Tat蛋白转导域修饰的nep1-40融合蛋白及其应用的制作方法

专利名称：：Tat蛋白转导域修饰的nep1-40融合蛋白及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于蛋白转导领域，具体涉及将TAT与NEP140融合制备TAT-NEP1"W)融合蛋白。同时，本发明还涉及TAT-NEP1眉融合蛋白穿过细胞膜并穿透血脑屏障，用于中枢神经系统损伤的治疗。
背景技术：
：创伤、中风、脑出血、脊髓损伤等具有高死亡率和高致残率的特点。如何降低神经功能受损程度和如何更好地使受损神经元功能得到更好地改善，提高患者的生存质量，对患者及其家庭、社会都有重要意义，是一个世界性的难题。目前，对于CNS损伤引起的神经功能障碍尚无有效治疗药物。因此，寻找新型有效的治疗脑CNS损伤药物是研究热点。以往普遍认为成年晡乳动物中枢神经系统(centralnervoussystem^CNS)损伤引起的神经功能障碍难以恢复的主要原因为神经元不能再生。近二十年来的研究已有突破性进展，目前认为CNS再生困难的原因除促迸再生的营养因子不足外，另一重要的原因是中枢的抑制性再生环境。近几年来，主要抑制受损神经再生的基因一Nogo及其受体(Nogoreceptor,NgR)的发现，为CNS损伤的研究掀开了新的一页，被誉为是"探索中枢神经损伤修复漫长道路中的一个里程碑"。新ffiNeuron发表的研究，应用基因敲除(knockout)技术，发现敲除NogO"A和NgR改善脊髓损伤后再生和可塑反应，应用NgR拮抗剂(N^lecto)治疗，^it轴突再生和脊髓损伤的功能恢复。同样应用Nogo^A抗体ON",7B12)和NgR拮抗剂(NgRecto)治疗，显著改善MACO导致的行为学结果，促迸轴突可塑性。为此，Lee等在《NatureReviewDrugDiscovery》撰写"TargetingtheNogoreceptortotreatcantralnervoussysteminjuries"的论文，提出"N承asadrugdiscoveiytarget",认为以调飾gR为治疗目标，可大大促进CNS损伤后神经元的功能恢复，逆转其灾难性的后果。目前NgR成为CNS损伤领域的研究热点和关注焦点，认为阻断它可影响脑缺血的发展和结果，,和增强神经功能恢复。Nogo^66是Nogo-A分子胞外的袢状结构，与NgR结合从而触发下游信号通路阻断神经的再生。NEP1^40(Nogoextracellularpq)tideresidues140)是No^66氨基端40个残基组成的多肽，保留WNogo^6^NgR结合的能力，但不触发下游的信号转导途径。NEP140作为NgR^抗剂已经应用于脊髓损伤动物模型，可以促进皮质脊髓轴突的生长和5-羟色胺能神经纤维的出芽，并上调轴突生长蛋白SPRR1A以及突触的形成,可以显著促进实验动物运动功能的恢复。NEPl-40^为NgR拮抗剂，具有高选择性和有效性使其有望成为治疗脊髓损伤、脑外伤、中风和慢性进行性多发性硬化等轴突再生障碍性疾病的新药。然而，目前研究中所使用的NEP1"40都是经化学合成，其成本较高，且由于血脑屏障(BBB)、血脊屏障、细胞膜等的存在，大于6个氨基酸的多肽一般不能穿过这些屏障，而达不到有效的药物治疗浓度，目前主要是通过显微定位注射或植入微型泵等手术的形式给药。显微注射存在诱发脑内出血等潜在危险，并且只能维持短时期；植入微型泵,，但存在难以通过血脊屏障、血脑屏障的问题，使NEP140的进一步研究和临床应用受到了极大的限制。因此，在研究和临床中应用NEP1"40的首要障碍是怎样使之穿过血脑屏障并达到相应的生物学浓度，为此如何获得高纯度、低成本并能穿过血脑屏障的NEP1^40是神经科学研究中的热点。蛋白转导技术是近几年来运用得比较广泛的一种技术，可以将分子量超过IOOkD的蛋白质或其他物质穿过细胞膜，甚至穿过血脑屏障。其原理是，利用蛋白转导结构域(proteintransductiondomain,PTD)与目的分子共价连接，将目的分子转导进入生物膜结构。蛋白转导域是指具有能介导蛋白质跨膜转运的结构域，已经证明HIV-I的反式激活转导蛋白TAT(Transactivatingtransductionprotein)的蛋白转导域，能够高效穿过生物膜的结构域，将与其共价连接的多肽、蛋白质及DNA等分子跨膜导入几乎所有的组织和细胞，转导效率很高而且对细胞没有损伤。