新品系，分别为 5 个纯系 S03、S02、S05、S01、D99 和 3 个配套系 S01XD99、S01XS10、S01XS05，纯系已经过3个世代的选育，每个群体各选公母15只，共240个个体作为试验素材。饲养全阶段由专人管理，单笼饲养，管理及营养水平一致，自由采食，达到适宜上市体重(2kg)时屠宰。血样米样方法为鸡翅静脉米血，所米血样均为ImL/只、EDTA抗凝,血样于_20°C冷冻保存。
[0017]最大剪切值:取胸肌中段，平整放入塑料袋中，在0?4°C条件下冷藏24h后升温15min,然后80°C水浴加热到样品中心温度70°C,4°C冷却，顺肌纤维方向用剪刀修成直径为1.27cm，长度为3cm-5cm的肉样，用品质分析仪测定剪切值。
[0018]I)基因组DNA提取
[0019]鸡血基因组DNA的提取参考从家禽血细胞中提取DNA方法，并参照孟祥军改进的方法进行。试验前先对所用器具，试剂，耗材进行高压灭菌。具体步骤如下:
[0020]①冷冻血液在室温融化以后，取IOii L移至离心管中，加入500 ii L STE缓冲液，IOuL SDS，加入IOii L蛋白酶K(浓度为1011§/111)，混合，上下充分摇动，371:摇床水浴2小时，然后55°C水浴过夜。
[0021]②将溶液冷却至室温，加入等体积苯酚，轻摇离心管20分钟，直至两相混合形成乳浊液，4°C，12000r/min离心10分钟。
[0022]③取上清，再加入等体积苯酚，轻摇离心管10分钟，4°C，12000r/min离心10分钟。
[0023]④取上清，加入等体积酚:氯仿:异戊醇混合液(24:23:1)，缓慢颠倒离心管10分钟，4°C，12000r/min 离心 10 分钟。
[0024]⑤取上清,加入等体积氯仿,缓慢颠倒离心管10分钟，4°C, 12000r/min离心10分钟。
[0025]⑥取上清，加入2倍体积的预冷_20°C冰乙醇沉淀DNA，缓慢的转动离心管，可见白色DNA沉淀。
[0026]⑦4°C，12000r/min离心10分钟，去上清，然后加4°C预冷的70%乙醇快速冲洗两次，12000r/min离心10分钟,去上清。
[0027]⑧将DNA置于室温下自然风干干燥(注意不能太干燥)，根据沉淀的量加入适量(100-200 U L) TE (pH8.0 )缓冲液溶解，置4 °C冰箱溶解过夜；溶解后的DNA可贮于4°C、-20°C、-70°C 中备用。
[0028]注意在抽吸上清液时，尽量小心勿将中间的蛋白质层抽出。
[0029]DNA浓度和纯度的检测
[0030]用1.0%的琼脂糖凝胶检测总DNA，并用DNA定量仪定量其浓度及纯度。要求DNA纯度(0D值)在1.3以上，如若不纯可使用饱和酚，酚氯仿重新抽提。
[0031]①琼脂糖凝胶电泳检测:取5 y L待测DNA溶液和I y L溴酚蓝置入一微量离心管中混匀，上样于1.0%的琼脂糖凝胶(含0.05%GoIdView染料)，75V电泳5小时，在凝胶成像系统上观察各样品电泳条带的亮度和分布情况，参照Marker确定各DNA样品需要稀释的倍数，最后照相并保存图象。观察电泳条带，无明显拖尾，条带集中明亮则符合实验要求。
[0032]②分光光度法测定:取6 ii L待测DNA溶液稀释500倍至3mL，分别在紫外分光光度计260nm和280nm处测定OD值。
[0033]DNA 浓度(ii L/ml) =OD260 X 稀释倍数 X 50
[0034]DNA 纯度=OD260/OD280
[0035]纯DNA样品的0D26Q/0D28Q比值为1.8，质量好的DNA其0D26(l/0D28(l比值应在1.6-1.8之间。若大于1.8说明RNA尚未除净,考虑用RNAse处理；若小于1.6则说明样品中存在蛋白质或酚，可再用苯酚/氯仿或乙醚处理；若在270nm处存在高吸收表明有酚的干扰，当然也会存在既有蛋白质又含RNA的DNA溶液其比值也为1.8，若有必要结合琼脂糖凝胶电泳检测一起鉴定DNA的纯度。
[0036]2) PCR-SSCP 分析
[0037]2.1PCR 扩增
[0038]PCR 扩增体系(IOii L):2 X Taq PCR MasterMix5 ii L、ddH203.4 ii L、引物(IOpmol/ii L)各 0.L、模板 DNA (50ng/mL) 0.8u L0 PCR 扩增参数:94°C 4min，[94°C 30s, 58 °C(根据所设计引物而确定温度)30s, 72°C lmin]35cycles,72°C 8min。产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，UVP凝胶成像系统照相保存。[0039]2.2聚丙烯酰胺凝胶制作及电泳
