专利名称：海绵细胞内共生放线菌的分子检测方法
技术领域：
本发明涉及一种海绵细胞内共生放线菌的分子检测方法，针对海洋无脊椎动物海 绵细胞内共生放线菌进行原位基因水平上的鉴定。属于海洋分子生态学技术领域。
背景技术：
海绵具有独特的腔状结构，以滤食海水中的微生物为生，体内聚集了大量的共生 微生物，一般可以达到海绵体积的40%以上。许多证据表明，海绵来源的药用天然产物可能 是其共生微生物产生的，海绵共生微生物也因此成为了海洋药物研发的重点之一。对这些 微生物的多样性进行分析，鉴定出具有宿主特异性的微生物是开发利用海绵共附生微生物 资源的前提。早期人们主要通过纯培养的技术来分离、鉴定海绵中的微生物。尽管通过改进 培养条件、延长培养周期等于段可以获得一些新颖的微生物，但是海洋中的微生物的可培 养性不到1%，因此这种方法很大程度上不能满足人们了解海绵共生微生物多样性的要求。 以聚合酶链式反应(PCR)和核糖体RNA小亚基(16S/18S rRNA)基因序列分析为核心的现 代分子生态学技术可以绕开海洋微生物难培养的障碍，提供较为全面的多样性信息。目前 常用技术有变性梯度凝胶电泳(DGGE)、末端限制性长度多态性分析(T-RFLP)和克隆文库 技术。DGGE技术虽然可以快速的揭示海绵共生微生物的组成，但对于低丰度的类群敏感性 较低，且获得的种属信息相对少；T-RFLP技术可以较快的获取大量多样性信息，但是成本 高，结果分析较繁琐；克隆文库技术可以获取较为全面的种属信息，并且时间成本和资金成 本适中，且可以根据需求，克隆一些非核糖体RNA的管家基因，丰富多样性的结果。人们应 用这些分子生态学技术来研究海绵共生微生物多样性取得了很大的进展，但是很难通过得 到的多样性信息认识到海绵共生微生物的生态学功能。就多样性研究来说，人们常常忽视 了海绵细胞内的共生微生物。海绵细胞内的共生微生物可以直接与海绵宿主发生作用，对 于宿主的表型有非常大的影响。因此，研究海绵细胞内部微生物的组成，对于认识海绵共生 微生物的功能以及海绵共生微生物_海绵宿主的相互作用有着非常重大的意义。放线菌作为药用天然产物的重要来源，在海绵中广泛存在。许多分离自海绵的放 线菌都具有一定抗菌活性和酶活性；系统发育分析表明，在这类微生物中经常发现海绵特 异性类群。因此，海绵中的放线菌是一类非常重要的、有代表性的功能性共生微生物。但在 海绵共生微生物多样性研究中，放线菌却经常得不到足够的重视，在现代分子生态学研究 中，缺乏应用放线菌种属特异性引物的应用，人们很少得到较为全面、完整的海绵放线菌多 样性信息和分布特点。综上所述，海绵细胞内共生放线菌是一类十分重要却又缺乏足够研究的微生物类 群。研究海绵细胞内共生放线菌的多样性，探究海绵细胞内共附生放线菌的组成，发现海绵 胞内特异性的放线菌，不仪可以完整人们对于海绵共附生微生物多样性的认知，也更有利 于分析海绵共生放线菌的功能和分离培养这类具有很大生物技术潜力的微生物。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种海绵细胞内共生放线菌的分子 检测，能较为全面、准确的对海绵细胞内共生放线菌进行分子检测。
为实现这一目的，本发明将机械法与化学法相结合，获取海绵单细胞，按经典的酶 解法提取海绵细胞内共生微生物总DNA ；以提取的总DNA为模板，以放线菌种属特异性引物 S-C-Act-235-S-20/S-C-Act-878-A-19聚合酶链式反应扩增放线菌16S rRNA基因片段；将 扩增产物纯化后构建克隆文库，随机挑取阳性克隆进行测序至文库饱和，将测序结果上传 到RDP核糖体数据库中进行嵌合体检验和同源性搜索，确定最相近序列和分类地位，将测 序结果及其最相近序列导入ARB序列分析软件包中进行系统发育分析，完成海绵细胞内共 生放线菌的分子检测。本发明的方法具体包括如下步骤1、海绵组织解离与细胞分选在无菌条件下，将海绵组织于4°C以下解冻后切 成不超过0. 5cm3的小块，加到盛有人工海水的锥形瓶中，海绵组织与人工海水的体积比 为1 15-20，110印111，201以下振荡、洗涤401^11-601^11;将洗涤后的海绵小块于200目 的不锈钢细胞筛网上轻轻摩擦进行机械解离，同时用20-25倍于海绵体积的无钙镁人工 海水冲洗，冲洗液转入锥形瓶中110rpm，20°C以下振荡、解离40min-60min，得到海绵细胞 的粗悬液；粗悬液经300g，5min离心后收集沉淀，再用无钙镁人工海水洗涤三次，300g， 5min离心获得包含海绵细胞内内共生微生物的海绵细胞；所述无钙镁人工海水的组分为 31. 