蛋白转导技术在神经科学的研究中尤为重要。中枢神经系统内的细胞及细胞间生理反应的主要调节物质为多肽及蛋白质，因此肽类或蛋白类大分子药物在CNS疾病的治疗中具有重要意义，但由于肽类或蛋白类大分子药物难以通过BBB进入脑组织及细胞内，从而影响了此类药物的研究与发展。因此，如何有效地将此类药物通过BBB,呈递入脑组织成为基础及临床工作者日益关注的研究课题。TAT蛋白转导作用的发现为大分子药物呈递入脑组织提供了有效的途径，研究表明TAT-PTD可以使5-U0kD的蛋白质或其他物质穿过细胞膜，甚至穿过血脑屏障。Schwarze等通过腹腔给小鼠注射分子量为120kD含有TAT蛋白转导结构域的^半乳糖苷酶(TAT务galactosidase)后，发现^半乳糖苷酶可以进入到各种组织，包括大脑组织》目前，TAT蛋白转导技术已经成功将GDNF、Bcl-2、JIP等功能蛋白转导进入CNS。
发明内容本发明的目的是提供一种用于CNS损伤治疗的TAT-NEP1"40融合蛋白，它由人类免疫缺陷病毒的TAT-PTD与NEP1"40组成,包含NEP1"40多肽和TAT-PTD并具有SEQ.NO.l所示的氨基酸序列MRGSHHHHHHGMASMYKGVIQAIQKSDEGHPFRAYLESEVAISEELVQFCYSNS本发明的另一个目的是提供一种用于CNS损伤治疗的TAT-NEP1"40融合蛋白的制备方法。即将TAT-PTD与NEP140融合制得，包含下列步骤(1)选用含人类免疫缺陷病毒的TAT-PTD序列的pTAT-HA表达载体(含限制性内切H/Vc"I^U^oD;(2)合成NEPl-40的引物序列对(内含7/w1和1^>I的酶切位点)合成引物序列对；(3)PCR扩增NEP140目的基因片断，NEP140序列两端分别含有Wco[和息I的序列；(4)用限制性内切酶iVtoI和屈oI分别酶切pTAT-HA和PCR^物，并分别回收酶切产物；(5)将两种酶切产物用T4连接酶连接，通过克隆筛选得到pTAT-NEPl-40表达载体。所述用于构建pTAT-NEP1^40重组质粒的TAT-PTD的核苷酸序列为ATAGGCAGGAAGAAGCGTAGACAGAGACOTAGA。所述目的基因的重组质粒，载体为pTAT-NEP140。重组质粒经过DNA测序分析正确后，转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，挑选58个阳性的菌落克隆在氨苄抗性的LB培养基中，用1PTG预诱导表达TAT-NEP1^40融合蛋白；表达后的全菌蛋白用SDS-PAGE、考马斯亮兰R250染色，确定诱导表达的条件和阳性菌落克隆，然后在1622t;,0.2mMIPTG条件下大量表达蛋白。诱导表达蛋白的细菌经过超声破碎菌体，释放出目的蛋白后，经过N漓子整合的亲和层析柱纯化，纯化后的蛋白经过超滤浓縮为2mg/ml，存放在-70"C的冰箱中，经蛋白免疫印记实验和蛋白质N^I测序证明，其氨基酸序列如SEQ.NO.l所示。本发明的特点是将来源于人类免疫缺陷病毒HIV-ITAT的蛋白转导域(proteiiitransductiondomainPTD)与NEP1"40融合，构建pTAT-NEP140重组质粒》经表达、纯化得到具有生物活性的TAT-NEP140融合蛋白。所述的一种用于CNS损伤治疗的TAT-NEP140融合蛋白，在晡乳动物细胞水平上作为蛋白药物治疗工具。TAT融合蛋白系统是一种很好的蛋白传送工具，打破了蛋白质通常只能通过细胞表面受体和信号转导途径将所携带的生物信息传递到细胞内的规律，能有效解决大分子蛋白质不能穿透血脑屏障(BBB)的问题，在临床应用大分子药物治疗脑血管疾病中具有广阔的应用前景。本发明利用TAT介导蛋白质的方法，将TAT-PTD的编码基因与外派蛋白NEP1"40基因连接，表达融合蛋白，所得到的TAT-NEP1-40融合蛋白不仅保留了TAT原有的穿透力，而且不影响外源蛋白的活力。