专利名称：一种采用自克隆工程菌高效发酵生产l-山梨糖的方法
技术领域：
本发明涉及ー种高效发酵生产L-山梨糖的方法，特别是一种采用自克隆工程菌提高细胞膜上山梨醇脱氢酶活性来強化山梨醇氧化脱氢途径，从而调控山梨醇快速化地导向目标代谢产物山梨糖的方法。
背景技术：
L-山梨糖，一种己酮糖，为D-果糖的C-2位和C-3位差向异构体。是エ业发酵生产维生素C(VC)的中间体，目前エ业上主要用“莱氏法”和“两步发酵法”生产VC，ニ法初始均经发酵将D-山梨醇转化为L-山梨糖。其中，以D-山梨醇为底物的发酵エ艺是唯一用于、エ业生产的方法，但是现有技术发酵周期长，导致生产成本高、产品质量不易控制。国内外关于微生物发酵法生产L-山梨糖的研究主要集中于对发酵条件的优化和控制，但是简单的发酵优化并不能很好地缩短发酵周期等，代谢工程作为ー种理性的菌种改造方法能够更加有效地实现目标产物的高产。虽然，目前采用代谢工程手段来強化L-山梨糖积累的研究鲜有报道，但是鉴于山梨醇脱氢酶(sldh)是Gluconobacter oxydans ATCC621H将D-山梨醇转化为山梨糖的关键酶，強化这一途径，应该能够使D-山梨醇高效脱氢氧化为L-山梨糖，从而成为进ー步强化G. oxydans 621H生产山梨糖时表现的有效策略。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种采用自克隆工程菌高效发酵生产L-山梨糖的方法，其通过过量表达山梨醇脱氢酶基因，強化山梨醇氧化脱氢的代谢途径，实现L-山梨糖的过量积累。以下是本发明技术方案的详细描述。目的基因sldh扩增与表达质粒的构建根据Genbank: NC_006677. I所示山梨醇脱氢酶基因，通过化学全合成方法获得山梨醇脱氢酶基因，再酶切连接到到含卡那霉素(Kan)抗性标记基因的质不立 pBBRlMCS-2(Four new derivatives of the broad-host-range cloning vectorpBBRlMCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes),得至丨J 表达载体pBBRlMCS-2-sldh。过量表达sldh的G. Oxydans 621H重组菌的筛选将重组质粒pBBRlMCS-2-sldh经电激法转化G. oxydans ATCC 62IH感受态细胞，将能在山梨醇培养基+Ceporex+Kan平板上生长的菌落,在山梨醇+Ceporex+Kan平板上连续转接三代，得到遗传稳定的重组子。挑取阳性重组子若干提基因组，利用引物sldh-F和sldh-R进行PCR验证，得到大约9. 2kb的片段，表明sld基因已成功整合到G. oxydans ATCC621H基因组中，所得重组菌命名为G. oxydans 621H_sldh。该菌在以山梨醇为唯一碳源的培养基上生长时，山梨醇脱氢酶活性有了显著提高，是出发菌株的I. 33倍。微生物菌株的种子培养与发酵
种子培养基山梨醇150g，酵母膏6g，CaCO3 2g，pH 4. 8-5. 1，自来水定容至1し发酵培养基山梨醇250g，酵母膏2g，CaCO3 2g，pH 4. 8-5. 1，自来水定容至1し种子培养基和发酵培养基的灭菌温度为115-121° C，15min。将实验菌株接种到种子培养基中，500mL摇瓶装液50mL，温度为30° C，转速200rpm，培养时间为20_24h。按15%的接种量将培养好的种子接入发酵培养基，500mL锥形瓶中发酵培养基为50mL,30° C、200rpm条件下每批培养36h。细胞干重的測定取一定量的菌悬液置于IOmL容量瓶中，加2mL盐酸溶解菌悬液中的碳酸I丐，加入去离子水定容至IOmL,摇勻,用UV 7500型可见分光光度计,于600nm处比
色测OD值，用细胞干重标准曲线算得细胞干重。D-山梨醇与L-山梨糖浓度的測定高效液相色谱(HPLC)仪器=Agilent 1100高效液相色谱仪(配紫外可见检测器、示差折光检测器和エ作站)。色谱柱AminexHPX-87H (Bio-Rad)；流动相0.005mol/L H2SO4 ；流速0.6mL/min ；柱温35°C ；进样量5yL;检测器为示差折光检测器。样品制备500 μ L发酵液在8000rpm下离心lOmin，取上清液250 μ L移入5mL容量瓶中，超纯水定容至刻度线，经O. 22 μ m滤膜过滤，滤液供液相色谱分析。本发明提供的自克隆工程菌能以山梨醇唯一碳源，过量积累L-山梨糖。在发酵36h后，与出发菌株节相比将发酵时间缩短了 12h。这ー调节微生物细胞中山梨醇脱氢途径，促进代谢流快速流向代谢产物，实现代谢产物过量积累的策略，为エ业生物技术特别是采用代谢工程手段改造菌株来提高目的产物的生成提供了新的技术思路。
