专利名称：对虾白斑综合症病毒快速检测试剂盒的制备和检测方法
技术领域：
本发明涉及一种利用环介导等温扩增(LAMP)技术进行菌样检测的方 法，具体是 一种对虾白斑综合症病毒快速检测试剂盒的制备和检测方法。
技术背景对虫下白斑综合症病毒(white spot syndrome virus)是新设立的 Nimaviridae科Whispovirus属的代表种。对虫下白斑综合症病毒WSSV最早 出现在上世纪90年代初，是一种具有高度感染性和致死性的病毒，严重危 害着全球对虫下养殖业并造成了巨大的经济损失，仅我国自1993年爆发以来 已累计损失数百亿元，成为海水养殖业危害最大的病毒。WSSV的肆虐立刻 引起了许多国家和地区(中国、美国、曰本、台湾地区、荷兰、印度、韩 国、新加坡等)的高度重视，但由于缺乏对病毒遗传信息和功能特性的了 解，影响了病毒的防治研究。以往检测对虫下白斑综合症病毒的主要方法有两种l.症状观察法，观 察发病的对虾行动迟钝，弹跳无力，静卧不动或游动异常(围着池边在水面 兜圈或在水中翻滚，)这种异常行为可在几小时内重复出现，直到最后无力 活动，腹面朝上慢慢沉到水底，或被其他对虾吃掉。而患病的斑节对虾在 濒临死亡时则显示出明显变蓝的现象，并多伴有腹部肌肉混浊。 一些幸存 的对虫下可缓慢恢复正常。个别虾可在甲壳、鳃部的表皮下出现大量黑色素 斑点。2.病理确认法。该病毒侵害的主要组织和器官是皮下组织、表皮角 质层组织，触角腺、造血组织。病毒寄生在对虾大部分的器官，从而导致 全身系统性的坏死；进行血相检查，发现血淋巴细胞减少，血淋巴混浊， 淋巴样器官和肝胰脏肿大。血淋巴液凝固时间超过3分钟。濒死虾壳变软， 血淋巴液发黄，不易凝固。病毒粒子可在细胞质中继续装配。最后细胞解 体，病毒粒子再感染周围细胞。在腹部肌肉纤维之间有时也发现病毒粒子， 有的病郞在鳃和触角腺中可看到血细胞变性坏死，包围成结状构造，其大 小约为20 - 50Mm;淋巴样器官有血细胞浸润。在显微镜下可见，病虾甲壳 内面有直径数毫米的白点，呈重瓣的花朵状，外围较透明，花紋较清楚， 中部木透明，花紋着木清。白点在头胸甲上特别清楚，肉眼可见。白点在 酸中容易溶解。3.聚合酶链式反应法(PCR法)，该方法较前两种方法快速、 灵敏，但需要昂贵的PCR仪并电泳观察结果，或者使用荧光PCR仪检测， 检测时间长和成本高。2004年TomoyaKono报导了使用LAMP技术检测WSSV的技术(Tomoya Kono， Ram Savan, Masahiro Sakai, Toshiaki Ttami.Dtection of white spot syndrome virus in shrimp by loop-medicated isothermal amplification. Journalof Virological Methods. 2004,115,59-65.),但是检测WSSV病毒的亚型比较 少，并且没有进一步防止污染的措施。 发明内容本发明的目的是提供 一种对虾白斑综合症病毒的快速检测试剂盒的制 备和检测方法。为实现上述目的，本发明釆用的技术方案为 试剂盒l-2mL环介导等温扩增反应液A、 0. 5-1. 5U/ju L UNG酶、6-10 U/ juL Bst DNA聚合酶B和1-3juL显色剂C;显色剂C体积浓度为5%-20°/。；其中，每升环介导等温扩增反应液A含l-2 mL lOxThermopol反应缓 300 - 500jumo1 dNTP、 2-4mmol硫酸镁、0. 8 - 1. 2 ji mol上游内引物、0.8 -1. 2 jumol下游内引物、0. 2 - 0. 3 jumol上游外引物、0. 2 - 0. 3 jumol下游 外引物和1-1.5 mol甜菜碱；上游内引物5-ACCACCTTTGGCGCACCAATCGTGCACGTACATGTCGA-3、下游内引物5—ACCACACACAAAGGTGCCAACTCTTTGTCGGTAGCTCCAACA—3、上游外引物5-GGTCTCAGTGCCAGAGTAGG-3、下i^外弓l物5-TGGTGCCAAAGATTAACCCA-3。所述 dNTP 内的四种脱氧核糖核酸的质量比为 dUTP: dATP: dGTP: dCTP=l: 1: 1: 1到2: 1: 1: 1。所述每升10 x The函pol反应 缓冲液含100-300mmol pH8. 