一种核苷酸疫苗的制作方法

一种核苷酸疫苗的制作方法
【专利说明】
[0001] 本申请是申请日为2006年11月30日、申请人为哥本哈根大学、发明名称为"一种 核苷酸疫苗"的中国专利申请200680045006. 4的分案申请。
[0002] 在申请中或者在本申请中所引用的所有专利和非专利参考文献，同样地以它们全 部的内容引入这里作为参考。
技术领域
[0003] 本发明涉及一种技术和方法，藉此，当应用病毒的和基于DNA的疫苗时，可获得更 快、更宽泛和更强的免疫应答。
【背景技术】
[0004] 尽管在免疫学领域中已具备当前的知识尤其是关于疫苗的技术，但是尚未获得适 于抗多种病原体的疫苗。广泛传播的HIV (人免疫缺陷病毒）、HTLV (人T细胞亲淋巴病毒）、 结核病和HCV (丙型肝炎病毒）的大流行病仍然是有效接种力所未及的，同时禽流感和其他 出现的病原体威胁着颠覆我们的卫生健康体系。同样地，世界范围恐怖主义的爆发已将潜 在的流行病扩大到包括外来的且致命的病原体诸如埃博拉病毒、拉沙病毒和马尔堡病毒。
[0005] 疫苗可以是预防性的：它们是在实际感染发生前就被施用，或是治疗性的：这样 它们引起或促进对已在体内病原体的免疫应答。接种的两种方法都需要建立稳固的免疫应 答。由感染或接种激活的免疫应答依赖于几种细胞类型的交互作用，该细胞类型诸如T、B 和抗原呈递细胞以及几种不同的分子，主要是抗原、MHC分子、T和B细胞受体，等等。
[0006] 抗原是肽片段，由MHC分子在抗原呈递细胞表面上呈递。抗原可以是外来的，即病 原性来源，或者源自生物体本身，因而称作自身或自体抗原。MHC分子是由特定染色体区域 编码的多态性基因家族的代表，被称为"主要组织相容性复合体"，即MHC。存在两种类型的 MHC 分子，MHCI 型（MHC-I)和 MHC II 型（MHC-II)。
[0007] 辅助性T细胞是由存在于抗原呈递细胞表面上的MHC II型（MHC-II)分子所呈递 的抗原而刺激。MHC-II分子是在内质网内合成的。在合成过程中，它们以防止MHC-II分子 被与自身或自体抗原一起负载的方式与恒定链（Ii)组合在一起。MHC-II分子经恒定链中 的信号序列被转运至特定细胞室（compartment)内的细胞表面。随着该室经处理它的内容 物的成熟，它从溶酶体进展到次级内体（在与内吞囊泡融合后）再到MHC II类室（MIIC)。 内吞囊泡包含外源抗原，即蛋白酶切割的细菌肽片段。这些片段是经它们的降解而制备的， 以便被负载到MHC-II分子。MHC-II分子是由恒定链以两部分处理而释放的，恒定链首先被 蛋白酶降解，在MHC-II结合域内只留下被称作CLIP的肽，然后用HLA-DM分子除去CLIP。 此时，MHC-II分子是游离的，以便于结合外源抗原并且在MIIC囊泡融合至质膜后将这些呈 递在细胞表面。这启动了体液的免疫应答，因为被呈递的抗原刺激了辅助性T细胞的激活， 反过来又以多种方式激活B细胞，它最终分化为抗体分泌细胞。
[0008] 细胞免疫应答被启动，当T细胞毒性细胞的T细胞受体识别了在抗原呈递细胞上 被结合至MHC I类分子的抗原时。MHC-I分子不与功能性类似于恒定链（其与MHC-II缔 合）的分子缔合。另外，MHC-I至抗原呈递分子的加工不同于MHC-II分子的加工，区别之 处在于MHC-I分子已在内质网中与抗原一起被负载。由MHC-I分子呈递的抗原主要是蛋白 质的蛋白酶体切割的肽片段，它已由抗原呈递细胞自身合成。这些蛋白可以是在细胞内拥 有的DNA编码的异常蛋白，或者是衍生于病毒或已感染细胞并寄生于它的蛋白质合成机器 的其他病原体的蛋白。涉及MHC I类的蛋白酶解系统存在于几乎所有的细胞中。