[0040]以浓度12%，体积30mL的非变性聚丙烯酰胺凝胶制作及电泳为例，步骤如下:
[0041]a清洗玻板、胶条，烘干，用0.5%琼脂糖封闭玻璃板和胶条间的缝隙。
[0042]b在IOOmL小烧杯内加入相应30%聚丙烯酰胺12mL，10XTBE3mL, 50%过硫酸胺40 u L，TEMED20 u L，加ddH20至30mL，混匀后迅速灌胶。
[0043]c当胶灌至离玻璃板上沿0.1cm时停止灌胶，插入梳子，室温聚合，多余的丙烯酰胺4°C保存，随时观察凝胶聚合情况并补加聚丙烯酰胺。
[0044]d胶聚合后，向电泳槽加入1XTBE，用注射器冲洗点样孔预电泳lOmin。
[0045]e取2.0ii L PCR产物置于PCR管中，加3 ii L变性Buffer，离心混匀，98°C变性IOmin后迅速冰浴IOmin,点样。
[0046]flOO 伏电泳 12h。
[0047]注:聚丙烯酰胺凝胶浓度为10%、12%、14%分别加入10mL、12mL、14mL30%的丙烯酰胺。
[0048]2.3 银染
[0049]a电泳结束后关闭电泳仪，放出电泳液，取出凝胶置于10%的乙醇溶液中固定10-15分钟一去离子水洗胶一0.l%AgN03染色液染色30分钟一去离子水漂洗凝胶3次。
[0050]b用显色液进行显 影，当凝胶上显出清晰的DNA条带时，适时倒掉显色液，用去离子水漂洗凝胶2次。加入4%的冰醋酸溶液，终止显色反应。
[0051]c用去离子水漂洗凝胶2次，保鲜膜封好，用凝胶成像系统仪观察电泳结果并拍照、保存。
[0052]注:染色液和硝酸都可以重复利用。
[0053]3)多态性位点的遗传效应统计分析模型
[0054]用SAS Version8.0软件包GLM程序计算CAPNl、CAPN3和CAST基因多态位点对鸡屠宰性状和肉质性状遗传效应分析，分析结果用最小二乘均数和标准误表示。固定模型如下:
[0055]Y=U +B+S+G+bX+e
[0056]其中，Y:个体屠宰性状的观测值；U:屠宰及肉质性状的群体均值；B:品种或品系效应；S:性别效应；G:基因型效应；b:影响屠体重的回归系数；X:屠体重(协变量，只用于屠宰性状)。e:随机残差效应。
[0057]实验结果
[0058]1、基因组DNA提取结果
[0059]采用常规酚-氯仿法从实验鸡血液中提取基因组DNA，用1.0%琼脂糖电泳检测，可以看到DNA条带清晰、明亮、无杂带，完全符合后续PCR实验的要求(图1)。
[0060]2、SNP位点检测
[0061]I)利用Fl引物在CAPNl基因的外显子6检测至IJ I个SNP位点(见表I与图2)，该SNP 位点在 GenBank 序列(GenBank N0:NC_006090.1)上具体为 3535 位由 G — A。
[0062]表ICAPNl基因SNP扫描所用引物详细信息
[0063]
【权利要求】
1.一种利用单核苷酸多态性检测鸡嫩度性状的方法，其特征在于，通过对鸡CAPNl和CAST基因⑶S区进行SNPs检测，利用Fl引物在CAPNl基因的外显子6检测到I个SNP位点，该 SNP 位点在 GenBank 序列(GenBank N0:NC_006090.1)上具体为 3535 位由 G — A ;利用F2引物在CAST基因的外显子11检测至IJ I个SNP位点，该SNP位点在GenBank序列(GenBank N0:NC_006127.2)上具体为37752位由A — T ;并在优质肉鸡中分析单个位点不同基因型和嫩度性状的关系。
2.权利要求1所述的方法中采用的引物，其特征在于，包括Fl和F2;F1序列为:F:AGGGGT AGG GTA ATA GAA CTA ；R:ACC GCC AGC CAT CAA AT ；F2 序列为:F:AAA CGA GAA GGTAGC C；R:CTG GTA ·TCT TTG GAA GAC ATA。
【文档编号】C12Q1/68GK103436632SQ201310437042
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年9月23日 优先权日:2013年9月23日
【发明者】张增荣, 蒋小松, 杜华锐, 杨朝武, 李晴云, 李雯, 邱莫寒, 宋小燕, 胡陈明, 夏波 申请人:四川省畜牧科学研究院