8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、80-120mmo1 氯化钾、80-120mmol硫酸铵、10-30 mmol硫酸镁和0. 8-1. 5%曲拉通X-100;所述显色剂为荧光染料SYBR GREEN I或DNAGreen。检测方法1) 待检样品DNA模板的提取取200 mg待检样品加入到500-800 |iL 蒸馏水中调制句浆后，再加入1.0-1.5 mL灭菌双蒸水混匀，而后一并加 入到100 - 150 m L灭菌双蒸水中混匀，并于IO(TC沸水浴中加热10 - 15 min， 待水洛后将其以10000-12000转/分离心5-10 min,取上清即为待检样品 模板DNA,待用2) 对虫下白斑综合症病毒的环介导等温扩增在21-23nL环介导等温扩增反应液A的反应管中加入1-2jliL待检样 品模板DNA和，0. 5-1. 5 U/jaL UNG酶，于恒温95 。C放置3-5min，而后 置于冰上1-3min;待冷却后加入、6-1Q U/|a L Bst DNA聚合酶B,于60 -65。C恒温放置45 - 90 min;而后再将温度调到80 - 95 °C中止反应，3-5 min后待用；3) 显色检测在反应液中加入1-3^L显色剂C，观察颜色变化； 每升环介导等温扩增反应液A含10 x Thermopol反应缓冲液、300 - 500iamoldNTP、 2-4 mmol硫酸镁、0.8-1.2/a mol上游内引物、0. 8 - 1. 2 n mol下游内引物、0. 2 - 0. 3m'ho1上游外引物、0. 2 - 0. 3 |a mol下游外引物 和1 - 1. 5 mol甜菜碱；上游内引物5-ACCACCTTTGGCGCACCAATCGTGCACGTACATGTCGA-3、 下游内引物5-ACCACACACAAAGGTGCCAACTCTTTGTCGGTAGCTCCAACA-3、 上i^外引物5-GGTCTCAGTGCCAGAGTAGG-3、 下游外引物5-TGGTGCCAAAGATTAACCCA-3。所述 dNTP 内的四种脱氧核糖核酸的质量比为 dUTP: dATP: dGTP: dCTP=l: 1: 1: 1到2: 1: 1: 1。所述每升10 x The函pol反应 缓冲液含100-300mmo1 pH8. 8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、80-120mmol 氯化钾、80-120mmo1硫酸铵、10-30 mmol硫酸镁和0. 8-1. 5%曲拉通X-100;所述显色剂为10%的荧光染料SYBR GREEN I或DNAGreen。所述步骤 3)观察颜色变化若颜色为黄色，说明待检样品不含或者不是对虾白斑综合 症病毒，若颜色变为绿色，则说明待检样品含有或者为对虾白斑综合症病 毒。本发明的主要原理为(1)特殊设计一组可以识别靶DNA六个不同序 列的两个内引物(上游内引物和下游内引物)和两个外引物(上游外引物 和下游外引物)，内引物包含靶DNA的正义链和反义链；(2)其中一个内引 物首先和靶DNA杂交，随后的链置换薩A合成在具有高度链置换活性的DNA 聚合酶的参与下由一个外引物启动，释放出单链DNA,并作为由杂交到靶的 另一端的一个内引物和一个外引物启动的DNA合成模板，产生一个原始的 茎环DNA; (3)内引物以原始茎环DNA做模板，启动链置换DNA的合成，产 生一个原始的茎环DNA和一个新的由两倍茎长度的茎环薩A; ( 4 )在等温条 件下，内引物以茎环DNA为模板，通过链置换形成多个含有靶DNA反复重 复序列的茎环DNA，在一小时内该循环反应可使靶DNA累积到10'拷贝，可 通过荧光染料来观察扩增结果。本发明所具有的优点本发明建立了对虾白斑综合症病毒的环介导等温扩增检测试剂盒及检 测方法，试剂盒根据对虫下白斑综合症病毒的VP28基因的基本保守区的六个 序列设计了两个特异性内引物和两个特异性外引物，该保守的基因序列为 对虫下白斑综合症病毒各不同血清型和菌株型所共有，以保证从种的水平上 检测不同来源的对虫下白斑综合症病毒株的可靠性。本发明釆用环介导等温 扩增(LAMP)技术，该技术特异性强，与PCR检测方法有相同的高灵敏度， 但不需要昂贵的PCR仪，只需普通的水洛锅即可，且结果不必用凝胶电泳 方法来观察，使用荧光染料来观察即可，简单而快速。可用于对虾白斑综 合症病毒的检测，特别适用于基层养殖场现场应用，使用范围广、检测结 果可靠。