本发明在体外培养的PC12细胞、采用免疫荧光组织化学分析TAT-NEPl眉融合蛋白的细胞膜转导作用，并应用MTT法和流式细胞仪(FCM)评估TAT-NEP1^40对氧糖剥夺(OGD)PC12细胞的保护作用，结果显示TAT-NEP1^40融合蛋白可穿过细胞膜进入PC12细胞内，并可提高OGD诱导的PC12细胞活性和存活率，表明TAT-NEP1^0融合蛋白具有细胞膜转导作用，对PC12细胞具有明确的保护作用。同时，本发明将纯化后的TAT-NEP1"40通过腹腔注射的方式给药，检测TAT-NEPl-40融合蛋白能否转导入脑组织并对短暂性局灶脑缺血是否具有保护作用，免疫荧光组织化学结果显示，融合蛋白TAT-NEP1"40、TAT-p^Gal在大鼠脑组织细胞均呈阳性反应，而注射NO"TAT^Gal融合蛋白的大鼠脑组织均为阴性反应，说明TAT可介导蛋白质通过血脑屏障转导入脑组织，而且TAT-NEP1^40可显著改善局灶臃缺血引起的神经功能障碍、减少梗死容积和神制神经元凋亡，表明TAT-NEP140具有蛋白转导作用可进入脑组织，对局灶性脑缺血损伤具有保护作用。本发明所述TAT-NEP1^40融合蛋白保留了NEP140对NgR的选择性拮抗活性，具有转导效率高、透过BBB的优点，克服了NEPl-40的局限性，用于脑损伤治疗，可以避免显微注射或植入微型泵的方式注射NBPJ-40引起神经组织额外伤害以及NEP1^40难以通过血脊屏障、血脑屏障不能达到相应的生物学浓度的不足，可用于包括脑缺血缺氧、脑出血、脑创伤、脊髓损伤等多种CNS损伤的治疗。下面结合实施实例附图对本发明做进一步说明。图1是TAT-NEP1^I0融合蛋白表达和纯化蛋白示意图。图1A为SDS-PAGE分析TAT-NEP1"40融合蛋白表达和纯化；图lB为WestemWot分析纯化的TAT-NEP1"40融合蛋白；图IC为WesternWot分析纯化的No^TAT-p"Gal、TAT"P-Gal和No-TAT-NEPi"40蛋白。图2是TAT-NEPl-40融合穿^^BfliM转导入PC12细胞内示意图。不同融和蛋白与PC12细胞孵育1h,免疫荧光染色分析。A为正常对照PC12细胞、B为与TAT-NEP140孵育的PC12细胞、C为与NoTAT-NEP140孵育的PC12细胞、D为与TAT-fW3al孵育的PC12细胞、E为与No-TAT-P"Gal蜉育的PC12细胞，Scalebars=l00jira.tt图3是TAT-NEP1^40融合穿过血脑屏障转导入脑组织内示意图。腹腔注射邻nmol的TAT务Gal、TAT-NEPl"40和No-TAT-NEP1^40后lh，4h和12h,SD大鼠的，取出行Westemblo沐免疫荧光染色分析。图3A为Westernblot分析结果；图3B为免疫荧光染色分析结果，箭头表示免疫荧光阳性细胞，Scalebars=lOO(jm。图4是TAT-NEP1-40对氧糖剥夺诱导的PC12细胞损伤的保护作用示意图。细胞活力应用MTT比色法评估，细胞死亡应用tryp肌blue染色分析。图4A为MTT比色法測量的细胞活力，与Control组比较，*i><0.05,与OGD组比较，#尸<0.05;图4B为ttyp加blue染色分析測定的细胞死亡，与Control组比较，*P<0.05，与OGD组比较，#/><0.05。阁5是TAT-NEPl-40对脑梗死容积的影响示意图。图5A为各组代表性的TTC染色，白色为脑梗死区域；图5B为各组脑梗死容积(mm3)，与Control组比较,〈0氛图6是TAT-NEP1^0对脑缺血后神经元凋亡的影响示意图。AH为各组脑缺血区代表性的TUNEL染色，箭头表示TUNEL阳性细胞，A和E为Control组，B和F为TAT-NEP140组，C和G为NO"TAT-NEP140组，D和H为TAT-^Gal组》Scalebars=HX)jim。图7是Control组、TAT-NEP1"柳组、NcnTAT-NEPl"40组和TAT-P"Gal组脑缺血区TUNEL阳性细胞数和正常细胞数示意图。与Control组比较，具体实施例方式下面结合具体实例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(NewYo汰:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件；又如David等人，细胞实验指南(NewYoric:ColdSpringHarborLaboratoiyPress,1998)中所述的条件。