具体实施例方式实施例I重组菌G. oxydans 621H_sldh的构建及鉴定通过化学全合成法合成sldh基因，并将其克隆到表达载体ppBBRlMCS-2。构建好的重组质粒经酶切分析，并进行DNA测序。基因测序结果与预期一致，表明重组质粒构建正确。将重组质粒ppBBRlMCS-2-sldh利用电激法转化G. oxydans 621H感受态细胞，将能在山梨醇培养基+Ceporex+Kan平板上生长的菌落,在山梨醇+Ceporex+Kan平板上连续转接三代，得到遗传稳定的重组子。挑取阳性重组子若干提基因组，进行PCR验证，得到大约9. 2kb的片段，表明sldh基因已成功整合到G. oxydans 621H基因组中。所得重组菌命名为G. oxydans621H_sldh。该菌在以山梨醇为卩隹ー碳源的培养基上生长时，山梨醇脱氢酶活性显著提高，是出发菌株的I. 33倍。其中山梨醇培养基山梨醇150g，酵母膏6g，CaCO3 2g，pH 4. 8-5. 1，固体培养基添加20g琼脂。
山梨醇+Ceporex+Kan平板山梨醇培养基+IOOmg头孢霉素+IOOmg卡那霉素，固体培养基添加20g琼脂。
实施例2重组菌G. oxydans 621H_sldh底物浓度的优化根据G. oxydans 621H-sldh的培养特性，以不同初始浓度的山梨醇为碳源进行发酵实验，并相互比较，根据实验结果和原料成本综合考虑，当山梨醇添加量为250g/L吋，山梨糖的生产强度最高，エ艺的经济指标最优，此时山梨糖的产量达225g/L。实施例3山梨醇为唯一碳源时重组菌与对照菌发酵特性的比较以山梨醇为唯一碳源，发酵36h后，重组菌和对照菌相比(I)重组菌中山梨醇脱氢酶的活性提高了 I. 33倍；(2)以山梨醇为唯一碳源，发酵36h后，L-山梨糖产量达到225g/L，与出发菌株节相比将发酵时间缩短了 12h。过量表达sldh基因有效地加快了山梨醇脱氢步骤的速度，使L-山梨糖快速生成并过量积累。可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
权利要求
1.一种采用自克隆工程菌高效发酵生产L-山梨糖的方法，其特征在于以氧化葡萄糖酸杆菌工程菌为生产菌株，接种到种子培养基中，500mL摇瓶装液50mL，于30° C、200rpm条件下培养20-24h ;按15%的接种量将培养好的种子接入发酵培养基，30° C，200rpm条件下培养36h ;所述氧化葡萄糖酸杆菌工程菌过量表达外源山梨醇脱氢酶基因，其构建方法为通过化学全合成方法获得Genbank:NC_006677. I所示山梨醇脱氢酶基因，克隆到表达载体pBBRlMCS-2，进一步转化氧化葡萄糖酸杆菌获得自克隆基因工程菌。
2.根据权利要求书I所述的方法，其特征在于种子培养基组成为山梨醇150g，酵母膏6g，CaCO3 2g，pH 4. 8-5. 1，自来水定容至 1L。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于发酵培养基组成为山梨醇250g，酵母膏2g，CaCO3 2g，pH4. 8-5. 1，自来水定容至 1L。
全文摘要
本发明公开了一种采用自克隆工程菌高效发酵生产L-山梨糖的方法，属于采用代谢工程调控策略优化发酵过程技术领域。本发明采用代谢工程的手段，获得自克隆氧化葡萄糖酸杆菌工程菌，以其为生产菌株，通过发酵工艺优化使山梨醇脱氢酶的活性提高了1.33倍；(2)以山梨醇为唯一碳源，发酵36h后，L-山梨糖产量达到225g/L，与出发菌株节相比将发酵时间缩短了12h。本发明通过调控山梨醇脱氢途径，成功实现了山梨醇快速化地导向目标代谢产物山梨糖的目的。为今后利用代谢工程手段改造菌株促进目标产物过量积累提供了一定的借鉴意义。
文档编号C12N15/53GK102660599SQ201210145148
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月10日 优先权日2012年5月10日
发明者周景文, 堵国成, 王小北, 陈坚 申请人:江南大学