专利名称：不结球白菜叶绿素降解代谢调控相关蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种叶绿素降解代谢调控相关蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及不结球白菜的叶绿素降解代谢调控相关蛋白及其编码基因与应用。
背景技术：
叶绿素是光合作用中捕获光的主要成分，在植物生长发育后期、叶片衰老或果实成熟时，叶绿素被大规模降解。叶绿素降解对叶片衰老过程中蛋白质氮的循环再利用具有重要意义(Hortensteiner S, Annu Rev Plant Biol, 57: 55-77，2006)；同时叶绿素降解是衰老叶肉细胞的一种解毒方式(Matile et al. Plant Physiology and Biochemistry, 27: 595-604， 1989; Matile et al. Plant Physiology, 112: 1403-1409， 1996)。最新的叶绿素降解途径为叶绿素首先脱去镁离子，生成脱镁叶绿素(Pheophytin)，然后脱镁叶绿素在 PPH (Pheophytin Pheophorbide Hydrolase) [Silvia Schelbert, et al. The Plant Cell, 21: 767 - 785，2009]，又称 CRNl (Co-regulated with NYE1) [Ren G, et al. Journal of Integrative Plant Biology, 52(5) :496-504, 2010]的作用下被脱去植醇形成脱镁叶绿酸(Phaeophorbide a, Pheide) 0脱镁叶绿酸是叶绿素降解中最后的绿色色素，它的卟啉大环在脱镁叶绿酸加氧酶(Pheophorbide a oxygenase, PaO)和红色叶绿素降解物还原酶(red chlorophyll catabolite reductase, RCCR)的作用下经过两步反应被氧化开环。由于卟啉环裂解与叶片色素(绿色)丧失有关，因此这一步是叶片衰老时叶色黄化的关键步骤。该氧化过程的中间产物是红色叶绿素代谢产物(RCC)，最终产物是原初荧光叶绿素降解产物(primer fluorescent Chl catabolite, pFCC)，它是有荧光的四吡咯线性分子。然后PFCC被运出叶绿体，其C (82)位被羟基化并运送入液泡。在液泡里因为 PH值偏酸性，修饰过的FCCs的D环和γ次甲基桥上发生非酶催化的异构，最后生成叶绿素最终代谢产物非荧光叶绿素代谢产物(non- fluorescent Chl catabolite, NCCs)。叶绿素降解途径中的许多酶都已经被发现。通过突变体(nyel-Ι)筛选和图位克隆，本实验室在国际上率先分离鉴定出了一个叶绿素降解代谢的关键调控基因AtNYEl (At4g22920, GenBank accession number :DQ437531) (Ren et al. Plant Physiol, 2007, 144: 1429-1441.)。拟南芥滞绿突变体 nyel-1，在黑暗处理6天后，还保持了 50%的叶绿素含量，与此同时处理的野生型植株仅含有不到10%的叶绿素，然而在nyel-Ι中光合作用和衰老相关的过程均未受到明显影响，因此滞绿突变体nyel-Ι属于滞绿突变体类型中的C型即非功能性的滞绿突变体。过量表达 AtNYEl可导致植株叶片黄化，甚至出现白化苗。AtNYEl受各种衰老信号诱导，编码一个新的叶绿体蛋白。NYEl在植物中高度保守，在其它植物物种也鉴定出了 AtNYEl的同源基因，这些基因的突变体植株在衰老时均具有叶片或子叶滞绿的特征，统称为衰老诱导的叶绿体滞绿相关蛋白基因(Senescence-inducible chloroplast stay-green protein, SGR)。如草地羊茅(Festuca pratensis) sid/Bf993 (Armstead et al. , New Phytologist , 172: 592-597，2006)，7jC稻(Oryza sativa)sgr (Jiang et al. Plant J，52:197—209·，2007; Park et al. Plant Cell, 19: 1649-1664，2007)，辣椒(Capsicum annuum)cl (Barry et al. , Plant Physiology，147: 179-187 2008)，豌豆(Pisum sativum)JI2775 (Armstead et al. , Science, 315: 73-73 2007),西红棉(Solanum lycopersicon) gf [ (Barry et al. , Plant Physiology，147: 179-187 2008)]等。