(一>、TAT-NEPl-40融合蛋白的表达、纯化及复性K大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCb法)(1)挑取大肠杆菌DE3单个菌落于5ml无Amp的LB培养基，37"C培养过夜*(2)以2%的体积比扩;^养2.5h，至细菌对数生长期(OD值约为0.4)。(3)冰浴lOmin，5,000rpm离心lOmiri收菌。(4)加入l/2体积冰预冷的CaCl2((Umo!/L)，重悬，冰浴15min。(5)5,000ipm离心5min,加入l/25体积冰预冷的CaCl2(0.1mol/L)，重悬。加入50%甘油混匀，-70°0:储存。2、转化重组表达质粒转化DE3感受态细胞。含Amp的LB平板37'C预热30min,取ljil质粒加入100nlBL21感受态细胞中冰浴5min，然后均勾涂布在含100mg/LAmp的LB平板上，在3"C孵箱孵育过夜，直至长出细菌单克隆。3、蛋白诱导表达挑取单克隆菌株到5ml含AmpU00mg/L)的LB培养基中，3"C振荡培养过夜，次日按l:40转接，培养至OD600为0.40.6h,加入O.1mmolIPTG诱导4h，使目的蛋白表达。H)，000rpm冷冻收菌。4、重组蛋白的可溶性分析(1)按lg湿菌重悬于lOml裂解缓冲液中，加入PMSF至终浓度为IOmmol/L,冰浴超声裂菌，每次15s,间隔30s,至菌液由乳白色变为暗青色为止。(2)4WC、i2，000rpm离心30min;分别取上清和沉淀加入3xSDS上样缓冲液，煮沸5min变性，12,000rpm离心10min。(3)分别取变性后的上清和沉淀样品迸行SDS-PAGE(15M)电泳分析。5、蛋白的亲和纯化(1)TAT-NOM^40的包涵体充分溶解在6mol/LGaHCl溶液中，12，000ipm冷冻离心20min,取上清。用22nm滤膜过滤上清。(2)用100ml洗涤液平衡Ni-NTA柱，将过滤后的上清上样，流速控制为(3)用JOOml洗涤缓冲液洗涤融合蛋白，以除去##异性结合的杂蛋白。(4)用适当体积的洗脱缓冲液洗脱融合蛋白。6、蛋白质的复性将洗脱后的蛋白质溶液用包涵体洗脱缓冲液稀释，使蛋白浓度调整至1mg/ml左右，然后将等体积的包涵体蛋白复性稀释液(20ramoI/LTris-Ha+10g^Arg+lmmo!/LEDTA)缓慢滴加入变性蛋白溶液中至蛋白终浓度为0.5m^ml左右，尿素浓度为3mol/L。将稀释后的蛋白溶液置入截流分子量为5kD的透析袋内，IS^JS析液I(2mmol/LUrea+20mmol/LTris-HCl+i0g/L-ArgHmmol/LEDTA)中在4°€搅拌透析8h;换透析液U(1mmol/LUrea+20mmol/LTris-HCH10g/LArg+lmmol/LEDTA)4。C搅拌透析8h;换包涵体蛋白复性稀释液4T搅拌透析8h,最后换PBS(含10M甘油)4T搅拌透析8h，冷冻离心取上清分装存放于-7(fC冰箱。7、融合蛋白的定量(1)用BCA法进行蛋白定量。(2)SDS^PAGE凝胶在考马斯亮兰液中染色lh后，用脱色液脱色充分脱色直至背景无色，用薄层扫描仪分析纯化蛋白的纯度。8、实验结果(1)、融合蛋白TAT-NEP1"40的表达pTAT-HA/NEP140菌株经IPTG诱导、蛋白电泳分析，在分子量约14kD处有一条明显的深染新生带，与预期结果相符。经薄层灰度扫描结果表明，TAT-NEPl-40表达量占菌体总蛋白的31.590/0。蛋白电泳分析结果显示，融合蛋白TAT-NEP1"40主要以包涵体的形式表达。图1A为SDS-PAGE分析TAT-NEP1-40融合蛋白表达和纯化；图IB为Westernblot分析纯化的TAT-NEP1"W)融合蛋白；图1C为Westernblot分析纯化的No-TAT-P"Gal、TAT-P"Gal和lSkHTAT-NEP1^40蛋白(2)、TAT-NEP1^40融合蛋白的纯化结果用细菌裂解缓冲液充分悬浮细菌，冰浴下超声、裂解物冷冻离心，收集包涵体。用6mol/L的盐酸呱溶解包涵体，离心收集上清。22pm滤膜过滤，用镍离子亲和层析柱层析，用250mmol/L咪唑溶液进行洗脱，收集洗脱峰。