6gNaCl,0. 75g KCl, 1. Og Na2SO4, 2. 4g Tris-HCl，0. 02g NaHCO3, 7. 2g EDTA，IL 去离子 水，pH 7. 6。2、共生微生物总DNA提取对获得的海绵细胞采用TE溶液洗涤、离心，取压积 20-30 μ 1的细胞沉淀，采用酶解法破壁后用酚氯仿抽提法提取细胞内内共生微生物总 DNA。3、放线菌16S rRNA基因片段扩增以提取的DNA为模板，以 S-C-Act-235-S-20(5' -CGC GGC CTA TCA GCT TGT TG-3' )/S-C-Act-878-A-19(5‘ -CCG TAC TCC CCA GGC GGG G-3')为引物采用聚合酶链式反应扩增放线菌16S rRNA基因片段。4、克隆文库构建与统计学分析将扩增产物纯化后构建克隆文库，随机挑取阳性 克隆测序至文库饱和，将测序结果上传到RDP核糖体数据库中进行嵌合体检验和同源性搜 索，剔除嵌合体，确定最相近序列。5、海绵细胞内共生放线菌的系统发育分析把测序结果及其最相近序列导入ARB序 列分析软件包中，采用最大似然性法进行系统进化分析，确定不同放线菌的分类地位，并观察 聚类情况，揭示出海绵细胞内特异性的放线菌，完成海绵细胞内共生放线菌的分子检测。按照本发明的思路和方法，可以快速获取海绵细胞内内共生微生物，为海绵共生 微生物多样性与功能的研究提供新的视角。采用放线菌特异性引物，提高了放线菌检测的 敏感度，可以提供更加全面、准确的多样性信息。分析系统发育树中的分支和聚类情况，能 直观的确定特异分布于海绵细胞内的放线菌。
图1为本发明方法的技术路线流程图。
图2为本发明实施例中海绵共生放线菌的系统进化树。
具体实施例方式以下结合附图及实施例对本发明的技术方案作进一步描述。以下实施例不构成对 本发明的限定。本发明方法的流程如图1所示，首先进行海绵组织解离与细胞分选，获得海绵细 胞，提取细胞内内共生微生物总DNA，利用聚合酶链式反应扩增得到放线菌的16S rRNA基 因片段，通过构建克隆文库结合统计学与系统发育分析，揭示海绵细胞内共生放线菌的组 成，发现海绵细胞内特异性放线菌。具体实施步骤如下1、海绵组织解离与细胞分选 (1)以下操作都在无菌条件下进行。海绵组织(l_2g)于4°C解冻后切成不大于 0. 5cm3 的小块。加入盛有 15-20 倍体积人工海水(1. Ig CaCl2,10. 2gMgCl2 · 6H20，31. 6g NaCl，0. 75g KCl, 1. Og Na2SO4, 2. 4g Tris-HCl，0. 02g NaHCO3, IL 去离子水，pH 7.6)的锥形 瓶中，110印111，201温和振荡401^11-601^11。上清取出后12000g离心lOmin，收集沉淀，为海 绵体表及内腔表面的细胞外外共生微生物，记为样品W。(2)将上一步中洗涤后的海绵小块于200目的不锈钢细胞筛网上轻轻摩擦进行 机械解离，让海绵小块变成蓉状，同时用2025倍体积无钙镁人工海水(31. 6g NaCl,0. 75g KCl, 1. Og Na2SO4, 2. 4g Tris-HCl, 0. 02g NaHCO3, 7. 2g EDTA，IL 去离子水，pH 7.6)冲洗，转 入锥形瓶中110rpm，20°C振荡、解离40min-60min，得到海绵细胞的粗悬液。粗悬液经300g， 5min离心后分别收集沉淀和上清，并用无钙镁人工海水洗涤沉淀(重悬一300g, 5min —收 集沉淀和上清)三次。操作时注意轻缓，避免对海绵细胞产生损伤。300g离心获得的沉淀 为海绵细胞(记为样品B)，其中包含海绵细胞内内共生微生物。(3)合并(2)中的上清，12000g离心lOmin，获得的沉淀为存在于海绵中胶层中的 海绵细胞外内共生微生物(记为样品J)。样品W和样品J起到对照分析的作用。2.共生微生物总DNA提取(1)之前获取的B、J、W三种样品采用TE(pH8.0，10mM Tris(三羟甲基氨基甲 烷)和ImM EDTA (乙二胺四乙酸二钠))溶液反复的悬浮、高速离心(12000g，5min)。取 20 μ 1-30 μ 1的细胞沉淀作为提取DNA的起始样品。