专利名称：具有增加的稳定性的突变型乳酸氧化酶以及涉及其的产品、方法和用途的制作方法
具有增加的稳定性的突变型乳酸氧化酶以及涉及其的产品、方法和用途本发明涉及具有增加的稳定性的突变型乳酸氧化酶(lactate oxidase)、编码突变型乳酸氧化酶的核酸、包含所述核酸的表达载体、包含所述核酸或所述表达载体的宿主细胞、测定样品中的乳酸的方法、突变型乳酸氧化酶用于测定乳酸的用途、使用所述突变型乳酸氧化酶用于测定样品中的乳酸的装置和包含所述突变型乳酸氧化酶用于测定乳酸的试剂盒。乳酸(lactic acid)也称为乳酸(milk acid),在几个生物化学过程中起作用。乳酸是具有化学式C3H6O3的a羟酸。在溶液中它以其离子形式存在，即作为乳酸根(lactate)CH3CH(OH)COO。乳酸(lactate)是手性的，并且具有2种光学异构体。一种称为L_( + )_乳酸或(幻-乳酸，并且另一种称为D-()-乳酸或0 )-乳酸。L- ( + )-乳酸是生物学重要的异构体。
在动物(包括人)中，L-乳酸(L-1actate)在正常代谢和运动过程中经由酶乳酸脱氢酶(LDH)由丙酮酸(pyruvate)不断产生。它通常直到乳酸生产率超过乳酸去除率才在浓度中增加，这由许多因素支配，包括单羧酸转运蛋白、LDH的浓度和同种型、和组织的氧化能力。在人中，血液乳酸的浓度在静止时通常是1-2 mmol/L，但在激烈运动过程中可以升高至超过20 mmol/L。乳酸浓度或乳酸与丙酮酸比反映氧化还原态。因此，监控乳酸水平是在组织需氧量和利用之间的平衡的良好指示剂，并且当研究细胞和动物生理学是有用的。相应地，可以监控在生物学样品例如血清、血浆、血液、尿和唾液中的乳酸或在细胞培养样品中的细胞内和细胞外乳酸浓度，以便研究或监控受试者或细胞的状况。血液乳酸的测定频繁用于竞争性体育运动、健身和康复中，允许
个体运动强度的评估
运动和恢复期的改善 #超负荷和损伤的危险减少
如上文详述的，无氧糖酵解显著增加血液乳酸，尤其是对于延长运动。在医学中，乳酸的测定可以用于 测定组织缺氧
测定疾病的严重性和预后，到由乳酸水平反映的程度。例如，乳酸浓度可以在降低机体可用的氧量、增加乳酸生产和/或降低乳酸清除率的任何状况下增加。这可以是从由于剧烈运动在肌肉中产生的乳酸的局部增加直到威胁生命的全身休克的任何事情。过量乳酸可以存在于一系列疾病、感染和遗传性代谢和线粒体病症中。关于增加的血液乳酸的常见原因是起因于此类状况例如休克、肺炎和充血性心力衰竭的缺氧。乳酸酸中毒还可以在肾衰竭和白血病中出现。此外，硫胺素缺乏病和糖尿病酮症酸中毒与增加水平的乳酸相关。它们还可以通过特定药物例如二甲双胍(由糖尿病患者服用)和异烟肼(肺结核治疗)引起。用于测定乳酸的测试是本领域已知的。近年来，用于测定乳酸的酶促方法已得到开发。酶促方法涉及在测定方法中酶的使用，并且一般是简单的且提供更大的特异性、准确度和重现性。对于乳酸测定描述的第一种酶促方法基于通过乳酸脱氢酶从乳酸到铁氰化钾的氢转移。然而，该程序是麻烦的且未受到广泛承认。后续方法涉及NADH形成的UV测量。在1974年，描述了测量通过由乳酸脱氢酶催化的乳酸氧化形成的NADH的乳酸程序，使用肼作为用于丙酮酸的捕获剂。另一种方法还基于乳酸脱氢酶的催化作用，但在反应混合物中包括丙氨酸转氨酶，以更快速地去除由乳酸转换形成的丙酮酸。另外一种方法使用涉及乳酸氧化酶的酶促反应，以将乳酸转换为丙酮酸。通过这种反应产生的过氧化氢随后可以用于酶促反应中，以生成有色染料。来自绿浅气球菌(Jerococcus viridans )的乳酸氧化酶通常用于生物传感器和体外测试中，以便检测例如在血液中的乳酸。这些生物传感器和体外测试占优势地用于例如重点护理患者和运动员的监控中。传感器的寿命由乳酸氧化酶的稳定性决定，所述乳酸氧化酶在使用和贮存期限过程中变得失活。此外，用于体外测试的试剂的贮存期限和使用中时间受乳酸氧化酶的稳定性影响。因此，增加乳酸氧化酶的稳定性具有很大利益，以便增加生物传感器和体外测试的贮存期限和使用中时间。相应地，本发明的目的是提供具有增加的稳定性的乳酸氧化酶。 