不结球白菜(Brassica campestris L ssp. chinensis)原产中国，是我们南方人民十分喜爱的蔬菜，为人们提供每天健康所需的植物性蛋白、维生素、膳食纤维、可溶性糖及微量元素等营养物质，是不可多得的健康食物来源。由于不结球白菜的食用部分多为鲜嫩叶片，从植物体上采摘后极易失绿变黄，常常导致不结球白菜在采后运输、贮藏、货架销售过程中的可食用性生物量的损失。伴随着叶绿素的降解，叶片中的营养物质如维生素 C等也快速流失，同时亚硝酸铵等有毒物质含量也随之增加。延缓不结球白菜中叶绿素降解，使叶片保持更长久的绿色，对于延长不结球白菜货架期具有重要的意义。长期以来，不结球白菜新品种的培育基本上都是依靠传统育种方法。虽然许多性状已经得到长足改进，但其局限性也日益明显。遗传工程在改良不结球白菜性状方面已显示出了难以比拟的优越性。
发明内容
本发明的目的是提供一种不结球白菜叶绿素降解代谢调控相关蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的不结球白菜叶绿素降解代谢调控相关蛋白，是具有SEQ ID N0. 2 所示氨基酸残基序列的蛋白质。不结球白菜叶绿素降解代谢调控相关蛋白的编码基因，是下列核苷酸之一。1) SEQ ID NO. 1 所示的 DNA 序列。2)编码SEQ ID N0. 2所示氨基酸序列的多核苷酸。SEQ ID NO. 1由963个碱基组成，该基因的读码框为自5’端第12位至818位碱基；SEQ ID N0. 2由268个氨基酸残基组成。本发明还包括含有本发明基因的表达载体和细胞系。本发明还包括上述基因在不结球白菜滞绿研究中的应用，以及在植物叶绿素降解途径中中的应用。
图1为中间片断扩增产物凝胶电泳图谱。图2为3’端扩增产物凝胶电泳图谱。图3为5’端扩增产物凝胶电泳图谱。图4为基因全长凝胶电泳图谱。图5为不结球白菜叶绿素降解调控相关蛋白BcNYEl与其他植物叶绿素降解调控相关蛋白NYE同源性分析。
图6为不结球白菜叶绿素降解调控相关蛋白BcNYEl与其他植物叶绿素降解调控相关蛋白NYE亲缘关系进化树分析。图7为黑暗处理4天下野生型拟南芥和互补转基因植株离体叶片的表型。图8为正常生长45天的状态下野生型，滞绿突变体(/7_FW-7)，互补转基因植株的表型。
具体实施例方式实施例1、不结球白菜叶绿素降解代谢调控相关蛋白编码基因ifcMSY的获得。1.1 RNA 提取
取衰老的不结球白菜叶片材料约0. lg。液氮充分研磨后，转移到1. 5ml离心管，加1 mlTRIZj 1 # ( invitrogen 公司
)，混勻后，室温放置15分钟，加0. 2ml氯仿异戊醇(24:1)，剧烈摇动15秒后室温放置5 分钟，13000rpm，4°C离心15分钟。取上清液并加入等体积异丙醇，小心混勻，室温放置15 分钟，13000rpm，4°C离心15分钟。70%乙醇洗涤沉淀，室温干燥15分钟。溶解于适量的经 0. 1% DEPC处理过的CldH2O水中，贮存于-80°c备用。1. 2 cDNA第一链合成和反转录PCR
采用上海申能博彩生物技术公司(SHBC)的cDNA第一链合成试剂盒，按照操作指南将总RNA反转录成cDNA。反应体系和反应条件分别为2μ g制备的总RNA，0. 5μ 1 Rnase inhibitor，加 DEPC 处理过的去离子水至 8. 5 μ 1，2 μ 1 的 Oligo (dT) 18 primer. 65°C，5min,室温放置 lOmin，13000rpm 简短离心5s。再依次加入4μ1 5XFirst-Strand buffer,0.5 μ 1 RNase Inhibitor,2 μ 1 IOOmM DTT, 2μ 1 dNTP, 1 μ 1 MMLV Reverse Transcriptase ο小心混勻；37°C反转录1小时，90°C 5分钟；冰上冷却；13000rpm短暂离心5秒钟，存放于-20°C待用。1. 3 RT-PCR 扩增 BcNYEl 中间片断