(2)加入 450 μ 1 溶菌酶混勻(10mg/ml)，37°C水浴 lh。再加入 45 μ 1 10% 的 SDS 及5μ 1 10mg/ml的蛋白酶K混勻，55°C水浴30min至溶液清亮。13000g离心IOmin取上清， 加入等体积的Tris-饱和酚充分混勻处理。13000g离心lOmin，取上清用Tris-饱和酚重复 抽提一次。将上清加入等体积的Tris饱和酚氯仿异戊醇(ν ν ν, 25 24 1), 混勻。13000g离心5min取上清，加入等体积的氯仿异戊醇(24 1)混勻处理。13000g 离心5min取上清。(3)在⑵中得到的上清中加入O. 1倍体积的5mol/LNaCl，再加入1-1. 5倍体积 的异丙醇，轻轻混勻，14000g离心151^11，弃去异丙醇，加入50(^1 70%的乙醇洗涤沉淀。 13000g离心IOmin，弃去乙醇，风干，沉淀加入30 μ 1 ΤΕ，再加入不含DNA酶的RNase酶 5 μ 1，37°C水浴IOmin消解RNA。0. 8%的琼脂糖凝胶电泳，EB (溴化乙锭)染色分析检测。提取的基因组DNA位于20kb条带处，成明亮的单一条带。3.放线菌16S rRNA基因片段扩增(1)三种共生微生物总DNA分别作为模板，所用引物为针对放线菌16SrRNA基因 V3-V5 区的 S-C-Act-235-S-20 (5 ‘ -CGC GGC CTA TCA GCT TGT TG-3 ‘ )/ S-C-Act-878-A-19(5' -CCG TAC TCC CCA GGC GGG G-3')。扩增体系如下:5μ L IOxPCR 缓冲液(50mmol/LTris-HCl (ρΗ8· 2)，18mmol/LMgCl2, 500mmol/LKCl, 0. 1 % 甘油，1 % 的 TritonX-100)，正反向引物各 25pmol，1. 75 μ L lOmmol/LdNTP，20ng基因组DNA及 2. 5U Taq 酶，用无菌去离子水补充体积至50 μ L0(2)总DNA模板组成复杂，为此采用降落PCR的方法95 °C预变性5min， IOx (95 °C 30s, 72 °C 45s, -0. 5 °C 每循环，72 °C 45s) ； 15x(95°C 30s, 68 °C 45s, 72 °C 45s)； 72°C 5min。若产物浓度低，可适当调整循环数，在第三阶段时把循环数从15个增加到20-25 个。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，大小为640bp。4.克隆文库构建与统计学分析(1)将PCR产物经Cycle Pure Kit纯化后与pEasy-Tl载体连接。连接体系为 1 μ 1载体+4 μ 1纯化的PCR产物。25°C水浴lOmin。(2)转化大肠杆菌DH5 α，涂布在LB培养基(蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、 NaCl 10g/L)(含卡那霉素)平板上，平板在使用前预先用10μ 1 IPTG(200mg/ml，异丙 基-β -D-硫代半乳糖苷)和40 μ ΙΧ-gal (20mg/ml,5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷)涂布。 沸水浴煮沸15min，12000g离心2min后取上清进行PCR扩增确认是否是阳性克隆。扩增 所用引物是载体引物，序列如下T7(5' -TAATAC GAC TCACTATAG GG-3' ), M13(5' -CAG GAAACAGCTATGACC-3 ‘ )，50 μ 1 体系，力口入 2 μ 1 模板。(3)经鉴定的阳性克隆送交测序公司测序，测序引物为Τ7/Μ13。采用DOTUR软 件(http://www.mothur.org)对测序结果进行统计学分析，计算稀疏曲线(Rarefraction Curve)确定文库的饱和度。若文库饱和度不足80%，则继续送样测序。5.海绵细胞内共生放线菌的分子鉴定与系统发育分析(1)利用DOTUR软件对每个文库进行计算分类单元(OTU)的划分。差异度选择 2%。每个OTU选择1个代表性的克隆导入到RDP数据库(http://rdp. cme. msu. edu)中进 行嵌合体检验和同源性搜索。