令人惊讶的是，已发现在SEQ ID NO:1的乳酸氧化酶的氨基酸序列的位置191上的酪氨酸突变增加乳酸氧化酶的稳定性。由于传感器和测试的有限贮存期限和使用中时间，它们必须频繁取代，因为活性下降到技术可接受的水平下。明显地，传感器和测试设备的频繁变化是消费者不友好的、资源的浪费且因此要避免的。由于野生型乳酸氧化酶的低稳定性，涉及乳酸氧化酶的测定通常在低温下执行。增加的乳酸氧化酶稳定性的另外优点将是当测量乳酸时，在用于血液分析的装置中，用于将温度减少至25 - 30°C的恒温器(thermostate)是可以避免的，因为血气分析(通常伴随执行)通常在37°C执行。相应地，更稳定的乳酸氧化酶将显著减少装置的复杂性。这将提供关于低成本装置的基础，这例如在所谓的新兴市场中具有特别关联性。相应地，在第一个方面，本发明提供了具有增加的稳定性的突变型乳酸氧化酶，其包含这样的氨基酸序列，其
(i)与SEQID NO:1或SEQ ID NO: 2的氨基酸序列或其功能活性变体至少90%等同；
和
(ii)具有在对应于SEQID NO:1或SEQ ID NO: 2的位置Tyrl91的位置上的氨基酸
置换，
其中功能活性变体具有在选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的Gly36、Ala95、Thrl03、Glul60、Vall98、Asn212、Ala/Gly232和Phe277的位置上的至少一个进一步的氨基酸置换。术语“乳酸氧化酶”(由国际生化联合会的酶学委员会(Enzyme Commission of theInternational Union of Biochemistry)分类为 EC 1.1.3.15)一般意指催化 L-乳酸至丙酮酸的氧化的酶，伴随O2至H2O2的还原((S)-2-羟酸氧化酶)。乳酸氧化酶是FMN (黄素单核苷酸)依赖性a羟酸氧化酶家族的成员。它采用黄素单核苷酸(FMN)作为辅因子。乳酸氧化酶在病毒和细胞生物中出现。根据本发明，与在位置191上不含突变的各自乳酸氧化酶相比较，突变型乳酸氧化酶具有增加的稳定性。令人惊讶的是，发现其中Tyr由另一种氨基酸置换的在位置191上的突变，特别是带有非极性较大侧基的氨基酸例如苯丙氨酸、亮氨酸和色氨酸的置换，相对于野生型乳酸氧化酶，增加在碱性环境的存在下酶的稳定性。用于研究酶的稳定性特别是依赖于环境条件例如培养基条件的合适测试是技术人员众所周知的。合适和示例性测试也在实施例特别是实施例1中描述。在本发明的一个优选实施方案中，相对于在位置191上不含突变的各自乳酸氧化酶，突变型乳酸氧化酶的增加的稳定性表示为相对于在位置191上不含突变的各自乳酸氧化酶的半衰期(t1/2 (野生型191))，在突变型的半衰期(t1/2 (mutl91))中的增加。酶的半衰期(t1/2)指示其中50%的原始活性(在t=0时的活性)丧失(关于进一步举例说明参见实施例I)和在这之后残留活性量至50%的时间量。·
相应地，增加的稳定性导致相对于在位置191上不含突变的各自乳酸氧化酶，突变型增加的半衰期。优选地，半衰期增加至少10%、20%、30%或40%，优选至少50%、75%或100%，更加优选至少125%、150%、175%或200%，尤其是250%且最优选300%。半衰期中的增加百分比可以测定为[t1/2 (mutl91)/t1/2 (野生型191) 一 I] * 100。如本文提及的术语“SEQ ID NO:1”指示如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列，并且代表来自绿浅气球菌的野生型乳酸氧化酶的氨基酸序列，具有羧基末端缺失但不具有突变的Tyrl91。绿浅气球菌的野生型乳酸氧化酶片段是276氨基酸蛋白质。特别地，术语“SEQ ID NO:1”指如下所示的氨基酸序列(请注意上文指定的置换位点由下划线指出且由位置编号指定)
权利要求