SDS-PAGE分析纯化蛋白，薄层灰度扫描结果显示纯化后的蛋白纯度为953%。(3)、变性蛋白的复性的结果盐酸呱变性条件下，纯化后的TAT-NEP1^40融合蛋白经透析可以获得复性，BCA法测定蛋白浓度为170jig/mL。(二)、TAT-NEP1^40蛋白转导功能的鉴定1、TAT-NEP1眉融合蛋白跨膜转导的鉴定PC12细胞在DMEM培养基(添加50mL/L的胎牛血清和100mL/L的热灭活马血清)中培养和传代。将PC12细胞以2xl05个/mL的密度接种于内置玻片的24孔培养板，置于37°<2、5%€02的培养箱中培养。待细胞贴壁后(24h),分别加入TAT-NEP1^40、TAT-^Gal(作为阳性对照)和No-TAT-p"Gal(作为阴性对照)三种融合蛋白至终浓度为800nmoi/L。置于3"C，5%€02的培养箱中培养60mia，于冰上吸去培养液，4T的PBS(pH7.4)洗涤贴壁细胞三次以上，每次5min^每孔加入4%多聚甲醛置冰上固定30min。再以4°€PBS洗洚IOmin，加入10mL/L的驴血清于3，C封闭30min,4。C的PBS洗涤10min后，加入抗6x3ffis鼠源单抗(l:2000)37T孵育60min后，PBS洗涤，加入FITC标记的驴抗鼠IgG(l:400)，37T孵育60min。以PBS洗30min后，用含50QmliL的甘油的PBS封片，于BX60荧光显微镜观察并采图。2、TAT-NEP1^40融合蛋白穿过血脑屏障的鉴定9只SD大鼠随机分为3组TAT-NEP1"40组、TAT-P-Gal组和NO"TAT-p-Gal组(《=3)，每组大鼠分别腹腔注射10nmol的TAT-NEPl-40、TAT+Gal(阳性对照)和NO"TAT-fW3al(阴性对照)融合蛋白，6h后，用2%戊巴比妥钠深麻醉，迅速开胸经左心室至升主动脉插管，先以生理盐水洗去血液，随后用冷的(^C)含4M多聚甲醛的0,lmol/L磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4)先快后慢灌流固定2h,然后取脑置于20%蔗糖冲(4°0值至组织沉底。冰冻切片机切制连续冠状切片，片厚l4jun，置于-2(TC存放。切片加入封闭液室温封闭lh，加入抗6x扭s鼠源单抗(J:2000),放入4T冰箱过夜。取出后PBS洗涤3次，每次5min,加入FITC标记的驴抗鼠IgG(l:400),避光，室温反mh。再用PBS适度洗涤，封片后在JBX60荧光显微镜下观察并采图。3、结果(1)TAT-NEP140融合蛋白跨膜转导加入融合蛋白到PC12细胞培养液中至800nmol/L，孵育lh,4%多聚甲醛固定细胞，用抗6xHis小鼠单抗行免疫荧光染色，结果观察到加入TAT+Gal和TAT-:NEP1^40孵育的PCI2细胞胞体均明显着色，而加ANo^TAT-P-Gal孵育的PC12细胞没有明显着色，结果说明我们表达纯化的TAT-NEP1"40具有蛋白转导活性，见图2,图中A为正常对照PC12细胞、B为与TAT-NEP1"40孵育的PC12细胞、C为与N(HTAT-NEP1^40孵育的PC12细胞、D为与TAT"P-Gal孵育的PC12lffl胞、E为^lSlo^TAT-P"Gal孵育的Pa2细胞oScalebars-l00pm.(2)TAT-NEP1"40穿过血脑屏障免疫荧光组织化学结果显示融合蛋白TAT-NEP1^40、TAT-P七al在大鼠脑组织细胞均呈阳性反应，而注射No-TAT-P"Gal融合蛋白的大鼠脑组织均为阴性反应，说明TAT可介导蛋白质通过血脑屏障，见图3。腹腔注射40nmol的TAT-P"Cki、TAT-NEPi"40柳O"TAT-NEP140后lh，4h和12h,SD大鼠的大脑取出行Westerablot和免疫荧光染色分析。图3A为Westemblot分析结果；图3B为免疫荧光染色分析结果，箭头表示免疫荧光阳性细胞，Scalebars-100(三)、TAT-NEP^40对体外氧糖剥夺(OGD)PC12细胞的保护作用1、PC12细胞的，大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞株是中国科学院上海细胞生物研究所提供。