具体实施方式
下列实施例进一步说明本发明，但不应当作对本发明的限制。 实施例1试剂盒1)环介导等温扩增反应液A ( LAMP反应液A):含有2.5|uL lOxThermopol反应缓冲液、1. OjuL 10 mmol/L dNTP、 1. 0|iL 20|amol/L上游内引物(FIP)、 1. 0 |i L 20 ju mol/L下游内引物(BIP)、 0. 25 |iL 20|amol/L上游外引物(F3 )、 0. 25 ju L 20 n mol/L下游外引物(B3 )、 0. 5|aL 100 mmol/L MgS04、 12.5juL 2 mol/L甜菜碱和4 ju L ddH20 (灭菌双蒸水)。上游内引物5-ACCACCTTTGGCGCACCAATCGTGCACGTACATGTCGA-3、下游内引物5-ACCACACACAAAGGTGCCAACTCTTTGTCGGTAGCTCCAACA-3、上游外引物5-GGTCTCAGTGCCAGAGTAGG-3、下游外引物5-TGGTGCCAAAGATTAACCCA-3 (参见序列表)。其中dNTP内的四种脱氧核糖核酸的混合物的质量比为dUTP: dATP: dGTP: dCTP=2: 1: 1: 1。2 ) 1U/ ju L UNG酶(购自New England Biolabs )、 8U/ ju L Bst DNA聚合酶B (购自New England Bi。labs )禾口 1 |i L显色剂C;所述10 x Thermopol反应缓冲液为200 i腦l /L pH8. 8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100 mmol/L氯化钾、100 mmol/L硫酸铵、20 mmol/L硫酸镁和1。/。曲拉通X-100，显色剂C为10。/。的荧光染料SYBR GREEN I (天根生物有限公司)。 检测方法1) 待检样品DNA模板的提取取200 mg待检样品加入到500|iL蒸馏 水中调制匀浆后，置于1.5mL离心管中，再加入1.0-1.5 raL灭菌双蒸水 混句，而后一并加入到100nL灭菌双蒸水中混匀，并于10(TC沸水浴中加 热lOmin,待水浴后将其以10000转/分离心10 min，取上清即为待检样 品模板DNA，待用2) 对虫下白斑综合症病毒的环介导等温扩增在23 n L环介导等温扩增反应液A中加入1 ju L待检样品DNA模板和0. 5 U/]uL的UNG酶，置于95。C下恒温放置5 min，而后置于冰上1 min;待冷 却后加入加入8 U/|iL Bst DNA聚合酶B，于65。C恒温放置60min;而后 再将温度调到8(TC中止反应，3min后待用；3) 显色检测在反应液中加入l|aL10% (体积浓度)的荧光染料SYBR GREEN I,直接用肉眼观察颜色变化，如果颜色为黄色，说明待检样品不含 或者不是对虾白斑综合症病毒，如果颜色变为绿色，则说明待检样品含有或者为对虾白斑综合症病毒。其中，LAMP反应液A:含有2. 5pL 10 x Thermopol反应缓冲液、1.0 HL 10 mmol/L dNTP、 l.OjuL 20 p mol/L上游内引物(FIP )、 l.OjuL 20 jamol/L下游内引物(BIP)、 0.25 |iL 20|imol/L上游外引物(F3)、 0.25 juL 20 jLimol/L下游外引物(B3)、 0, 5 juL 100 mmol/L MgS04、 12. 5 juL 2 mol/L 甜菜碱和 4 ju L ddH20 (灭菌双蒸水)。上游内引物 5-ACCACCTTTGGCGCACCAATCGTGCACGTACATGTCGA-3 、 下游内引物5-ACCACACACAAAGGTGCCAACTCTTTGTCGGTAGCTCCAACA-3 、 上游外引物 5-GGTCTCAGTGCCAGAGTAGG-3、下游外引物5-TGGTGCCAAAGATTAACCCA-3 (参 见序列表)。dNTP内的四种脱氧核糖核酸的混合物的质量比为 dUTP: dATP: dGTP: dCTP=2: 1: 1: 1。所述每升10 x Thermopol反应缓冲液为200 mmol /L pH8. 