根据以往在其他植物中克隆到的NYEl蛋白基因的保守序列，设计了两条同源兼并引物 BRASF (5， -GCAGCCGTTGA(C/T)GA (C/G)AAGAAGCATCC-3，)和 BRASR (5， -GGCC(A/T) CCGCT(A/T)ATGTG(A/G)CAATGAAC-3，)(SEQ ID NO. 3)作为 PCR 反应的引物。PCR 反应体系为50μ 1，反应条件为94°C预变性5min，94°C变性40s，63°C复性45s，72°C延伸45s，循环35次。72°C充分延伸lOmin。将所得的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离获得一段约 214bp的片断。回收并且通过TA克隆至TAKARA pMD_19_T载体后，由上海英骏公司测序，获 ^BcNYEI的中间序列。1. 4 BcNYEl全序列的获得
1.4. 1 BcNYEl的3’末端序列的扩增
BcNYEl的3’末端序列扩增使用Clontech公司的BD-SMARTTMRACE试剂盒。根据已经获得的保守序列设计了一个特异性引物进行PCR反应。BcNYE1 3，RACE F 5，-GGCGA ATGTC(C/G/T)CTTCA(C/T)GTTCATTG-3，
反应条件为95°C预变性5min后进行35个循环，每个循环为95°C变性30sec，55°C退火45sec，72°C延伸45sec，最后在72°C延伸IOmin。将所得的PCR产物经1 %电泳检测， 获得约的片段，割胶回收并克隆至克隆载体进行测序，获得ifcMSV的3’末端序列。
1. 5 5’ RACE法扩增召cMSY的末端序列
按照Takara 5，FULL-RACE (Code :D6122)方法自行合成以下5个引物 BcNYEl 5，末端 P 标记反转录引物5，- (P) CTGAGTCCCAGAGTA-3， (SEQ ID NO. 4)
1st PCR Al: 5' -GCAGTTGTTGTTTCCCACC-3‘ 1st PCR Si: 5，-TGCTTCTTGCAACTCAGGAT-3，(SEQ ID NO. 5) 2nd PCR A2: 5’ -GGTCCCATAGTCTTAGCAACG-3’ 2nd PCR S2: 5，-TTGCGAAGAGATCTAAAAGG AA-3，(SEQ ID NO. 6) 按照 Takara5，FULL-RACE (Code :D6122)方法，依次经过 cDNA 第一链的合成，Hybrid RNA的分解，连接反应(单链cDNA环化或形成首尾连接物)，以及两轮PCR反应，再经琼脂糖凝胶电泳分离获得50!3bp的PCR片断。最后经割胶回收，克隆至克隆载体，测序，最终获得 BcNYEl的5’末端序列。第一轮PCR反应条件94 °C预变性5min，94 °C变性40s，53 °C复性60s，72 °C延伸 60s，循环；35次。72°C充分延伸IOmin。第二轮PCR反应条件94°C预变性5min，94°C变性40s，55°C复性60s，72 °C延伸 60s，循环；35次。72°C充分延伸IOmin。根据已经获得的ifcMS73’和5’末端序列以及中间序列拼接获得了 BcNYEl的全长序列。实施例2 不结球白菜叶绿素降解调控相关蛋白功能分析。2. 1序列比较分析
用Genedoc软件分析了 BcNYEl与其他物种的同源性。分析结果表明BcNYEl与其他物种的NYEl蛋白具有极大的同源性。釙SGR (高粱，AAW82958)，ZmSGRl (玉米， ΝΡ_001105770), ZmSGR2 (玉米，NP_001105771)，OsSGR (水稻，EAZ09856)，HvSGR (大麦，MW^955), AtNYEl (拟南芥，NP_567673)，AtNYE2 (拟南芥，ABD77556)，LeSGRl (番茄，AAY98500), GmSGRl (大豆 AAW8^59)，PsSGR (豌豆，BAF76!352)。为了分析BcNYE 1同其他物种NYE蛋白的亲缘关系，使用MEGA软件建立了 BcNYEl同其他物种NYE蛋白的系统进化树。结果表明BcNYEl同AtNYEl的亲缘关系最近。进化树中各物种NYE蛋白的序列登录号分别为AtNYEl/At4gM920 (拟南芥 Arabidopsis, DQ437531);AtNYE2/At4gl1910(拟南芥，Arabidopsis, NM_117261. 5)； LeSGR/SlSGRl (番茄，iTomato, AY850152) ；GmSGRl (大豆，Soybean, AY850141) ； GmSGR2 (大豆，Soybean, AY850142) ； ZjSGRl (结缕草，Zoysia, AY850154. 1) ； HvSGRl (大麦，H. vulgare, AY850135. 1) ； OsSGRl (水稻，Rice, AY850134. 1) ； ZmSGRl (玉米，Maize, AY850138. 1) ； ZmSGR2 (玉米，Maize, AY850139. 1) ； SbSGRl (高粱， S. bicolor, AY850140. 1)。2. 2召cMSY基因功能分析