(2)去掉嵌合体后把代表性OTU及其最相近序列导入ARB序列分析软件包中 (http://www. arb-home. de)，采用最大似然性法进行系统进化分析。使用Fastdnaml算法， 进行100次重复取样，绘制系统进化树。通过比对不同文库间序列的聚类情况确定海绵细 胞内宿主特异性放线菌。采用本发明的技术路线对于我国南海Holoxea sp.海绵的细胞内共生放线菌进行 了研究，取得了很好的效果。图2是该海绵共生放线菌的系统发育树。标尺表明每100个 碱基中有10个存在差异。其中BAct代表根据样品B的总DNA构建的放线菌16S rRNA基 因克隆文库，类似的JAct、WAct分别代表根据样品J和样品W的总DNA构建的放线菌16S rRNA基因克隆文库。TAct是之前采用传统方法对海绵样品整体进行研究获得的海绵共生 放线菌序列，与JAct和WAct —起作为对照。序列名后的括号中的数值代表每个OTU中包 含的克隆数。虚框圈出的分支表示此类群只在海绵细胞内存在，具有空间特异性。从图2中可以看出海绵细胞内共生放线菌主要分布在棒杆菌亚目(Corynebacterineae)、微球菌亚目(Micrococcineae)和丙酸杆菌亚目(Propionibacterineae)中。可以看到在棒杆菌 亚目(Corynebacterineae)和丙酸杆菌亚目(Propionibacterineae)中部有特异性分布于 海绵细胞内的放线菌。对比细胞内共生放线菌与来自中胶层的放线菌，可以发现它们在进 化地位上较为疏远，在进化树中表现为BAct系列的克隆与JAct系列的克隆不出现紧密相 聚的情况。
权利要求
一种海绵细胞内共生放线菌的分子检测方法，其特征包括如下步骤1)在无菌条件下，将海绵组织于4℃以下解冻后切成不超过0.5cm3的小块，加到盛有人工海水的锥形瓶中，海绵组织与人工海水的体积比为1∶15-20，110rpm，20℃以下振荡、洗涤40min-60min；将洗涤后的海绵小块于200目的不锈钢细胞筛网上轻轻摩擦进行机械解离，同时用20-25倍于海绵体积的无钙镁人工海水冲洗，冲洗液转入锥形瓶中110rpm，20℃以下振荡、解离40min-60min，得到海绵细胞的粗悬液；粗悬液经300g，5min离心后收集沉淀，再用无钙镁人工海水洗涤三次，300g，5min离心获得包含海绵细胞内内共生微生物的海绵细胞；所述无钙镁人工海水的组分为31.6g NaCl，0.75g KCl，1.0g Na2SO4，2.4gTris-HCl，0.02g NaHCO3，7.2g EDTA，1L去离子水，pH 7.6；2)对获得的海绵细胞采用TE溶液洗涤、离心，取压积20-30μl的细胞沉淀，采用酶解法破壁后用酚氯仿抽提法提取细胞内内共生微生物总DNA；3)以提取的DNA为模板，以S-C-Act-235-S-20(5′-CGC GGC CTA TCAGCTTGTTG-3′)/S-C-Act-878-A-19(5′-CCG TAC TCC CCA GGC GGGG-3′)为引物采用聚合酶链式反应扩增放线菌16S rRNA基因片段；4)将扩增产物纯化后构建克隆文库，随机挑取阳性克隆测序至文库饱和，将测序结果上传到RDP核糖体数据库中进行嵌合体检验和同源性搜索，剔除嵌合体，确定最相近序列；5)把测序结果及其最相近序列导入ARB序列分析软件包中，采用最大似然性法进行系统进化分析，确定不同放线菌的分类地位，并观察聚类情况，揭示出海绵细胞内特异性的放线菌，完成海绵细胞内共生放线菌的分子检测。
全文摘要
本发明涉及一种海绵细胞内共生放线菌的分子检测方法，采用机械法与化学法相结合，获取海绵单细胞，提取海绵细胞内内共生微生物总DNA；以提取的总DNA为模板，以放线菌种属特异性引物用聚合酶链式反应扩增放线菌16SrRNA基因片段；将扩增产物纯化后构建克隆文库，随机挑取阳性克隆进行测序至文库饱和，将测序结果及其最相近序列导入ARB序列分析软件包中进行系统发育分析，完成海绵细胞内共生放线菌的分子检测。本发明建立了一套较为全面、准确的海绵细胞内共生放线菌的分子检测方法。
文档编号C12Q1/68GK101880713SQ20101018610
公开日2010年11月10日 申请日期2010年5月28日 优先权日2010年5月28日
发明者刘放, 周康, 张风丽, 李志勇 申请人:上海交通大学