8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100 mmol/L氯化钾、100 隱ol/L硫酸铵、20隱ol/L硫酸镁和1%曲拉通X-100, 实施例2与实施例l不同之处在于试剂盒lmLLAMP反应液A、 1.5U/|iLUNG 酶(购自New England Biolabs )、 6 U/ |U L Bst DNA聚合酶B (购自New England Biolabs)和l)iL体积浓度为5。/。的荧光染料DNAGreen(购自于天根生物有限 公司)；其中，每升环介导等温扩增反应液A含lmL 10 x Thermopol反应缓300 jumoldNTP、 2mmol硫酸镁、0. 8 ju mol上游内引物、0. 8 |a mol下游内引物、0. 2|amol上游外引物、0.2,1下游外引物和lmol甜菜碱和4 ju L ddH20 (灭菌双蒸水)；所述dNTP内的四种脱氧核糖核酸的混合物的质量比为dUTP: dATP: dGTP: dCTP:l. 5: 1: 1: 1;所述每升10 x Thermopol反应缓冲液含 lOO隨ol pH8. 8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、80mmol氯化钾、80mmol硫 酸铵、10 mmol硫酸镁和0. 8 %曲拉通X - 100。检测方法1 )待检样品DNA模板的提取取200 mg待检样品加入到 800|aL蒸馏水中调制勻浆后，置于1. 5mL离心管中，再加入1. 0 - 1. 5 mL 灭菌双蒸水混匀，而后一并加入到150nL灭菌双蒸水中混匀，并于10(TC 沸水洛中加热10min，待水浴后将其以10000转/分离心10min，取上清即 为待检样品模板DNA,待用2)对虾白斑综合症病毒的环介导等温扩增在23 juL环介导等温扩增反应液A中加入luL待检样品DNA模板和1. 5U/|iL的UNG酶，置于95。C下恒温放置5min,而后置于冰上3min;待 冷却后加入加入6 U/juL Bst DNA聚合酶B，于65'C恒温放置45min;而 后再将温度调到80'C中止反应，3min后待用；3)显色检测在待检的每个反应管中加入ljaL体积浓度为5%的荧光 染料讓AGreen的显色剂C,直接用肉眼观察颜色变化，如果颜色为黄色， 说明待检样品不含或者不是对虾白斑综合症病毒，如果颜色变为绿色，则 说明待检样品含有或者为对虾白斑综合症病毒。实施例3与实施例l不同之处在于试剂盒2 mL环介导等温扩增反应液A、 1.5U/juL UNG酶、10 U/jiL Bst DNA聚合酶B和3 |a L体积浓度20%显色剂c;其中，每升环介导等温扩增反应液A含2 mL 10 x Thermopol反应缓500 iamoldNTP、 4mmol硫酸镁、1. 2 m mol上游内引物、1. 2 |a mol下游内引物、0. 3nmo1上游外引物、0. 3jumo1下游外引物和1. 5 mol甜菜碱；所述的dNTP 内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP: dATP: dGTP: dCTP= 2:1:1:1。所述 每升lOxThermopol反应缓冲液为300mmol pH8. 8的三羟基甲基氨基甲烷 -盐酸、120mmol氯化钾、120mmol硫酸铵、30 mmol硫酸镁和1. 5 %曲拉 通X- 100。
检测方法l)待检样品DNA模板的提取取200 mg待检样品加入到600 juL蒸馏水中调制匀浆后，再加入l. 0-1.5 mL灭菌双蒸水混匀，而后一并 加入到150ML灭菌双蒸水中混匀，并于IO(TC沸水洛中加热12min，待水 洛后将其以11000转/分离心8min，取上清即为待检样品模板DNA,待用
2) 对虾白斑综合症病毒的环介导等温扩增在22 nL环介导等温扩增 反应液A中加入1. 5 |i L待检样品DNA模板和1. 5U/ p L的UNG酶，置于95 。C下恒温放置4min，而后置于冰上2min;待冷却后加入10U/ ja L Bst DNA聚 合酶B，于62。C恒温放置60min;而后再将温度调到90°C中止反应，4 min 后待用；
3) 显色检测在反应液中加入3juL体积浓度20y。显色剂C，观察颜色变 实施例4