1.一种具有增加的稳定性的突变型乳酸氧化酶，其包含这样的氨基酸序列，其 (i)与SEQID NO:1或SEQ ID NO: 2的氨基酸序列或其功能活性变体至少90%等同；和 (ii)具有在对应于SEQID NO:1或SEQ ID NO: 2的位置Tyrl91的位置上的氨基酸置换， 其中所述功能活性变体具有在选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的Gly36、Ala95、Thrl03、Glul60、Vall98、Asn212、Ala/Gly232 和 Phe277 的位置上的至少一个进一步的氨基酸置换。
2.权利要求1的突变型乳酸氧化酶，其特征在于在位置191上的酪氨酸由非极性氨基酸置换，特别地其中所述氨基酸置换选自Tyrl91Phe、Tyrl91Leu、Tyrl91Ile、Tyrl91Met和Tyrl91Trp,尤其地所述氨基酸置换是Tyrl91Phe或Tyrl91Leu,优选Tyrl91Phe。
3.权利要求1或2的突变型乳酸氧化酶，其特征在于所述至少一个进一步的氨基酸置换选自 SEQ ID NO:1 或 SEQ ID NO:2 的 Gly36Ser、Ala95Gly、Thrl03Ser、Glul60Gly、Vall98Ile、Asn212Asp、Ala/Gly232Ser 和 Phe277Tyr。
4.权利要求1- 3的突变型乳酸氧化酶，其特征在于所述至少一个进一步的氨基酸置换是Ala95，特别是Ala95Gly。
5.权利要求1- 4的突变型乳酸氧化酶，其特征在于相对于相应的野生型酶，所述突变型乳酸氧化酶具有至少1. 5倍增加的稳定性，优选至少2倍增加的稳定性，优选至少2. 5倍增加的稳定性，更优选至少3倍增加的稳定性。
6.权利要求4或5的突变型乳酸氧化酶，其特征在于相对于相应的野生型酶，所述突变型乳酸氧化酶具有与羟乙酸相比较对于乳酸至少2倍增加的选择性，优选至少2. 5倍增加的选择性，优选至少3倍增加的选择性，更优选至少3. 5倍增加的选择性，且最优选至少4倍增加的选择性。
7.—种核酸，其编码权利要求1 - 6中任一项的突变型乳酸氧化酶。
8.—种表达载体，其包含权利要求7的核酸，其中所述核酸与能够促进所述核酸在宿主细胞中的表达的启动子序列可操作地连接。
9.一种宿主细胞,其包含权利要求7的核酸或权利要求8的表达载体。
10.一种测定样品中的乳酸的方法，所述方法包括 a)在有助于所述乳酸氧化酶的活性的条件下，使所述样品与权利要求1- 6中任一项的突变型乳酸氧化酶接触；和 b)测定 i)在乳酸的存在下由所述突变型乳酸氧化酶产生的丙酮酸和/或H2O2，和/或 ii)在乳酸的存在下由所述突变型乳酸氧化酶消耗的02， 从而测定乳酸。
11.权利要求10的方法， a)其中所述H2O2的测定通过转换成色原执行，特别是通过过氧化物酶介导的转换执行；和/或 b)其中所述突变型乳酸氧化酶是传感器、测试条、测试元件、测试条装置或液体测试的一部分。
12.权利要求1- 6中任一项的突变型乳酸氧化酶用于测定乳酸的用途。
13.—种用于测定样品中的乳酸的装置，其包含根据权利要求1 - 6中任一项的突变型乳酸氧化酶和对于所述测定所需的任选的进一步组分。
14.根据权利要求13的装置，其特征在于所述装置包含传感器，优选电化学传感器或光传感器，或测试条。
15.—种用于测定乳酸的试剂盒，其包含根据权利要求1 - 6中任一项的突变型乳酸氧化酶和对于所述测定所需的至少一种进一步试剂。
全文摘要
本发明涉及具有增加的稳定性的突变型乳酸氧化酶、编码所述突变型乳酸氧化酶的核酸、包含所述核酸的表达载体、包含所述核酸或所述表达载体的宿主细胞、测定样品中的乳酸的方法、突变型乳酸氧化酶用于测定乳酸的用途、使用所述突变型乳酸氧化酶用于测定样品中的乳酸的装置和包含所述突变型乳酸氧化酶用于测定乳酸的试剂盒。
文档编号C12N15/53GK103013940SQ20121035120
公开日2013年4月3日 申请日期2012年9月20日 优先权日2011年9月20日
发明者T.迈尔, B.萨法尔, T.施托伊泽, B.尼德茨基, S.莱特格布 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司