采用DMEM培养液(5%胎牛血清，5%^血清，青霉素钠200U/ml,链霉素100U/ml,pH7.40)将神经生长因子培育分化的PC12细胞，传代至实验所需的细胞培养板或培养器中，放入0>2细胞培养箱(37°<:，含5%€02的空气)培养。取生长期PC12细胞用于实验。2、PC12细胞OGD模型的建立及药物处理取生长期PC12细胞，将培养液换成无糖DMEM培养液，用95崩^5%€02混合气驱赶培养液和培养板中的空气，严密封口后，置于37。C含95%Nr5%C02的密闭培养箱中，建立细胞OGD模型(模拟缺血)，4h后取出培养板，更换常规DMEM培养液，并恢复正常培养环境(模拟再灌注)继续培养。更换正常培养液时，分别加入40nM的TAT-NEP140、No-TAT-NEPl<40、TAT-P^Gal和NO"TAT-P"Gal。每组12孔，培养24h后，行各项检测。2、MTT比色法測定PC12细胞活力培养24h后，每孔加入1(^MTT，继续培养4h，弃去上清液，每孔加入lOOnl的DMSO(二甲基亚砜)溶液终止MTT反应，反复振荡30min，直至MTT反应的蓝色结晶产物完全溶解。用DynatechMR4000型微板读数仪測每孔OD值，检测波长为570nm。根据公式计算各种因素引起的PC12细胞的活力细胞活力气实验组OD值-空白对照组OD值)/(正常对照组OD值-空白对照组OD值>100%3、流式细胞仪(FCM)测定培养24h,采用AnnexinV/PI双染色法FCM测定并计算正常细胞数占总细胞的百分比(％)。4、实验结果U)MTm溯定TAT-NEPl-40对PC12细胞缺氧的保护作用与正常PC12细胞的活性相比，OGD明显降低PC12细胞的活性(/^0.01);与OGD组PCl2细胞的活性相比，TAT-NEP1^40组PC12细胞的活性显著增加(/><0.05)，而TAT^"gal组和No-TAT-p"gal组细胞活性与OGD组间无显著性差#(/>>0.05)，表明TAT-NEP140对OGD诱导的PC12细胞损伤有保护作用，见图4，图中细胞的活性应用MTT比色法评估，细胞死亡应用tiypanbhie染色分析》图4A为MTT比色法测量的细胞活力；图4B为trypanblue染色分析测定的细胞死亡a(2)FCM测定TAT-NEP1"40对PC12细胞缺氧的保护作用FCM结果显示TAT-NEP140对OGD诱导PC12细胞损伤有保护作用，而应用TAT+gal和No^TAT+ga!没有保护作用(见表l)。这与MTT法的结果相一致，表明TAT-NEP1"40对OGD诱导PC12细胞损伤有^呆护作用。表lFCM法澜得的正常细胞百分比，<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>与oGma比较，*p<o.o5(四)、TAT-NEP1^0对脑缺血再灌注损伤的保护作用1、动物分组32只雄性SD大鼠，体质量(300^50)g，由第四军医大学实验动物中心提供，随机分为4组对照组《Omtrol)、TAT-NEP1~40组、No-TAT-NEPl-40组和TAT-p"Gal组("=8)。大鼠局灶脑缺血模型同前，各组分别于栓塞120min后再灌注Bt腹腔注射PBS(pH7.3)4ml、TAT-NEP140、No-TAT-NEP140和TAT-p>Gal(均为40拜ol溶解于PBS4ml)。2、脑缺血模型制作大鼠术前禁食12h，不禁水。大鼠用4%异氟醚诱导麻醉，2%异氟醚吸入维持麻醉深度，保留自主呼吸。术中体温由肛温探头连接多功能监测仪监测，并用烤灯维持在3737，C。参照我们以前的报道，大脑MCAO模型采用右侧颈内动脉尼龙线线栓法，即动物麻醉后取颈正中切口，暴露右侧颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉，结扎颈总动脉、颈外动脉，于颈总动脉分叉下方剪一切口，将一预先用乙醇灯烧成圆头的尼龙线(3-0，Ethicon，日本)置入颈内动脉17.5mm，直到有轻微阻力感为止。栓塞120nrin后抽出尼龙线，恢复再灌注，缝合皮肤。大鼠麻醉苏醒后放回鼠笼，自由饮食。3、神经行为学评估脑缺血再灌注24h后，采用双盲法由一位不了解分组情况的观察者评估并记录行神经功能缺损评分(NDS):0级，无功能障碍；l级，不能伸展左侧前肢;2级，向左侧旋转；3级向左侧倾倒；4级，无自主活动伴意识抑制；5级，死亡》评分介于两级之间时，取两级的均数。