[0009] 两种类型T细胞的功能是明显不同的，如它们的名称所隐含的。细胞毒性T细胞消 除细胞内病原体和肿瘤，是通过直接的细胞溶解和通过分泌细胞因子诸如T-干扰素。主 要的细胞毒性T细胞是CD8 +T细胞，它还是抗原特异性的。辅助性T细胞也可以溶解细胞， 但是它们的主要功能是分泌细胞因子，该细胞因子提高了 B细胞（产生抗体的细胞）和其 他T细胞的活性，因此它们广泛地增强了对外源抗原的免疫应答，包括抗体介导的和细胞 毒性T细胞介导的应答机制。CD4 +T细胞是免疫应答中的主要辅助性T细胞表型。
[0010] 传统的疫苗依靠于完整的生物体，即已被杀灭的病原性菌株或者减弱病原性的菌 株。一方面，这些疫苗冒着引入它们被设计去预防的疾病的风险，如果减毒不充分或者如果 在疫苗制备过程中足够多的生物体经杀灭步骤而存活下来。另一方面，这种疫苗已减少了 传染性而且常常是免疫原性不足的，其导致源自接种的保护不充分。
[0011] 最近，分子生物学技术已被用于开发新的疫苗，基于来自病原性生物体的个体抗 原性蛋白。概念上，使用抗原性肽而非完整生物体可避免病原性，同时提供包含最大免疫原 性抗原的疫苗。但是，已证明选择给定蛋白或多肽的最佳抗原是困难的，此外，已发现，纯的 肽或碳水化合物趋于是弱的免疫原。
[0012] 遗传（DNA)疫苗是新的且有希望的候选者，用于预防性和治疗性两种疫苗的研 发。通过组合载体（即，裸DNA、病毒载体、减毒活病毒，等）的效能、抗原的表达水平以及重 组的抗原本身（即，高的或低的亲合性MHC结合物，结构决定子的选择用于或多或少地限制 T或B细胞库等）来确定后来发生免疫应答的强度。通常这被认为是正确的，即免疫记忆的 有效诱导需要或者得益于CD4 + (辅助性细胞）T细胞与CD8+ (细胞毒性的）T细胞和B细胞 的相互作用，它们介导了许多免疫记忆的作用。但是，常规DNA疫苗的一种潜在缺点是它们 在人体中的低免疫原性。这种低免疫原性的一种可能起因是细胞内所形成的抗原限制性进 入用于抗原加工和对辅助性T细胞呈递的MHC II途径。
[0013] 发明概述
[0014] 因此，本发明以提高应答动力学的方式解决了刺激免疫应答的问题，同时扩展和 改善了应答，此外，避免了现有技术中所述接种方法的上述缺点。尤其是，特此提供了一种 用于直接的、特异性和快速刺激免疫系统的新系统，以便改善所有动物的接种。
[0015] 这种问题是用本发明的实施方案解决的，它们的特征列于权利要求。根据本发明， 发现抗原融合至恒定链极大地加强了后来发生的抗病毒⑶4 +和⑶8 +T细胞应答。此外，令 人惊奇地发现，这种作用是通过CD4+T细胞独立性机理而获得的。进一步还发现，这种保护 在急性局部化且致命性感染中不仅被加速而且被加强，和在高剂量系统性感染中被加强。
[0016] 因此，本发明的一个目的是提供一种核酸构建体，其包含编码以下的序列：至少一 个恒定链，该恒定链在操作上被连接至至少一个抗原性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的抗 原性片段。
[0017] -方面，本发明还提供了一种腺病毒载体，其包含编码以下的核苷酸构建体：刺激 免疫应答的、至少一个抗原和至少一个蛋白或者肽或者蛋白或肽的片段。
[0018] 因此，一方面，本发明提供了用腺病毒载体刺激MHC-I介导的免疫应答的手段，该 载体包含编码至少一个抗原和至少一个蛋白或者肽或者蛋白或肽的片段的核苷酸构建体。
[0019] 另一方面包括了用腺病毒载体刺激MHC-II应答，该载体包含编码至少一个抗原 和至少一个蛋白或者肽或者蛋白或肽的片段的核苷酸构建体。
[0020] 另一方面，本发明提供了刺激核酸构建体、腺病毒载体、任意这些或任意这些的任 意部分内所编码蛋白的细胞间传播的手段。
[0021] 本发明的另一个目的是提供一种包含如这里所详述核酸构建体的传输媒介物，特 别是与本发明相关的一种传输媒介物，例如复制缺陷腺病毒载体。
[0022] 本发明的另一个目的和方面是提供一种细胞，其包含根据本发明的核酸构建体或 腺病毒载体。