与实施例l不同之处在于试剂盒1. 5 mL环介导等温扩增反应液A、 lU/juLUNG酶、9U/juLBstDNA聚合酶B和2 y L体积浓度为15%显色剂C;
其中，每升环介导等温扩增反应液A含1. 5mL lOxThermopol反应缓 400 iamoldNTP、 3mmo1硫酸镁、ljamol上游内引物、1 p mol下游内引物、 0. 25jLitno1上游外引物、0. 25jLimo1下游外引物和1. 2mo1甜菜碱；
所述的dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP: dATP: dGTP: dCTP= 2:1:1:1。所述每升10 x Thermopol反应缓冲液为200mmol pH8. 8的三羟基 甲基氨基甲烷-盐酸、100mmol氯化钾、lOOmmol硫酸铵、20 mmol硫酸镁 和1%曲拉通X - 100。
检测方法1 )待检样品DNA模板的提取取200 mg待检样品加入 到700)iL蒸馏水中调制匀浆后，再加入l. 0-1. 5 mL灭菌双蒸水混匀，而 后一并加入到130laL灭菌双蒸水中混匀，并于10(TC沸水洛中加热13min， 待水洛后将其以10000转/分离心7min,取上清即为待检样品模板DNA， 待用
2 )对虫下白斑综合症病毒的环介导等温扩增在22 nL环介导等温扩增反 应液A中力口入2 )i L待检样品DNA模板和1U/ m l的UNG酶，置于95。C下恒 温放置3min，而后置于冰上2min;待冷却后加入9U/)aL Bst DNA聚合酶 B，于63。C恒温放置80min;而后再将温度调到85°C中止反应，4 min后待 用；
3)显色检测在反应液中加入2pL体积浓度为15y。显色剂C,观察颜色 变化。SEQUENCE LISTING 〈110>中闺科学院海洋研究所
〈120〉对卧CJ斑综合症病毒快速检测试剂盒的制备和检测方法
〈130〉
〈160〉 4
〈170〉 Patentln version 3. 1
〈210〉 1
〈211〉 38
〈212〉 DNA <213>人T.序列
〈220〉
〈221〉 prim—bind
〈222〉 (1). . (38) 〈223〉
〈400> 1
accacctttg gcgcaccaat cgt,gcacgt,a catgtcga 38
<210> 2
〈211> 42
〈212〉 腿
<213〉 人工序列
〈220〉
<221> prim—bind
<222〉 (1)..(42) 《223〉
〈400〉 2
accacacaca aaggtgccaa ctctttgtcg gtagctccaa ca 42
<210〉 3
〈211〉 20
〈212〉 DNA〈213> 人.T.序列 《220〉
〈221> prim—bind
〈222〉 (1). . (20) <223〉
<400> 3
ggtctcagtg ccagagtagg 加
〈210〉 4
〈211> 20
<212> DNA
〈213〉 人工序列
〈220〉
〈221〉 pi'im—bind
〈222〉 (1). . (20) <223〉
〈400〉 4
tggtgccaaa gattaaccca 20
权利要求
1.一种对虾白斑综合症病毒快速检测试剂盒，其特征在于1-2mL环介导等温扩增反应液A、0.5-1.5U/μL UNG酶、6-10U/μL BstDNA聚合酶B和1-3μL显色剂C；其中，每升环介导等温扩增反应液A含1-2mL 10×Thermopol反应缓300-500μmol dNTP、2-4mmol硫酸镁、0.8-1.2μmol上游内引物、0.8-1.2μmol下游内引物、0.2-0.3μmol上游外引物、0.2-0.3μmol下游外引物和1-1.5mol甜菜碱；上游内引物5-ACCACCTTTGGCGCACCAATCGTGCACGTACATGTCGA-3、下游内引物5-ACCACACACAAAGGTGCCAACTCTTTGTCGGTAGCTCCAACA-3、上游外引物5-GGTCTCAGTGCCAGAGTAGG-3、下游外引物5-TGGTGCCAAAGATTAACCCA-3。
2. 根据权利要求1所述的鳗弧菌快速检测试剂盒，其特征在于所述 dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP: dATP: dGTP: dCTP=l: 1: 1: 1到 2: 1: 1: 1。