4、脑梗死容积測量再灌注24h后，动物用2%戊巴比妥钠深麻醉后处死，迅速取出鼠脑，置于冰盐水中IOmin，取冠状面均匀切成2mm厚脑片，迅速放入2%1*1€溶液(37D中染色30rain，然后用4%多聚甲醛缓冲液固定。24h后用数码相机(Kod成DC240,USA)拍照，输入计算机，用图像处理软件(Adobe，Photoshop7.0)计算梗死面积(粉红色区为正常脑组织，白色区为梗死区)，各脑片梗死面积之和乘以厚度(2mm)为总的梗死容积。4、组织切片制备大鼠脑缺血再灌注后24h，在深麻醉下开胸暴露心脏，经升主动脉插管剪开左心耳，用生理盐水100mL左右快速冲洗，随后用4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液(4。C，pH7.4)灌注约400mL固定，前三分之一快灌，后三分之二缓慢灌注，灌注完后小心取出大脑，浸A20Tn蔗糖溶液，放置于4T冰箱中至脑沉于底部。用冷冻切片机切成14ijm冠状位切片，-20*€保存切片。5、TUNEL染色TUNEL技术，即脱氧核苷酸末端转移酶(Terminaldeoxynucleotidyltransferase,TdT)介导的X"dUTP缺口末端标记(TdT-mediated-x^iUTPnickendlabeling^TUNEL)技术，是目前原位检测细胞凋亡最敏感、快速、特异的新方法，已广泛用于生物、医学研究领域。实验歩骤按TUNEL试剂盒操作进行。DAB显色15min,酒精梯度脱水，二甲苯透明后，封片。TUNEL染色后的大鼠脑片^BX60显微镜下观察并采图。6、实验结果(l)神经功能缺损评分缺血再灌注24h后，Control组、No-NEP140组和TAT-^Gal组大鼠均表现为典型的大脑中动脉栓塞症状如同侧霍纳征和对侧肢体不同程度的神经功能缺损，如不能伸展患肢、行走时向左侧转圈，个别出现向左侧倾倒，而TAT-NEP1"40组神经功能缺损症状明显减轻。Control组、NEPl^W)组和TAT-,组神经功能缺损评分的中位数为2,而TAT-NEPl-40组为1,统计学分析显示TAT-NEP1-40组神经功能缺损评分明显低于Control组、NEP1"40组和TAT4-Gal组(户=0.002和0.004)，而Control组、NEP140组和TAT-p"Gal组比较无差别(i^0.9(B)，见表2。表2.4组动物的神经功能缺损评分(ii=)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>与OGD组比较，*尸<0.05(2)脑梗死容积图5A为各组一只大鼠缺血再灌注24h后的脑切片(2mmx6)，粉红色区为正常脑组织，白色区为梗死区。缺血再灌注24h后脑梗死容积，对照组为(309.5±36.4)iran3、TAT-NEPl-40组为(107.6i23.1)mm3、NO"TAT-NEP1"40组为(296.2±72.5>111113、TAT^-Gal组为(269.3:t68.0)mm3。TAT-NEPl-40组梗死容积明显小于对照组、NO"TAT-NEPl"40组和TAT-p-Gal组(/^0.002和0.004)，而ControL组、No-TAT-NEPl"40组和TAT-p"Gal组比较无差别(i^.903)，见图5B。图5A中为各组代表性的TTC染色，白色为脑梗死区域；图5B为4组脑梗死容积(mm3)。(3)TUNEL和苏木精染色TUNEL阳性物质位于细胞核内，由于所处的凋亡时期不相同，TUNEL阳性细胞表现为不同形态，有圆形、椭圆形、不规则形，也可见凋亡小体，为鬮形或椭圆形的深棕色小体，各组缺血侧均有明显凋亡的细胞，而非缺血侧脑组织可见少量散在的TUNEL阳性细胞。Contro跑TUNEL阳性细胞明显增多，棕色加深，可见凋亡细胞群，主要分布于梗死灶周围的纹状体及额顶叶皮质，相应的其正常神经元减少；而TAT-NEP1^40组TUNEL阳性细胞数比Control组明显减少，正常神经元增多(PO.01);No-TAT-NEPl"40组和TAT^HSai组的变化与Controi组相似，见图6和图7。