[0023] 本发明的另一个目的是提供一种嵌合蛋白，如这里所述核酸构建体所编码的或者 这里所述腺病毒载体所编码的。
[0024] 本发明的另一方面是提供一种抗体，其识别由这里所述的核酸构建体或腺病毒载 体所编码的嵌合蛋白。
[0025] 本发明的一个方面是提供一种疫苗，其包含如这里所详述的核酸构建体或腺病毒 载体。本发明特别涉及一种疫苗，在该疫苗中至少一个恒定链在操作上被连接至刺激MHC-I 应答的、至少一个蛋白或者肽或者蛋白或肽的片段。这可以经由在操作上将至少一个恒定 链与至少一个抗原性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的抗原性片段相连接而实现。
[0026] 本发明的另一个方面是提供一种疫苗，其包含如这里所详述的核酸构建体或腺病 毒载体内所编码的嵌合蛋白。
[0027] 本发明的另一个方面是提供一种成套试剂盒（kit in parts)，所述试剂盒包括包 含如这里所述腺病毒载体或核酸构建体的疫苗组合物，同时带有医疗仪器或者将所述疫苗 施用的其他手段，以及另外的关于如何使用成套试剂盒的说明书。
[0028] 此外，本发明提供了用于在动物中诱导免疫应答的手段，其借助对动物施用一种 包含如下所详述核酸构建体或腺病毒载体的疫苗进行。
【附图说明】
[0029] 图1 :在腺病毒载体中插入的不意图。
[0030] 图2 :CD8+和⑶4 +T细胞对编码表位腺病毒的应答。
[0031] 图3 :在Fi杂种小鼠中⑶8 +和⑶4 +T细胞对编码表位腺病毒的应答。
[0032] 图4 :Ad-IiGP发挥与CD4+T细胞无关的CD8+T细胞刺激作用。
[0033] 图5 :Ad-IiGP赋予快速和上佳的保护，防止致命性LCMV感染。
[0034] 图6 :Ad_IiGP有效地保护，防止高剂量、静脉内LCMV感染。
[0035] 图7 :对具有优势免疫表位中突变的致命性LCMV变体，Ad-IiGP赋予上佳保护。
[0036] 图8 :在Ad-IiGP接种和用带有优势免疫表位中突变的LCMV变体攻击之后，⑶8+ 或CD4+T细胞对特异性LCMV表位反应的频率。
[0037] 图9 :CD8+和CD4 +T细胞对用裸DNA-IiGP和DNA-GP接种的应答。
[0038] 图10 :用Ad-Ii-GP预防性接种增加肿瘤的排斥。
[0039] 图11 :用Ad-Ii-GP治疗性接种在携带肿瘤小鼠中增加平均寿命。
[0040] 图12 :用Ad-Ii-VSVGP或Ad-VSVGP接种后的存活率。
[0041] 图13 :CD8+和⑶4 +T细胞对更多编码表位腺病毒的应答。
[0042] 图14 :用⑶8+T细胞对编码表位腺病毒的应答测量Ad-Ii-GP构建体相比于 Ad-GP-Lamp-1构建体的有效性。
[0043] 图15 :基于框内多聚接头（polylinker)的载体。
[0044] 图16 :具有IRES2位点的载体。
[0045] 发明的详述
[0046] 定义：
[0047] 腺病毒：一组含有双链DNA的病毒。腺病毒可进行遗传上修饰，使得它们成为无能 力的复制体或者有条件的无能力复制体。在这种形式中，作为腺病毒构建体或腺病毒载体 (adenovector)，它们可被用作基因传输媒介物，用于接种或基因疗法。
[0048] 佐剂：任意物质，它与被施用的免疫原性决定子/抗原/核酸构建体的混合物增加 或以其他方式修饰对所述决定子的免疫应答。
[0049] 氨基酸：任意的、合成或天然的氨基羧酸，包括在肽和多肽（包括体内合成的蛋白 质和酶）中存在的任意氨基酸，因此包括修饰的氨基酸。术语氨基酸在这里是与术语"氨基 酸残基"同义地使用，"氨基酸残基"的含义预期包括规定的氨基酸，该氨基酸已与至少一个 其他种类，诸如2,例如3,诸如多于3个的其他种类发生了反应。通用术语氨基酸既包括天 然的也包括非天然的氨基酸，其任一个可以是"D"或"L"异构体的形式。