3. 根据权利要求1所述的鳗弧菌快速检测试剂盒，其特征在于所述 每升lOxThe腦pol反应缓冲液含100-300mmol pH8. 8的三羟基甲基氨基 甲烷-盐酸、80-120mmol氯化钾、80-120mmol硫酸铵、10-30 mmol硫酸镁 和0. 8-1.5 %曲拉通X-100;所述显色剂为的荧光染料SYBR GREEN I或 DNAGreen。
4. 一种按权利要求1所述的对虾白斑综合症病毒快速检测试剂盒的检测 方法，其特征在于1) 待检样品DNA模板的提取取200 mg待检样品加入到500-800 |aL 蒸馏水中调制勻浆后，再加入1.0-1.5 mL灭菌双蒸水混匀，而后一并加 入到100 - 150 |i L灭菌双蒸水中混句，并于IO(TC沸水洛中加热10 - 15 rain, 待水浴后将其以10000-12000转/分离心5-10min,取上清即为待检样品 模板DNA，待用2) 对虫下白斑综合症病毒的环介导等温扩增在21-23 n L环介导等温扩增反应液A的反应管中加入1-2 (i L待检样 品模板DNA和，G. 5-1.5 U/iuL UNG酶，于恒温95 。C放置3-5min,而后 置于冰上1-3 mill;待冷却后加入、6-10 U/|a L Bst DNA聚合酶B，于60 -65。C恒温放置45 - 90 min;而后再将温度调到80 - 95°C中止反应，3-5 min后待用；3) 显色检测在反应液中加入l-3pL显色剂C，观察颜色变化； 每升环介导等温扩增反应液A含10 x Thermopol反应缓冲液、300 - 500拜ld證、2-4 mmol硫酸镁、0. 8 - 1. 2 n mol上游内引物、0. 8 - 1. 2 |a mol下游内引物、0.2-0. 3jumo1上游外引物、0.2-0. 3jumo1下游外引物和1 - 1. 5 mol甜菜碱；上游内引物5-ACCACCTTTGGCGCACCAATCGTGCACGTACATGTCGA-3、 下游内引物5-ACCACACACAAAGGTGCCAACTCTTTGTCGGTAGCTCCAACA-3、 上游外引物5-GGTCTCAGTGCCAGAGTAGG-3、 下游外引物5-TGGTGCCAAAGATTAACCCA-3。
5. 按权利要求4所述的鳗弧菌快速检测试剂盒的检测方法，其特征在 于所述dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为 dUTP: dATP: dGTP: dCTP=l: 1: 1: 1到2: 1: 1: 1。
6. 按权利要求4所述的鳗弧菌快速检测试剂盒的检测方法，其特征在 于所述每升lOxThermopol反应缓冲液含100_300mmol pH8. 8的三羟基 甲基氨基甲烷-盐酸、80-120腿o1氯化钾、80-120隱o1硫酸铵、10-30隱o1 硫酸镁和0. 8-1.5 %曲拉通X-100;所述显色剂为10%的荧光染料SYBR GREEN I或醒Green。
7. 根据权利要求4中所述的对虫下白斑综合症病毒快速检测试剂盒的检 测方法，其特征在于所述步骤3)观察颜色变化若颜色为黄色，说明待检 样品不含或者不是对虫下白斑综合症病毒，若颜色变为绿色，则说明待检样 品含有或者为对虫下白斑综合症病毒。
全文摘要
本发明涉及一种利用环介导等温扩增技术进行菌样检测的方法，具体是一种对虾白斑综合症病毒快速检测试剂盒的制备和检测方法。试剂盒包含1-2mL环介导等温扩增反应液A、0.5-1.5U/μL UNG酶、6-10U/μL BstDNA聚合酶B和1-3μL显色剂C；上游内引物5-ACCACCTTTGGCGCACCAATCGTGCACGTACATGTCGA-3、下游内引物5-ACCACACACAAAGGTGCCAACTCTTTGTCGGTAGCTCCAACA-3、上游外引物5-GGTCTCAGTGCCAGAGTAGG-3、下游外引物5-TGGTGCCAAAGATTAACCCA-3。本发明用于对虾白斑综合症病毒的检测，特别适用于基层养殖场现场应用，使用范围广、检测结果可靠。
文档编号G01N33/50GK101307364SQ200810015290
公开日2008年11月19日 申请日期2008年4月18日 优先权日2008年4月18日
发明者李富花, 相建海, 高宏伟 申请人:中国科学院海洋研究所