图6中为各组脑缺血区代表性的TUNEL染色，箭头表示TUNEL阳性细胞，Scalebars-100图7为4组脑缺血区TUNEL阳性细胞数和正常细胞数。需要说明的是，本发明提供的附图是在显微镜或荧光显微镜下采集的细胞图片，为医学研究最清晰的图片，也不能应用计算机修改为黑白对比图片，因为只有根据不同的显色，才能判断实验的结果。以上实施例中未作详细叙述部分属于本行业或相关行业的公知技术，采用的设备是行业惯例设备。序列表SEQ.NOl:(TAT-NEP1-40)MRGS朋HHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDRWGSKLGYGRKKRRQRRRGGSTMRIYKGVIQAIQKSDEGHPFRAYLESEVAISEELVQKYSNS权利要求1、TAT蛋白转导域修饰的NEP1-40融合蛋白，其特征在于含有人类免疫缺陷病毒(HIV)的反式激活转导蛋白TAT(transactivatingtransductionprotein)的蛋白转导域(PTD)和Nogo分子胞外段氨基端前40个残基多肽(Nogoextracellularpeptideresidues140，NEP1-40)。2、根据权利要求1所述的TAT蛋白转导域修饰的NEP1"40融合蛋白，其特征在于，该TAT-NEP140融合蛋白包含NEP140多肽和TAT-PTD并具有SEQ.NO.l所示的氨基酸序列SEQ.NOl:(TAT-NEP1^40)SEELVQKYSNS3、根据权利要求1所述的TAT蛋白转导域修饰的PI40融合蛋白的制备方法，将TAT-PTD与NEP140融合制得，包含下列步骤(1)选用含人类免疫缺陷病毒的TAT-PTD序列的pTAT-HA表达载体(含限制性内切酶/VfcoI和H);(2)合成引物序列对(含限制性内切酶AfcoI和H);(3)扩增NEP1^40目的基因片断，NEP1^40序列两端分别含有M;o1和*I的序列；(4)用限制性内切酶WcoI和AZwI分别酶切pTAT-HA和PCR产物，并分别回收酶切产物；(5)将两种酶切产物用T4连接酶连接,通过克隆筛选得到pTAT-NEPl"40表达载体。4、根据权利要^3所述的TAT-NEP1"40融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述用于构建pTAT-NEP140重组质粒的TAT-PTD的核苷酸序列为ATAGGCAGGAAGAAGCGTAGACAGAGACGTAGA。5、根据权利要求3所述的TAT-NEP1^40融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述的目的基因的重组质粒载体为pTAT-NEP140。6、根据权利要求1所述的TAT蛋白转导域修饰的NEP1"40融合蛋白，其特征在于所述的TAT-NEP140融合蛋白用于CNS损伤治疗，在哺乳动物细胞水平上作为蛋白药物治疗工具。全文摘要本发明公开了TAT-NEP1-40融合蛋白的制备方法及其在治疗中枢神经系统(centralnervoussystem，CNS)损伤的应用。其特征是含有人类免疫缺陷病毒(HIV)的反式激活转导蛋白TAT(transactivatingtransductionprotein)的蛋白转导域(PTD)和Nogo分子胞外段氨基端前40个残基多肽(Nogoextracellularpeptideresidues1-40，NEP1-40)。本发明融合蛋白保留了NEP1-40对Nogo受体(Nogoreceptor，NgR)的选择性拮抗活性，具有转导效率高、易透过血脊屏障、血脑屏障的优点，克服了NEP1-40的局限性，可以避免显微注射或植入微型泵的方式注射NEP1-40引起神经组织额外伤害以及NEP1-40难以通过血脊屏障、血脑屏障不能达到相应的生物学浓度的不足。本发明可大量制备、成本低、活性高，用于包括脑缺血缺氧、脑出血、脑创伤以及脊髓损伤等多种CNS损伤的治疗，促进神经组织的再生和神经功能恢复。文档编号C12N15/49GK101418046SQ200810150899公开日2009年4月29日申请日期2008年9月10日优先权日2008年9月10日发明者熊利泽,强王,苟兴春,陈绍洋申请人:中国人民解放军第四军医大学