[0050] 抗体：免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的活性部分。抗体是例如完整的免疫球 蛋白分子或其保留免疫原活性的片段。
[0051] 抗原：任何的能结合至克隆分布免疫受体（T细胞或B细胞受体）的物质。通常为 肽、多肽或多聚多肽（multimeric polypeptide)。抗原优选地能引起免疫应答。
[0052] 加强：用追加注射或用药以增强是指规定在初次用药之后的一段时间给予额外剂 量的免疫剂例如疫苗，以便持续早期相同药剂用药所引起的免疫应答。
[0053] 载运体（Carrier):与抗原偶合以有助于诱导免疫应答的实体或化合物。
[0054] 嵌合蛋白：一种遗传工程蛋白，它是由两种或以上完整的或部分的基因或者一系 列（非）随机的核酸剪接在一起制造的核苷酸序列所编码的。
[0055] 补体：一种复合系列的血蛋白，其作用"互补（complement) "抗体的工作。补体破 坏细菌，产生炎症，而且调节免疫反应。
[0056] 细胞因子：生长或分化调节剂，这里是非限定性使用，并且不应当用于限制本发明 及权利要求的解释。除了细胞因子，粘附或附属分子，或者它们的任意组合物，可以单独地 利用或与细胞因子组合使用。
[0057] CTL :细胞毒性T淋巴细胞。一个亚组的T细胞，其与T细胞受体一起表达⑶8,因 而能够对I类分子呈递的抗原应答。
[0058] 传输媒介物：一种实体，藉此核苷酸序列或多肽或两者可被从至少一种介质转运 至另一种。
[0059] 片段：用于表示非全长部分的核酸或多肽。因此，片段本身也分别是核酸或多肽。
[0060]个体：任意物种或亚种的鸟、哺乳动物、鱼、两栖动物或爬行动物。
[0061]恒定链：一种整合的膜蛋白糖蛋白，其缔合于和稳定内质网及随后细胞室的MHC II分子。这里的术语恒定链涵盖了所有天然的或人工产生的全长或者片段化同源基因以及 一定程度近似于人恒定链的蛋白质。这里，恒定链简化为Ii。
[0062] 分呙出的（Isolated):与此处所公开的核酸、多肽和抗体联合使用的"分呙出的" 是指这些已被鉴别和从它们天然的（主要是细胞的）环境分开和/或回收。本发明的核 酸、多肽和抗体优选地是分离出的，而且，本发明的疫苗和其他组合物优选地包含分离出的 核酸、多肽或者分离出的抗体。
[0063] MHC :主要组织相容性复合体，存在MHC的两个主要亚类，I类和II类。
[0064]核酸：传达遗传信息的核苷酸链或序列。就本发明而言，核酸是脱氧核糖核酸(DNA)〇
[0065]核酸构建体：一种遗传工程核酸。一般地包含几种元件，例如基因或其片段、启动 子、增强子、终止子、聚A尾、接头、多聚接头、操作接头（operative linker)、多克隆位点 (MCL)、标记、终止密码子，其他的调节元件、内部核糖体进入位点（IRES)或其他。
[0066]操作接头：一种核苷酸或氨基酸残基序列，其将两部分核酸构建体或（嵌合）多肽 结合在一起，可以保证核酸或多肽的生物学加工。
[0067] 病原体：一种特异性疾病致因剂，尤其是生物剂，例如病毒、细菌、朊病毒或能引起 它的宿主生病的寄生物，也被称为传染剂。
[0068]肽：多种共价连接的氨基酸残基所限定的序列并且以酰胺键连接。该术语与寡肽 和多肽近似地使用。天然和/或非天然氨基酸可以肽键或者以非肽键相连。术语肽还包括 翻译后的修饰，通过化学的或酶催化的反应而引入，如本领域已知的。该术语可以指多肽的 变异体或片段。