2. 2. 1互补拟南芥载体构建
利用引物AtNYElPF禾Π AtNYElPR扩增出拟南芥的启动子,并克隆至pMD19_T Vector(Takara)，测序无误之后。使用EcoRI和McI双酶切，回收纯化目的片断，并连接到经过同样两个酶酶切，纯化的PCHF3载体上。命名为Μ Λ^Υ- pCHF3利用引物BcNYEIF 和BcNYEIR 扩增出BcNYEl的cDNA，并克隆至pMD19_T Vector(Takara),测序无误之后。使用BamHI和Mil双酶切，回收纯化目的片断，并连接到经过同样两个酶酶切，纯化的VAtMEl- pCHF3载体上，获得互补载体，命名为 PA tNAP-BcNYEl -pCHF3。AtNYElPF 5' CTGGAATTCAAATCCCTACATA 3' AtNYElPR 5' CTCTGAGCTCTTGAAACCCA 3' (SEQ ID NO. 7) BCNYEIF 5' ATAGGATCCATGTGTAGTTTGTCGGCGA 3'
BcNYEIR 5' GCGTCGACTCAATAGAGTTTCTCTGGACTAGG 3' (SEQ ID NO. 8)。2. 2. 2农杆菌转化。2. 2. 2. 1 LBA4404农杆菌感受态细胞制备
1)在含利福霉素40yg/ml，链霉素100yg/ml的YEB固体培养基上划线，培养 48h-72h ；
2)挑单菌落到含利福霉素40μ g/ml，链霉素100yg/ml的YEB液体培养基中培养至 OD6tltl 0. 5 ；
3)冰上冷却菌液，5000rpm，4°C10分钟收集菌体；
4)ImM Hepes pH 7. O洗涤3次，再用10%甘油洗涤一次；
5)悬浮菌体于:3ml10%甘油中，分装到1.5ml离心管中，每管40 μ 1。2. 2. 2农杆菌转化
1)200ng质粒DNA，W 40 μ 1农杆菌感受态细胞混勻后按以下条件进行电转化； U 1. 8 KV
R 200 W C 25 uF
2)电击后添加800μ 1 SOC液体培养基，280C培养Ih ；
3)4000rpm, 10分钟收集菌体，悬浮于200 μ 1 SOC中，涂在含100 μ g/ml壮观霉素， 利福平40 μ g/ml,链霉素100 μ g/ml LB固体培养基上，倒置培养48h_72h。2. 2. 3农杆菌介导的拟南芥转化。2. 2. 3. 1拟南芥基质培养
基质组分蛭石黑土 珍珠岩9 3 0. 5 营养液组分
权利要求
1.一种不结球白菜叶绿素降解代谢调控相关蛋白BcNYEl，其特征在于为SEQ ID NO. 2 所示氨基酸残基序列的蛋白质。
2.不结球白菜叶绿素降解代谢调控相关蛋白BcNYEl编码基因，其特征在于其DNA序列为SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，或者为编码SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列的多核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于该基因的编码框为自5’端第12位到第 818位碱基的DNA序列。
4.含有如权利要求2或3所述不结球白菜叶绿素降解代谢调控相关蛋白BcNYEl的编码基因的表达载体。
5.含有如权利要求2或3所述不结球白菜叶绿素降解代谢调控相关蛋白BcNYEl的编码基因的细胞系。
6.如权利要求2或3所述不结球白菜叶绿素降解代谢调控相关蛋白的编码基因在植物滞绿性状改良中的应用。
全文摘要
本发明属于植物基因工程技术领域，具体公开一种不结球白菜叶绿素降解代谢调控相关蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的叶绿素降解代谢调控相关蛋白，来源于不结球白菜，品种“夏冬青”，蛋白名称为BcNYE1，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。不结球白菜叶绿素降解代谢调控相关蛋白BcNYE1的编码基因，其核苷酸序列为SEQIDNO:1所示，或者为编码SEQIDNO2氨基酸序列的多核苷酸序列。本发明的基因可用于不结球白菜叶绿素降解分子机制研究，并用于植物滞绿性状改良，包括延缓植物叶片叶绿素降解及叶片衰老。
文档编号C12N15/63GK102276709SQ20101051908
公开日2011年12月14日 申请日期2010年10月26日 优先权日2010年10月26日
发明者梁宁菁, 蒯本科, 邱凯, 魏强 申请人:复旦大学