[0069]药物载运体：也被称作赋形剂或稳定剂，对细胞或者个体是无毒性的，当以所用剂 量和浓度使细胞或个体暴露于它们时。通常，生理学上可接受的载运体是含水的pH缓冲溶 液。生理学上可接受载运体的实例包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐，以及其他的有机酸类； 抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量（少于约10个残基）的多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、 明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、 天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖及其他的碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精； 螯合剂，诸如H)TA ;糖醇，诸如甘露醇或山梨醇；成盐的抗衡离子，诸如钠离子；和/或非离 子表面活性剂，诸如TWEEN?、聚乙二醇（PEG)和PLUR0NICS?。
[0070]多个（Plurality):至少两个。
[0071 ]启动子：在DNA链的结合位点，在此RNA聚合酶结合从而起始信使RNA和一个或多 个的邻近结构基因的转录。
[0072] 信号肽：一种短序列的氨基酸，其决定细胞中蛋白质的最终定位，也被称为分选 肽。
[0073] siRNA :小干扰RNA(siRNA)，其靶向于（以序列特异性的方式）内源性RNA，用于降 解，藉此减少基因产物的量。
[0074]表面活性剂：表面的活性剂，其能够降低液体的表面张力，当它溶解在液体中时。 表面活性剂是一种包含亲水性极性基团和疏水性非极性基团的化合物，而且通常由脂肪链 组成。
[0075] 疫苗：一种物质或组合物，其能够在动物中诱导免疫应答。在本发明的正文中，也 被称作免疫原性组合物。免疫应答是一种在生物体内诱导记忆的免疫应答（体液的/抗体 和/或细胞的），产生传染剂，是由继发性而非初始性应答应付的，因此降低了对宿主生物 体的影响。本发明的疫苗可以规定为或者预防性的和/或治疗性药物。该组合物可以包 含一种或多种的下列物质：抗原、包含一个或多个在操作上被连接至Ii的抗原的核酸构建 体、载运体、佐剂以及药物载运体。
[0076] 变体：一种已知的参照核酸或多肽的变体，是指这样的核酸或多肽--其表现一 定程度的相对于所述参照核酸或多肽的序列同源性/同一性，但是与所述参照核酸或多肽 不相同。
[0077] 本发明涉及一种疫苗，其包含一种核酸构建体诸如DNA构建体，特别是包含编码 在操作上被连接至抗原性蛋白或者编码肽的序列的恒定链的序列的核酸构建体。该疫苗刺 激免疫应答，特别是以MHC-I依赖型、而⑶4 +T细胞独立型方式的免疫应答。
[0078] 核酸构律体
[0079] -方面，本发明涉及核酸构建体，其包含编码至少一个恒定链的序列，该恒定链在 操作上被连接至至少一个抗原性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的抗原性片段，简言之，一 种抗原。
[0080] 核酸构建体可理解为一种遗传工程核酸。该核酸构建体可以是一种非复制的而且 线性的核酸、一种循环表达的载体、一种自主复制质粒或病毒表达载体。核酸构建体可包含 几种元件，例如但不限于基因或其片段、启动子、增强子、终止子、聚-A尾、接头、聚多接头、 操作接头、多克隆位点（MCS)、标记、终止密码子、内部核糖体进入位点（IRES)以及宿主同 源性整合序列或者其他的已定义元件。工程核酸构建体的方法是本领域内熟知的（参见， 例如，《分子克隆：实验室手册》（Molecular Cloning:ALaboratory Manual), Sambrook 等， 编辑，Cold Spring Harbor Laboratory,第 2 版，冷泉港，纽约，1989 年）。
[0081] 在图1、15和16,以